灌木幼苗對鎘毒害的敏感性差異

張曉晴， 李壯壯， 陳世寶， 孟昱， 任大軍， 張淑琴

（1.武漢科技大學資源與環(huán)境工程學院，武漢 430081；2.武漢科技大學冶金礦產資源高效利用與造塊湖北省重點實驗，武漢 430081；3.中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

森林是陸地上最大的生態(tài)系統(tǒng)，對于維持生態(tài)系統(tǒng)平衡、物種多樣性和凈化環(huán)境具有重要作用。我國林地約占國土面積的31.6%，林地土壤污染超標率高達10%，其中鎘（Cd）為主要超標重金屬，部分區(qū)域林地土壤Cd污染形勢嚴峻[1-3]，如貴州梵凈山自然保護區(qū)土壤受到Cd輕-中度污染[4]，四川北部林地土壤中Cd含量均高于全國平均水平，甚至部分林地已達重度污染[5]；此外，土壤Cd的分布與富集也受植被類型和林分的影響，有研究者比較了梵凈山冷杉、豆杉、西南衛(wèi)矛、杜鵑和珙桐5種植被林地土壤中重金屬Cd含量，結果表明，梵凈山冷杉林地土壤中含量最高，西南衛(wèi)矛林最低[4]；鄂東南5種林分（楠木、檫木、楓香、馬褂木、苦櫧）土壤Cd的潛在生態(tài)風險系數均較大，其中楠木林的潛在生態(tài)風險指數最高[6]；粵西地區(qū)桉樹、馬尾松、杉木、相思人工林和闊葉混交林中，馬尾松人工林土壤Cd潛在生態(tài)風險指數最高，闊葉混交林最低[7]。Cd的生物毒性大，且具有較強的遷移性，其毒性和累積性與植物本身的遺傳特性和對該元素的富集能力有關[8-9]，如在海南益智主產區(qū)，土壤Cd超標率為83.33%，林下種植的益智果實中Cd未超標[10]；云南文山及其周邊種植地三七樣品不同部位的Cd超標率范圍為81%～100%，嚴重影響中藥的品質和人體健康[11]。植物修復有助于恢復土壤功能，如增加土壤結構穩(wěn)定性、保持水土、改善土壤質地；提高土壤的有機質和養(yǎng)分含量，有利于植物的生長；增加土壤微生物數量的豐度[12]。目前報道的重金屬超積累植物大多數為草本植物，其生物量相對較小，根系不發(fā)達，進而影響修復效率[13-14]。林木具有生物量大、生長迅速等特點，研究表明，Cd對林木的毒害閾值較高，為將林木應用于大面積修復重金屬污染土壤，針對不同等級Cd生態(tài)風險的林地，選擇合適的生態(tài)修復樹種或林下種植低吸收藥材品種，研究鎘對不同灌木植物的毒性差異，篩選適合于生態(tài)修復的樹種或指示的敏感樹種尤為重要[15]。

物種敏感性分布（species sensitivity distributions，SSD）廣泛用于生態(tài)毒理學中，如制定污染物的環(huán)境質量標準和對污染生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)風險評價[16]。該方法假設不同物種對于某一污染物的毒性閾值能被某概率分布函數所擬合，進而計算出重金屬對測試物種所產生的脅迫程度，以確定風險最大的物種類別，并體現(xiàn)出物種的敏感性差異[17-18]。針對SSD曲線的構建，學者們提出了不同的參數擬合方法，目前，國內外常用參數擬合模型主要有 Burr-Ⅲ、Log-logistic、Log-triangular、Lognormal、Log-Gumbel、Weibull等[19]。 研 究 表 明 ，Burr-Ⅲ模型十分靈活，對物種敏感性數據擬合較好[19-20]。目前，關于陸地植物對鎘毒害的敏感性研究主要集中于常見的農作物，如崔廣娟等[21]研究了4種基因型大豆對Cd的敏感性差異；郭瞻宇等[22]研究了21個芥菜品種對土壤中Cd脅迫的敏感性分布規(guī)律。此外，植物測試終點對Cd毒性響應的敏感性差異較大，如大豆根伸長和胚芽鞘生長比種子萌發(fā)對Cd的毒害更敏感[23]。目前，在灌木植物對Cd毒害敏感性方面的研究相對缺乏，且植物毒害效應的測試終點不同，其結果也無法直接進行比較。因此，有必要系統(tǒng)地研究基于不同測試終點灌木植物對Cd的毒性敏感性差異。本研究通過12種常見灌木幼苗對重金屬Cd毒害效應的水培試驗，比較分析幼苗生長的表觀癥狀、株高、生物量、根系生長狀態(tài)等測試指標，并基于穩(wěn)定測試終點的植物Cd毒害閾值，研究植物的敏感性分布，以期為林地Cd污染土壤的植物生態(tài)修復樹種的篩選及物種保護提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物水培生長所需營養(yǎng)為Hoagland營養(yǎng)液，購自海博生物技術有限公司，其成分為硫酸鉀、磷酸二氫氨、硫酸鎂、Fe/Na-EDTA、硫酸亞鐵、硼酸、硼砂、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸銨。稱取1.26 g Hoagland營養(yǎng)液，硝酸鈣0.945 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，115℃高壓滅菌20 min，備用。用1mol·L-1的NaOH或HCl溶液調節(jié)pH至6。

供試植物為我國廣泛種植的灌木幼苗，均購自湖北峰泉風景園藝有限公司，包括法國冬 青（Viburnum odoratissimum Ker-Gawl）、杜鵑（Rhododendron simsii）、十大功勞（Mahonia fortune）、灑金珊瑚（Aucuba japonica cv.variegata）、八角金盤（Fatsia japonica）、紅葉石楠（Photinia×fraseri Dress）、紅 花 繼 木（Loropetalum chinense var.rubrum）、南天竹（Nandina domestica）、金森女貞（Ligustrum japonicum‘Howardii’）、金 邊 黃 楊（Buxus megistophylla）、海桐（Pittosporum tobira）、茶梅（Camellia sasanqua）。

1.2 試驗設計

分別挑選長勢良好，生長一致的幼苗各24株，用去離子水反復清洗，洗凈后移栽至裝有1 L 1/4 Hoagland營養(yǎng)液的PVC花盆（高13 cm，直徑13.5 cm，不透光），穩(wěn)定4 d，使幼苗適應水培環(huán)境，每盆取1株幼苗；更換為Hoagland全營養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d，使幼苗適應全營養(yǎng)液環(huán)境；待其長勢平穩(wěn)，外源添加不同含量的Cd[Cd（NO3）2·4H2O]。開展幼苗Cd毒害的水培預實驗，最終確定8個Cd含量處理［0（CK）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·L-1］，每個處理設置3個重復。

植株均在武漢科技大學校內溫室苗圃內培養(yǎng)，生長條件：溫度（20±5）℃，濕度55%，自然光照12 h。所有花盆每天隨機擺放。每3 d更換1次培養(yǎng)液，使各處理含量維持不變，并每天通氣1次，每次通氣3 h，加速營養(yǎng)液的循環(huán)，并補充氧氣，培養(yǎng)期間所有試驗條件保持一致，每天觀察記錄植物外部形態(tài)（根、莖、葉）的變化，如葉片顏色變化、葉片脫落情況、是否生長須根以及根部顏色等。培養(yǎng)21 d后，測定植物生長相關指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 地上部指標的測定 培養(yǎng)21 d后收獲植株，用卷尺測定植株的株高，具體為植株根頸部到主莖頂部之間的距離。將植物地上部和根部分開，用分析天平（BSA224S，德國賽多利斯集團）稱取地上部鮮重；隨后將植物樣品放置于烘箱中105℃殺青2 h后，于85℃干燥至恒重，稱量地上部干重。

1.3.2 根部指標的測定 采用WinRHIZO多參數植物根系掃描分析系統(tǒng)（加拿大Regent公司）分析植物根系的總根長、總根表面積、總根尖數、根分枝數等數據。由于杜鵑和紅花繼木的根系密集，掃描結果不理想，因此，僅分析其他10種植物的根部指標數據。植物幼苗的相對干重和相對根分支數計算公式如下。

式中，R表示植物幼苗的相對干重或者相對根分支數；Rt表示添加Cd的處理組中的植物幼苗的干重或者根分支數；Rc表示未添加Cd的對照組中的植物幼苗的干重或者根分支數。

1.4 劑量-效應曲線擬合

Cd對植物毒性的劑量-效應曲線采用邏輯斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）進行擬合。該模型已經被廣泛用于重金屬對植物毒性的劑量-效應關系擬合，效果較好。通過劑量效應曲線擬合[24]，得到植物Cd毒害的毒性閾值EC10、EC50以及95%置信區(qū)間，擬合方程如下。

式中，Y為相對生長指標；X為Cd含量，mg·L-1；Y0和b分別為模型擬合的參數；M為導致植物生物量減少10%、50%時Cd的含量，即EC10和 EC50，mg·L-1。

當低含量Cd對植物產生刺激效應時，采用低劑量毒物刺激效應曲線擬合[25]。此模型比較適用于產生低劑量刺激效應的污染物劑量-效應關系擬合，并采用Table Curve 2D V5.01軟件計算其置信區(qū)間，擬合方程如下。

式中，Y為相對生長指標；X為Cd的含量，mg·L-1；a、b、c、d 分別為模型擬合的參數；當 k為10和50時，參數c分別定義為EC10和EC50。

1.5 SSD的測定

采用Burr-Ⅲ型分布函數擬合植物Cd毒性數據，得到植物SSD。Burr-Ⅲ是一種靈活的分布函數，對于物種敏感性的數據擬合特性較好，方程如下。

式中，F(xiàn)為分布頻率；x為培養(yǎng)液中Cd的含量，mg·L-1，b、c和k為擬合的參數。

1.6 數據處理

采用Excel 2016和Origin 9.1軟件對試驗數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 鎘對植物的表觀毒害癥狀

通過觀察植物生長的表觀癥狀發(fā)現(xiàn)，與未添加Cd的對照相比，當水培溶液中Cd含量較低時（0.5 mg·L-1），灌木幼苗長勢良好，植物根部長出新的白色須根，表明低劑量Cd具有刺激效應。隨著溶液中Cd含量的增加，植物逐漸表現(xiàn)出相關毒害癥狀，如葉片發(fā)黃、卷縮、脫落、出現(xiàn)黑色斑點以及根部發(fā)黑等。當水培處理中Cd含量為1.0 mg·L-1時，金森女貞和海桐等植株的葉片均輕微發(fā)黃，而其他植物的幼苗未表現(xiàn)毒害癥狀；在2.0 mg·L-1Cd處理下，除八角金盤、紅花繼木和南天竹外，其余植物葉片均有發(fā)黃現(xiàn)象，其中法國冬青葉片靜脈輕微發(fā)紅，海桐部分葉片卷縮；在4.0 mg·L-1Cd處理下，幼苗均表現(xiàn)出一定毒害癥狀，植物發(fā)黃葉片數量逐漸增加，枝條上老葉開始脫落，根部開始變黑等。這說明在一定Cd含量范圍內，不同灌木幼苗對Cd處理毒性的敏感性差異較大。在高含量Cd脅迫下（8.0～32.0 mg·L-1），植物毒害的癥狀明顯，幼苗葉片失綠變黃增多，部分植物葉片邊緣出現(xiàn)黑色斑點，萎蔫嚴重，脫落數量增加；幼苗根部發(fā)黑程度進一步加深，直至最后根部組織壞死并呈黑腐狀；且Cd含量越高，植物出現(xiàn)毒害癥狀的時間越早，其毒害癥狀表現(xiàn)也更顯著。不同植物器官對Cd的毒害敏感性不同，如十大功勞、金森女貞和海桐幼苗的葉片毒害癥狀更明顯，法國冬青和灑金珊瑚幼苗根部毒害癥狀更明顯，說明不同種類的植物或者同一種類植物的不同部位所表現(xiàn)出來的表觀毒害癥狀也都存在較大的差異（圖1）。結果表明，Cd對灌木幼苗的生長呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，12種灌木植物對于Cd毒害的表觀癥狀有較大差異，其中十大功勞、灑金珊瑚、金森女貞和海桐的毒害癥狀更明顯。

圖1 部分植物幼苗的毒害癥狀Fig.1 Toxicity symptoms of part seedlings

2.2 基于不同測試終點的毒性閾值比較

灌木幼苗對Cd脅迫的測試終點[株高、地上部生物量（鮮重、干重）、根系生長狀況（總根長、總根表面積、總根尖數、根分支數）]敏感性也存在差異。通過劑量-效應曲線分別擬合Cd對植物生長影響的7個不同測試終點的毒性閾值。以植物地上部分的干重和根生長的分枝數為例，不同含量的Cd處理對植物生長的劑量-效應曲線如圖2～3所示，低含量 Cd（0.5 mg·L-1）脅迫促進了部分植物幼苗的生長，如八角金盤植株相對干重和相對根分枝數分別是對照的1.17和1.11倍。隨著培養(yǎng)液中Cd含量的增加，植物的地上部干重、根分支數逐漸降低。導致植物不同測試終點（株高、地上部鮮重、地上部干重、總根長、總根表面積、總根尖數、根分支數）減少10%和50%的毒性閾值EC10和EC50及其置信區(qū)間如表1～2所示，同一測試終點，不同植物的毒性閾值變化較大，如Cd對幼苗地上部鮮重的毒性閾值EC10和EC50的變化范圍分別為0.08（金森女貞、海桐）～1.41 mg·L-1（八角金盤）和3.26（金森女貞）～14.10 mg·L-1（紅花繼木），差異分別達到了17.6倍和4.3倍；不同幼苗地上部干重的EC10和EC50的變化范圍分別為0.11（海桐）～1.30 mg·L-1（八角金盤）和 2.58（金森女貞）～10.90mg·L-1（八角金盤），差異分別達到了11.8和4.2倍。

表1 Cd對植物生長和生物量的毒性閾值及其95%的置信區(qū)間Table 1 Toxicity threshold of cadmium to plant growth and biomass and 95% confidence intervals （mg·L-1）

圖2 Cd對不同灌木幼苗地上部干重的劑量-效應關系Fig.2 Dose-response curves of cadmium on shoot dry weight of shrub plants seedlings

Cd也不同程度抑制了植物根系的生長，其毒性閾值的差異也較大，以Cd對根總根尖數毒性閾值為例，其EC10和EC50的變化范圍分別為0.08（金森女貞）～1.56 mg·L-1（八角金盤）和2.59（金森女貞）～11.80 mg·L-1（八角金盤），差異分別達到了19.5和3.9倍；根分支數對應的EC10和EC50的變化范圍分別為0.08（金森女貞）～1.27 mg·L-1（八角金盤）和2.40（金森女貞）～10.30 mg·L-1（八角金盤），差異分別達到了15.8和4.3倍。以上結果表明，對于毒性閾值較大的植物，如八角金盤，較高劑量的Cd處理才能抑制植物生物量減少50%，說明其幼苗對Cd脅迫具有較強的抗性。Cd對植物不同指標的毒害閾值EC50的差異倍數小于EC10，其最大值與最小值差異的變化范圍為3.9～4.6倍。研究表明，在一定區(qū)域范圍內，土壤重金屬對植物生長的毒性閾值EC50的變化范圍小于EC10[26-27]，可見EC50的變化更穩(wěn)定，因此，本研究選擇EC50的變化范圍來比較不同測試終點對Cd毒害的敏感性，通過比較地上部分和根系生長指標的毒性閾值變化范圍，大部分根系生長指標EC50最大值和最小值的差異較小，且較低含量的Cd即可抑制10%或50%根系指標生長的目的，說明Cd2+可直接與根系表面接觸，并將大部分累積于植物的根系中，之后傳導至植物地上部分。對于地上部分的干重，其毒性閾值EC50變化范圍小于鮮重和株高。由于幾何平均數受極端值的影響較算術平均數小[28]，因此，本研究通過比較不同測試終點的幾何均值來確定不同測試終點的敏感性，得到測試終點敏感性順序為根分枝數＞總根長＞總根表面積＞總根尖數＞地上部分干重＞株高＞地上部分鮮重，測試終點的幾何平均值變化范圍為5.24（根分支數）～6.10 mg·L-1（地上部分鮮重），說明敏感性存在一定的差異。根據測試指標的閾值變化范圍（圖4）來看，根系指標對Cd毒性更為敏感，株高和植物生物量差異不明顯。

圖3 Cd對不同灌木幼苗根分支數的劑量-效應關系Fig.3 Dose-response curves of cadmium on root branch number of shrub plants seedlings

圖4 12種植物不同測試終點的毒性閾值EC50Fig.4 Toxicity thresholds EC50of different endpoints for 12 shrub plants

2.3 基于敏感測試終點的植物物種敏感性分布

由于根分枝數是對Cd毒性最敏感的根系生長測試指標，地上部分干重是對Cd毒性最敏感的地面測試指標，分別以這2個指標為例，分析不同測試指標下，不同灌木幼苗對Cd毒性的敏感性分布。本研究采用Burr-Ⅲ模型對Cd對植物幼苗生長的地上部干重和根分支數的毒性閾值EC50的數據進行擬合，獲得12種灌木幼苗對Cd毒性的敏感分布曲線。如圖5所示，以地上部干重為測試指標時，植物對Cd毒害的敏感性順序為金森女貞＞海桐＞杜鵑＞南天竹＞法國冬青＞灑金珊瑚＞十大功勞＞金邊黃楊＞紅葉石楠＞茶梅＞紅花繼木＞八角金盤；以根分支數為測試終點時，得到植物對Cd敏感性順序為金森女貞＞海桐＞南天竹＞法國冬青＞十大功勞＞紅葉石楠＞茶梅＞金邊黃楊＞灑金珊瑚＞八角金盤。比較這2個測試終點，發(fā)現(xiàn)大部分植物的敏感性分布的趨勢基本一致，如金森女貞和海桐為12種灌木植物中對Cd毒害最敏感的植物，而八角金盤則為12種灌木植物中對Cd毒害最具抗性的品種。通過SSD曲線可以獲得污染物的環(huán)境質量標準和生態(tài)風險保護的臨界值，即保護生態(tài)系統(tǒng)中大部分物種的污染物含量，一般使用5%危害含量（hazardous content 5%，HC5），即危害5%物種時對應的含量污染物。本研究推導出基于地上部干重和根分支數的Cd植物毒性的HC5值分別為2.86和2.68 mg·L-1，差異較小。

圖5 12種植物基于地上部干重和根分支數EC50的SSD曲線Fig.5 SSD curves of 12 plant species based on the threshold value EC50of shoot fresh and dry weight，respectively

3 討論

Cd脅迫會影響植物的生長，其中株高、生物量等可作為評價植物對Cd毒性敏感性最直觀和重要的指標。本研究中發(fā)現(xiàn)低劑量Cd（0.5 mg·L-1）脅迫可促進部分植物幼苗的生長，在其他植物的Cd毒性研究中，也發(fā)現(xiàn)了類似的低劑量刺激效應，如低含量Cd（≤1 mg·L-1）脅迫下，水蓼可通過維持自身較高的酶活性來降低Cd2+對植物細胞的傷害并刺激植物生長[29]；土壤低含量（5 mg·kg-1）Cd脅迫促進了小報春株高和根長的伸長[30]。前人研究表明，低含量毒物刺激作用可能是一個可重現(xiàn)和普遍的生物學現(xiàn)象[31]，其出現(xiàn)在低于未觀察到不良反應的劑量下，且該反應是非隨機分布的，其值大于對照組[32]；低含量毒物刺激效應的機理較復雜[33]，可能是由于Cd刺激了植物酶活性，提高了抗氧化能力和植物對Cd的耐受能力，刺激了植物生長[34]。Cd作為植物的一種非必需元素，當Cd含量超過一定值時，會直接或間接抑制植物的生理生化過程[35]，如呼吸作用、光合作用、蒸騰作用和抗氧化功能，導致植物生長和生物量受到影響，表現(xiàn)出植株矮小、葉片失綠黃化、根生長受抑制和生物量下降等癥狀[36-40]。Cd對植物產生毒害作用的原因可能是通過抑制酶活性，阻斷代謝重要分子的官能團，置換或取代基本元素以及破壞膜完整性而改變細胞在分子水平上的多種生理過程[41]，如Cd2+通過膜結合轉運體進入植物細胞后，與各種功能性和結構蛋白及膜脂的功能位點結合，從而引起膜脂過氧化作用，使植物體內的活性氧增加，進而損傷DNA，影響蛋白質合成[42-43]。

表2 Cd對植物根系生長的毒性閾值及其95%的置信區(qū)間Table2 Toxicity threshold of cadmium to plant root growth and 95% confidence intervals （mg·L-1）

本研究中，大部分灌木植物對Cd毒性的敏感性順序，與最早呈現(xiàn)毒性癥狀的時間順序基本一致，如金森女貞和海桐為12種灌木植物中對Cd毒害最敏感的植物，而八角金盤則為12種灌木植物中對Cd毒害最具抗性的品種。八角金盤作為一種常見的園林綠化植物，其單葉滯塵量大，對Cd也有較高的吸收量[44]，可考慮將其作為土壤重金屬Cd污染土壤生態(tài)修復的樹種。由于毒性癥狀觀察帶有一定的主觀性，有時不能客觀反映真實的毒害狀況，如觀察發(fā)現(xiàn)南天竹的表觀毒害癥狀并不顯著，而其對Cd的毒性卻較敏感，其幼苗地上部分生物量受Cd毒性影響較大。王廣林等[45]研究表明，南天竹的根對Cd有較強的富集能力，其對Cd污染土壤有較強修復能力；海桐對Cd的富集能力差，為低修復能力的植物。因此，在考慮植物對重金屬污染土壤的生態(tài)修復時，應優(yōu)先考慮重金屬對植物毒性的敏感性，同時，還需考察該植物對重金屬的吸收累積規(guī)律。

HC5作為生態(tài)環(huán)境的安全閾值，可作為生態(tài)風險評價指標，定量反映污染物的風險水平[46-47]。本研究結果表明，基于地上部干重和根分支數的Cd植物毒性的HC5值分別為2.86和2.68 mg·L-1。研究表明，在Cd處理高于HC5值時，很多植物生長才表現(xiàn)出對Cd脅迫的抑制作用，如胡國濤[48]發(fā)現(xiàn)，當水培溶液中鎘含量為5.60 mg·L-1時，竹柳可以正常生長，毒害效應不明顯；楊嵐鵬等[49]發(fā)現(xiàn)，欒樹幼苗對含量小于25 mg·L-1的Cd表現(xiàn)為高耐受性，高于該含量時Cd對欒樹產生明顯的毒害作用，抑制欒樹的生長。因此，探明水培溶液中的HC5值對于Cd的植物毒性及其敏感性差異篩選具有一定的參考意義。實際土壤環(huán)境較水培條件更復雜，本研究的HC5值與土壤中得到的Cd的HC5值可能存在一些差異。因此，下一步有必要深入研究灌木植物對土壤Cd毒性敏感性、抗性和富集特征規(guī)律，并結合已有的毒理數據，豐富植物物種信息，推導林地土壤重金屬Cd的HC5，為林地土壤重金屬環(huán)境質量標準的制定和生態(tài)風險評價提供參考依據。