響應(yīng)面法優(yōu)化-超聲輔助提取黃芪多糖工藝

魏增云， 董芳娟， 薄一覽

（1.忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 忻州 034000；2.忻州師范學(xué)院地理系，山西 忻州 034000）

黃芪（Radix Astragali）是豆科黃芪屬植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一味傳統(tǒng)中藥，也是保健食品的一種重要原料[1]。黃芪蘊(yùn)含皂苷、黃酮、多糖等化學(xué)成分[2]，具有斂瘡生肌、利尿托毒、止汗退腫等功效[3]。黃芪多糖提取自黃芪，可溶于水[4]，是黃芪發(fā)揮生物活性和藥理作用的重要物質(zhì)之一。研究證實(shí)，黃芪多糖具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[5]、提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、拮抗鎘毒性[6]、保護(hù)牙周組織完整性[7]、促進(jìn)重離子輻射細(xì)胞的生長(zhǎng)、有效減輕細(xì)胞基因組DNA及染色體的損傷水平[8]等作用，因此，開發(fā)黃芪多糖的提取方法具有重要意義。

目前，黃芪多糖的提取方法主要有溶劑法、酶輔助法、微生物發(fā)酵法和電磁強(qiáng)化法[9]。由于工藝條件等因素，溶劑法是工業(yè)上黃芪多糖提取的常用方法，但溶劑法不僅提取率低[10]，還存在著耗時(shí)、耗能、易使活性成分失活等弊端，因此，黃芪多糖的提取方法成為黃芪多糖開發(fā)利用的瓶頸。酶輔助法對(duì)環(huán)境要求高，微生物發(fā)酵法中菌種選育困難[9]，因此不適于工業(yè)生產(chǎn)。電磁強(qiáng)化法中的超聲輔助法是利用超聲波的空化作用使溶劑滲入植物細(xì)胞，且使細(xì)胞中的有效成分快速進(jìn)入溶劑。超聲波產(chǎn)生的擊碎效應(yīng)能有效提高細(xì)胞破碎效率，加速細(xì)胞內(nèi)有效成分的擴(kuò)散和釋放，從而有效提高多糖提取率。超聲輔助法具有快速、低溫等特點(diǎn)，且有利于維持有效成分的生物活性，因此，適合于動(dòng)植物多糖工業(yè)生產(chǎn)的研發(fā)。但超聲波強(qiáng)烈的機(jī)械振動(dòng)也可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)。因此，本試驗(yàn)擬采用低頻超聲功率，以山西省忻州市五寨縣人工種植蒙古黃芪的干燥根為原料，研究超聲輔助提取法提取黃芪多糖的工藝條件，以期為山西本地黃芪資源的高植化利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以山西省忻州市五寨縣種植的蒙古黃芪干燥根為研究材料，購(gòu)自五寨縣正和堂藥材公司；將試驗(yàn)材料干燥、粉碎過40目篩，封存待用。

設(shè)備：KQ-100DB型數(shù)控超聲波設(shè)備（昆山市超聲儀器有限公司），工作頻率40 kHz，功率100 W；752N型紫外可見分光光度計(jì)（上海津科）。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取7支25 mL比色管，制成2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，然后加入5%的苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，以2 mL蒸餾水作空白對(duì)照。將此8支比色管開蓋置于沸水浴15 min后取出，冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)量其吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=0.032 0X+0.061 2，R2=0.995 9。多糖得率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 黃芪多糖的提取和測(cè)定 精確稱取0.5 g干燥的黃芪粉于50 mL三角瓶中，按液固比加一定體積的蒸餾水，超聲（超聲功率、溫度、液固比、提取時(shí)間和提取次數(shù)）提取黃芪多糖，靜置后去沉淀，定容至2 000 mL，測(cè)定黃芪多糖含量。

1.2.3 超聲輔助提取黃芪多糖工藝的優(yōu)化 設(shè)置單因素試驗(yàn)，分別研究超聲功率、溫度、液固比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)黃芪多糖得率的影響。其中，超聲功率單因素試驗(yàn)：溫度55℃，液固比40 mL·g-1，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，設(shè)置超聲功率分別為20、40、60、80和100 W；溫度單因素試驗(yàn)：超聲功率80 W，液固比40 mL·g-1，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，設(shè)置溫度分別為35、45、55、65和75℃；液固比單因素試驗(yàn)：超聲功率80 W，溫度55℃，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，設(shè)置液固比分別為20、30、40、50和60 mL·g-1；提取時(shí)間單因素試驗(yàn)：超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取次數(shù)2次，設(shè)置提取時(shí)間分別為10、20、30、40和50 min；提取次數(shù)單因素試驗(yàn)：超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取時(shí)間20 min，設(shè)置提取次數(shù)分別為1、2和3次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)黃芪多糖提取有顯著影響的因素：超聲功率、溫度、液固比和提取時(shí)間4個(gè)因素為考察對(duì)象，以黃芪多糖得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 Trial統(tǒng)計(jì)分析方法，設(shè)計(jì)四因素三水平回歸試驗(yàn)（表1）。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取黃芪多糖工藝的優(yōu)化

超聲功率、溫度、液固比、提取時(shí)間和提取次數(shù)5個(gè)因素對(duì)黃芪多糖的提取率有顯著影響（表2）。不同超聲功率、溫度、液固比、提取時(shí)間所得的多糖得率存在極顯著差異；不同提取次數(shù)所得的多糖得率差異顯著。隨著功率的增加，黃芪多糖得率先增加后降低，功率為80 W時(shí)黃芪多糖得率最高，可能是由于功率過大破壞了多糖結(jié)構(gòu)[11]，因此，80 W為黃芪多糖超聲提取的最佳功率。隨著提取溫度的升高，黃芪多糖得率也呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為55℃時(shí)黃芪多糖得率最高，溫度繼續(xù)升高后多糖得率顯著降低，可能是由于溫度過高導(dǎo)致多糖降解[12]，因此，55℃為黃芪多糖超聲提取的最佳提取溫度。隨著液固比的增加，黃芪多糖得率先升高后降低，液固比為50 mL·g-1時(shí)多糖得率最高。隨著提取時(shí)間的增加，黃芪多糖得率先升高后降低，在提取時(shí)間為20 min時(shí)最高，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，多糖得率反而降低，30 min后下降更為明顯，這可能是由于處理時(shí)間太長(zhǎng)，超聲波使黃芪多糖發(fā)生斷裂[13]，因此，20 min為最佳提取時(shí)間。隨提取次數(shù)的增加，黃芪多糖得率逐漸增加，提取次數(shù)為3次時(shí)，黃芪多糖得率最高，但提取次數(shù)為2次和3次間多糖得率差異不顯著，且提取3次時(shí)成本太高，因此，提取次數(shù)為2次最佳。

表2 不同處理下的黃芪多糖得率Table 2 Yield of astragalus polysaccharides under different treatments

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 回歸分析 根據(jù)表1設(shè)計(jì)的因素及水平，按表3方案實(shí)施試驗(yàn)，共24個(gè)析因點(diǎn)，5次零點(diǎn)試驗(yàn)，得出各個(gè)試驗(yàn)條件的黃芪多糖得率。不同試驗(yàn)條件所得黃芪多糖得率差異極顯著（F=31.81，P＜0.01）。軟件經(jīng)無量綱線性編碼代換模擬出回歸方程。

表3 響應(yīng)面分析Table3 Analysis of response surface methodology

式中，A代表超聲功率；B代表溫度；C代表液固比；D代表提取時(shí)間。由此表明，超聲功率、溫度、液固比和提取時(shí)間4因素對(duì)黃芪多糖得率的影響依次為：超聲功率＞溫度＞液固比＞提取時(shí)間。

2.2.2 方差分析 方差分析（表4）表明，模型的F值為15.35，P＜0.000 1，表明該回歸方程的擬合度良好。A、B、A2、B2、C2和D2的P值均小于0.05，說明模型項(xiàng)顯著。失擬項(xiàng)的F值為31.99，表明模型適合度顯著。模型調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R2為0.877 7，變異系數(shù)為2.53%，表明試驗(yàn)的可靠性高，實(shí)驗(yàn)操作可靠。該模型的確定系數(shù)R2為0.938 8，表明多糖得率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間的擬合度較好，該模型可用于黃芪多糖得率的預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)面分析 為了更明確超聲功率、溫度、液固比、提取時(shí)間對(duì)黃芪多糖得率的交互關(guān)系，采用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，結(jié)果（圖1）表明，超聲功率與溫度和提取時(shí)間交互作用不顯著；溫度與液固比和提取時(shí)間交互作用顯著。因此，經(jīng)過中心組合設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，超聲輔助提取法提取黃芪多糖工藝的最佳提取參數(shù)為：超聲功率80.3 W，溫度56.1 ℃，液固比49.02 mL g-1，提取時(shí)間20.8 min，此時(shí)多糖得率可達(dá)到5.468%。驗(yàn)證性試驗(yàn)（超聲功率80 W，溫度55℃，液固比50 mL·g-1，提取時(shí)間20 min）表明，黃芪多糖得率為5.40%，與理論值相符。因此，采用響應(yīng)面法得到的提取條件相對(duì)可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 不同影響因素對(duì)黃芪多糖得率的交互關(guān)系Fig.1 Interaction relation of different influencing factors on the yield of astragalus polysaccharides

表4 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 4 Variance analysis of fitting quadratic polynomial model

3 討論

黃芪多糖是黃芪中的有效活性成分[5-8]，將黃芪多糖開發(fā)為藥物或保健產(chǎn)品逐漸成為一種研究趨勢(shì)。本研究對(duì)黃芪多糖的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，超聲功率、反應(yīng)溫度和提取時(shí)間都不宜過高，超過一定閾值可能會(huì)破壞黃芪多糖結(jié)構(gòu)而使得多糖得率降低，與前人研究結(jié)果一致[11-13]；液固比增大，多糖得率也隨之升高，可能是由于細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度的增大有利于細(xì)胞內(nèi)多糖的析出，但液固比高于50 mL·g-1后，多糖得率反而降低。進(jìn)一步利用響應(yīng)面優(yōu)化法研究超聲功率、反應(yīng)溫度、液固比和提取時(shí)間對(duì)黃芪多糖得率影響的強(qiáng)弱關(guān)系表明，超聲功率＞溫度＞液固比＞提取時(shí)間；因素間的互作表明，超聲功率與溫度和提取時(shí)間交互作用不顯著，溫度與液固比和提取時(shí)間交互作用顯著。因此，超聲輔助提取黃芪多糖工藝最佳提取條件為：超聲功率80 W，溫度55 ℃，液固比50 mL·g-1，提取20 min。按照此條件進(jìn)行提取，山西五寨人工種植黃芪的多糖得率可達(dá)5.40%。梁子敬等[14]研究表明，超聲輔助提取黃芪多糖的適宜參數(shù)為：功率600 W，溫度80 ℃，液固比22 mL·g-1，提取87 min，黃芪多糖得率為6.07%。與其相比，本研究采用低頻超聲波，節(jié)能的同時(shí)更有效地減少了噪聲污染，且提取時(shí)間更短，反應(yīng)溫度更易控制，液固比較高，可能是由于較高的液固比增加了細(xì)胞內(nèi)外濃度差，更有利于多糖的析出。本試驗(yàn)用時(shí)僅為水提工藝[15]的33%、堿水提工藝[10]的4.44%，顯著縮短了提取時(shí)間；相較超聲輔助堿水提取法[2]和微波輔助提取法[16]，操作簡(jiǎn)單易控，不用預(yù)處理及控制pH，無廢渣廢液，節(jié)能環(huán)保。