清肺口服液黃酮類成分改善RSV感染小鼠肺上皮屏障損傷的機(jī)制研究

凌曉穎,孫遜,李維峰，袁斌

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是全球嬰幼兒、老年人和免疫功能低下人群病毒性肺炎最常見的病原體之一[1]。RSV在上呼吸道的上皮細(xì)胞中復(fù)制一段時(shí)間后,釋放的病毒顆粒轉(zhuǎn)移到下呼吸道的細(xì)支氣管或肺泡,引起鼻塞、咳嗽、喘息,病情嚴(yán)重會出現(xiàn)呼吸窘迫、氣道堵塞,甚至導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡[2]。目前防治RSV感染的方式有限,尚無安全有效的抗病毒藥物及批準(zhǔn)用于臨床的疫苗[3]。

肺泡上皮屏障主要由肺泡上皮Ⅰ型細(xì)胞、Ⅱ型細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接(Tight junction, TJ)組成,是進(jìn)行氣體交換、抵御病原體入侵的重要免疫屏障[4]。緊密連接由蛋白質(zhì)和脂類組成,其中蛋白質(zhì)占主要地位,包括跨膜蛋白[緊密連接蛋白(Claudin)、閉合蛋白(Occludin)]和閉鎖小帶蛋白(Zonula occludens,ZO)等[5]。RSV主要靶向氣道和肺泡上皮細(xì)胞,上皮細(xì)胞損傷后,相鄰細(xì)胞的裂隙增大,細(xì)菌和炎癥因子進(jìn)入肺組織,放大局部和全身炎癥[6]。因此,修復(fù)肺上皮屏障可能是防治RSV的重要方向。

RSV肺炎在中醫(yī)古籍中雖無確切的病名記載, 但根據(jù)本病“喘、咳、痰、熱”的四大癥候特點(diǎn)，可將其歸類于“肺脹”“馬脾風(fēng)”“肺家炎”等疾病范疇，急性期以痰熱閉肺證最為多見[7]。全國名中醫(yī)汪受傳教授針對本病肺氣郁閉的病機(jī)特點(diǎn),在經(jīng)方麻杏石甘湯基礎(chǔ)上,加宣肺止咳之前胡,肅肺平喘之桑白皮,瀉肺滌痰之葶藶子,解毒活血之虎杖等,組方制成以開肺化痰、解毒活血為主要功效的清肺口服液[8]。清肺口服液臨床運(yùn)用多年,能明顯減輕RSV肺炎患兒咳嗽、發(fā)熱等癥狀,療效顯著[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),黃酮類成分是清肺口服液的主要效應(yīng)物質(zhì),能夠抑制RSV復(fù)制,減輕肺組織的炎癥損傷[10]。最新網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析發(fā)現(xiàn),絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是清肺口服液黃酮類成分(Fla)治療RSV肺炎的關(guān)鍵通路之一[11],p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)還被報(bào)道與RSV導(dǎo)致的上皮屏障損傷有關(guān)[12]。在RSV感染中,p38 MAPK的激活是由Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)信號通路介導(dǎo)的[13]。因此本研究建立RSV感染小鼠模型,觀察藥物對緊密連接蛋白、TLR4/MyD88/p38 MAPK通路的影響,探究Fla保護(hù)肺上皮屏障的作用機(jī)制,也為清肺口服液的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 RSV病毒

RSV A2型long株,購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,RSV在Hep2細(xì)胞上擴(kuò)增,收集病毒備用。

1.2 動物

SPF級6～8周齡的雌性BALB/c小鼠購于斯貝福(北京)生物科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。動物實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(201805A019)。

1.3 藥物

清肺口服液按原比例配制:炙麻黃4 g,生石膏24 g,杏仁10 g,桑白皮10 g,葶藶子6 g,紫花前胡10 g,虎杖12 g,拳參12 g,制僵蠶6 g,丹參6 g,由江蘇省中醫(yī)院中藥房提供。取藥材5 kg粉碎,加12倍量85%乙醇回流提取3次,每次1.5 h,濾過,濾液合并,減壓濃縮、冷凍干燥,獲得凍干粉600 g,經(jīng)聚酰胺樹脂純化后,減壓濃縮、冷凍干燥獲得Fla凍干粉,轉(zhuǎn)移率為78.7%,并采用UPLC-MS/MS技術(shù),定量檢測出兒茶素、木犀草素等26種黃酮類化合物[11]。利巴韋林(批號：B27035,HPLC≥98%)購自源葉生物有限公司。

1.4 試劑

伊紅染料、蘇木精染料(Sigma,批號:170、H9627);FITC-葡聚糖(源葉生物，批號：S26605)；RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液、Tris-Glycine SDS電泳緩沖液、快速轉(zhuǎn)膜液(新賽美,批號: WB3100、P002、WB52001、WB4600);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天,批號：P0012A);小鼠白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 試劑盒(南京謹(jǐn)庭，批號：JTE79825、JTE79147);Claudin-1、TLR4抗體(Abmart,批號：PA2349、TA7017);Occludin、ZO-1、p38 MAPK、MyD88抗體(Proteintech,批號：27260-1-AP、21773-1-AP、14064-1-AP、23230-1-AP);p-p38 MAPK、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(Affinity,批號：AF4001、AF7018)。

1.5 儀器

BioPhotometer D30蛋白核酸分析儀(Eppendorf);MM400混合球磨儀(Retsch);Power Pac Basic電泳儀、Trans-blot-SD轉(zhuǎn)膜儀、Chemi-Doc MP凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad);Infinite 2000酶標(biāo)儀(TECAN);Axio Scope A1光學(xué)顯微鏡(Carl Zeiss)。

2 方法

2.1 模型建立和給藥

30只BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組、模型組、Fla高劑量組(60 mg·kg-1·d-1)、Fla低劑量組(30 mg·kg-1·d-1)、利巴韋林組(46 mg·kg-1·d-1),每組6只。除正常組外,其余小鼠于實(shí)驗(yàn)第1天,在異氟烷麻醉狀態(tài)下予1×107pfu·mL-1的RSV病毒液80 μL滴鼻,構(gòu)建RSV感染小鼠模型[11]。給藥組分別予0.5% CMC-Na生理鹽水溶解的Fla或利巴韋林灌胃,持續(xù)給藥4 d;空白組和模型組灌胃等量0.5% CMC-Na生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水,于第2天處死小鼠,取樣備用。

2.2 肺組織HE染色

取每組小鼠新鮮肺組織,加入4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋、切片、脫蠟,使用HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織炎癥情況,并進(jìn)行炎癥評分[11]。

2.3 肺上皮通透性檢測

肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量測定：使用BCA定量法測定BALF中蛋白含量。依次加入10 μL稀釋好的BALF與200 μL的BCA工作液，37 ℃ 孵育30 min，酶標(biāo)儀562 nm波長下檢測OD值，計(jì)算蛋白含量。

BALF/血清熒光比測定：FITC-葡聚糖是一種熒光素-異硫氰酸酯葡聚糖標(biāo)記物，可用于檢測上皮通透性。在小鼠處死前1 h，使用0.2 mg 4 kDa FITC-葡聚糖灌胃，處死后取BALF和血清。設(shè)置發(fā)射波長為492 nm，接收波長為520 nm，檢測熒光板讀數(shù)板中BALF和血清的FITC-葡聚糖含量。

2.4 ELISA法檢測BALF中IL-1β和TNF-α的含量

取小鼠BALF,按照試劑盒說明,檢測IL-1β和TNF-α的含量。

2.5 Western blot法檢測緊密連接表達(dá)相關(guān)蛋白

稱取20 mg肺組織，加入200 μL RIPA裂解液和20 μL蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液混勻,研磨勻漿,提取肺組織的總蛋白,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量,等量蛋白加樣,依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。Claudin-1(1∶1 000)、Occludin(1∶3 000)、ZO-1(1∶3 000)、p38 MAPK(1∶1 000)、p-p38 MAPK(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)特異性抗體4 ℃孵育過夜,第2天回收清洗,加入與一抗同源的二抗室溫孵育1 h,使用ECL發(fā)光液顯影,并對目的條帶進(jìn)行成像分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 Fla對RSV感染小鼠肺組織病理的影響

正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見明顯出血和炎癥浸潤。模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理改變,表現(xiàn)為充血、水腫,肺間質(zhì)增厚,伴有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(P<0.01);而Fla高、低劑量組及利巴韋林組均能顯著改善上述病理特征(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=6。

3.2 Fla對RSV感染小鼠肺上皮通透性的影響

肺上皮屏障損傷是RSV病情進(jìn)展的重要因素,上皮通透性是評價(jià)屏障功能的主要指標(biāo)。圖2結(jié)果顯示模型組小鼠表現(xiàn)出更高的BALF蛋白含量和增加的BALF/血清熒光比(P<0.01),表明RSV感染導(dǎo)致肺上皮屏障的破壞。而Fla高、低劑量組及利巴韋林組的BALF蛋白含量和BALF/血清熒光比顯著降低(P<0.01),說明Fla能降低肺上皮的通透性,維持上皮屏障穩(wěn)定。

注：與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01?！纒，n=6。

3.3 Fla對RSV感染小鼠BALF中炎癥因子的影響

肺上皮通透性增加,有利于炎癥因子的產(chǎn)生與釋放,而炎癥因子又會進(jìn)一步損傷上皮屏障，因此我們檢測了BALF中IL-1β和TNF-α的含量。如圖3所示,與正常組相比,模型組BALF中IL-1β和TNF-α的蛋白水平顯著上升(P<0.01),而高、低劑量的Fla均能有效降低上述炎癥因子的水平(P<0.05，P<0.01),說明Fla有較好的抗炎作用。

3.4 Fla對RSV感染小鼠肺組織緊密連接關(guān)鍵蛋白的影響

與正常組相比,模型組小鼠肺組織緊密連接關(guān)鍵蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表達(dá)明顯減少(P<0.01),而Fla高、低劑量組及利巴韋林組均能提高上述蛋白的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，見圖4。結(jié)果說明,Fla可以通過提高緊密連接蛋白表達(dá)水平,減輕RSV導(dǎo)致的肺上皮屏障損傷。

注：與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=3。

3.5 Fla對RSV感染小鼠TLR4/MyD88/p38 MAPK的影響

Western blot結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、p-p38 MAPK/p38 MAPK水平明顯增加(P<0.01),而Fla抑制了肺組織中TLR4、MyD88的表達(dá)和p-p38 MAPK/p38 MAPK(P<0.05，P<0.01)。提示Fla可能通過抑制TLR4/MyD88/p38 MAPK通路,保護(hù)上皮屏障,減輕炎癥反應(yīng)。見圖5。

注：與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。±s，n=3。

4 討論

RSV嚴(yán)重威脅人類健康,尤其是對嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷患者,每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前批準(zhǔn)用于RSV預(yù)防和治療的藥物分別是帕利珠單抗和利巴韋林[3]。但兩者均僅適用于RSV感染的高?；颊?在療效和安全性方面也存在爭議[14-15]。中醫(yī)認(rèn)為,RSV肺炎病位主要在肺,熱、郁、痰、瘀是本病的主要病理因素。小兒肺常不足,外感風(fēng)寒或風(fēng)熱,入里化熱,煉液為痰,痰瘀互結(jié),郁閉肺絡(luò),肺氣閉塞,出現(xiàn)喘嗽之癥。清肺口服液組方藥物包括麻黃、生石膏、杏仁、桑白皮、葶藶子、紫花前胡、虎杖、拳參、僵蠶、丹參,全方宣肅肺氣、清熱解毒、化痰泄?jié)帷⒒钛ńj(luò),正契合本病痰熱閉肺證的病機(jī)。多項(xiàng)臨床研究試驗(yàn)證明清肺口服液是治療RSV肺炎的安全有效藥物[9,16]。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠的肺組織病理充血水腫、肺間質(zhì)增厚,伴有炎性細(xì)胞浸潤,提示該模型構(gòu)建成功,Fla高、低劑量組均能減輕上述病理損傷,對RSV感染小鼠具有顯著治療作用。

緊密連接蛋白是肺泡上皮屏障的重要組成部分,對于調(diào)節(jié)氣體交換、液體轉(zhuǎn)運(yùn),阻止有害物質(zhì)侵入肺組織有著重要意義[17]。Claudin作為重要的跨膜蛋白,是構(gòu)成細(xì)胞膜緊密連接的重要成分。Occludin進(jìn)入緊密連接復(fù)合體后,能降低細(xì)胞膜的通透性,僅容許小分子物質(zhì)進(jìn)出。ZO-1可將細(xì)胞骨架和蛋白質(zhì)連接固定在細(xì)胞膜的特定區(qū)域,維持細(xì)胞的屏障功能[18]。先前研究表明,RSV感染后,小鼠肺組織上皮屏障損傷,伴隨著緊密連接蛋白的降解和炎癥因子的釋放[6]。IL-1β和TNF-α是重要的促炎介質(zhì),不僅能促進(jìn)RSV誘導(dǎo)的肺部炎癥進(jìn)展[19],還能下調(diào)ZO-1蛋白表達(dá),加重緊密連接破壞[20],而上皮屏障損傷又會進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)。本研究中Fla不僅能抑制RSV感染小鼠BALF中炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平,還能上調(diào)Claudin-1、ZO-1和Occludin的蛋白表達(dá),降低肺上皮通透性。這些結(jié)果證明Fla具有改善炎癥和保護(hù)上皮屏障的功效。

RSV融合蛋白結(jié)合TLR4后,銜接蛋白MyD88通路被激活,經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo),進(jìn)而激活p38 MAPK通路[13,21],介導(dǎo)后續(xù)的炎癥反應(yīng)和上皮屏障損傷[12,22]。文獻(xiàn)報(bào)道RSV感染后,上皮細(xì)胞中的TLR4水平顯著升高,而TLR4的敲除抑制了p38 MAPK信號的傳導(dǎo),證明RSV感染中p38 MAPK的激活是TLR4依賴的[23]。p38 MAPK抑制劑 NJK14047不僅能抑制RSV病毒復(fù)制,還能降低炎癥因子IL-6水平[22]。p38 MAPK抑制劑SB28350被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架,降低RSV感染后上皮細(xì)胞的通透性,從而保護(hù)上皮屏障[12]。在亞砷酸鹽誘導(dǎo)肺損傷的體內(nèi)外模型中,SB28350能夠提高Occludin的蛋白水平,改善緊密連接結(jié)構(gòu)和肺上皮屏障損傷[24]。這些研究結(jié)果提示阻斷TLR4/MyD88/p38 MAPK激活可能是改善緊密連接和炎癥反應(yīng)的潛在治療方法。本研究Western blot結(jié)果顯示,Fla能夠降低TLR4、MyD88的蛋白表達(dá)以及p38 MAPK的磷酸化,提示Fla對RSV感染的改善作用可能是通過TLR4/MyD88/p38 MAPK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上,Fla可能通過抑制TLR4/MyD88/p38 MAPK信號通路,增加緊密連接蛋白表達(dá),抑制炎癥因子釋放,從而緩解RSV導(dǎo)致的肺部炎癥和上皮屏障損傷。