HPLC法同時(shí)測定白喉烏頭中雙酯型二萜生物堿含量

阿不力米提·玉麥爾，阿卜杜拉·玉蘇普，庫爾班江·巴拉提

1. 喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（喀什 844007）；2. 伊犁師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院（伊寧 835000）

烏頭類生物堿是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜和生物活性較強(qiáng)的中藥成分，絕大部分存在于烏頭屬（Aconitum）和翠雀屬（Delphinium）植物中，是烏頭類有毒中藥類的主要化學(xué)成分[1]。烏頭類生物堿被認(rèn)為是烏頭屬中藥材的特征生物活性成分，但大多數(shù)烏頭屬藥材都含有大量的有毒雙酯型烏頭堿，治療量與中毒量非常接近，極易發(fā)生中毒事件[2]。

烏頭屬植物在中國有170余種，資源十分豐富[3]。烏頭類有毒中藥能祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛，常用于風(fēng)濕麻痹[4]。關(guān)節(jié)疼痛，心腹冷痛，寒疝作痛，麻醉止痛等。從古至今被廣泛應(yīng)用于臨床，如《傷寒論》載方113個(gè)。其中，附子者20個(gè)，占總載方量的18%[5]。《中國藥典（2005版）》收載的烏頭屬中藥有川烏、草烏、制川烏、制草烏、草烏葉、附子，其中附子炮制品包括鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、炮附片等[6]。

在新疆天山北坡廣泛分布一種多年生草本植物交烏頭草，其主要有效化學(xué)成分是烏頭堿。因?yàn)躅^草外形，色澤與當(dāng)年生草本植物野芹菜極為相似，隨著回歸大自然盒綠色天然植物的食用，烏頭草中毒日益增多[7]。

通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、串聯(lián)質(zhì)譜等方法對從烏頭類有毒中藥中分離的烏頭生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，已發(fā)現(xiàn)的生物堿有400多種[8]。如：烏頭中的劇毒成分烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等；白花瓜葉烏頭中的大渡烏頭堿、13,15-雙去氧烏頭堿、吲哚烏頭堿、景陽堿、塔拉薩敏、查斯曼寧等幾種去甲二萜生物堿；甘青烏頭中異葉堿、阿替素、苯甲酰赫拉替辛坦烏辛、塔拉薩敏等；吉林烏頭中C19二萜生物巨針堿、β-谷甾醇、槲皮素、蘆丁等其他類成分[9]；瓜葉烏頭根中分得氨茴酰牛扁堿、牛扁堿、8-酰滇烏堿、偽烏頭寧、尼奧寧、6-表弗斯生、滇烏堿、印烏堿、查斯曼寧等12個(gè)C19二萜生物堿；工布烏頭的塊根中黃草烏堿丁、黃草烏堿丙等9個(gè)C19二萜生物堿直緣烏頭根中分得黃草烏堿甲、草烏甲素、膝烏堿、14-乙酰塔拉薩敏、茶花堿等11個(gè)二萜生物堿，其中黃草烏堿甲和茶花堿是首次從該植物中分離得到[10]；多根烏頭中分得12-表-歐烏堿、烏頭堿、脫氧烏頭堿、新烏堿和準(zhǔn)葛爾烏頭堿；麗江烏頭中分得麗烏堿等，東川烏頭中分旬滇羥堿。

有研究初步證實(shí)二萜雙脂型烏頭類生物堿的水解途徑。二萜雙酯型烏頭類生物堿可先水解，失去乙?；蓡沃投粕飰A（如苯甲酰烏頭堿），繼續(xù)水解失去苯甲?；蔀躅^原堿[11]。

烏頭類生物堿的檢測方法有酸堿滴定法、分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法-質(zhì)譜法等。試驗(yàn)用高效液相色譜法測定附子和白喉烏頭中的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的含量。高效液相色譜法因其柱效高、分離好、穩(wěn)定方便，能同時(shí)測定烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿，故應(yīng)用最多。UV檢測器因其靈敏度高、穩(wěn)定性好，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用，適用于生藥、飲片、藥酒中烏頭堿的檢測。水-甲醇-二乙胺（75∶25∶0.1，V/V）被用于烏頭類生物堿的組織分布[12]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

白喉烏頭（2020年8月16日采自特克斯縣科克特勒克鄉(xiāng)）。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

新烏頭堿對照品（批號(hào)B10050，規(guī)格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；烏頭堿對照品（批號(hào)B10051，規(guī)格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；次烏頭堿對照品（批號(hào)B10049，規(guī)格20 mg，上海士鋒生物科技有限公司）；無水已醇（分析純，成都市料龍化工試劑廠）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

FA2104型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；星火牌C型玻璃儀器氣流烘干器（長城料工貿(mào)有限公祠）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀（LC-2010，日本）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

采用Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相∶甲醇-水（20∶80）；流速0.8 mL/min；檢測波長235 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿分離度良好，且樣品中的其他成分不干擾測定。

1.2.2 對照品及供試品溶液的制備

1.2.2.1 供試品溶液的制備

取白喉烏頭，置于研缽中粉碎后，稱取5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入0.5 mL氨試液，精密加入無水乙醇25 mL，超聲波提取45 min，放冷，稱定質(zhì)量。用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖均，過濾，濾液分別加入50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解，并稀釋至度，搖均，即得。

1.2.2.2 對標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取5 mg新烏頭堿、1.75 mg烏頭堿和2.5 mg次烏頭堿，分別置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解并稀釋刻度，搖均，即得。

1.2.2.3 流動(dòng)相的選擇

由于3種待測的烏頭類生物堿是堿性，且3種烏頭類生物堿的pH為7～10，所以流動(dòng)相的pH會(huì)影響3種烏頭類生物堿的出峰時(shí)間。當(dāng)流動(dòng)相使用甲醇-水（20∶80，V/V）流動(dòng)時(shí)，各種待測物質(zhì)的出峰順序發(fā)生改變，但是各種物質(zhì)間都達(dá)到很好的分離。所以試驗(yàn)選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

1.2.2.4 相應(yīng)波長的選擇

將一定濃度的3種烏頭類生物堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在200～250 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)高效液相色譜235 nm作為3種烏頭類生物堿的檢測波長。

1.2.2.5 提取方法

分別取約5 g 2種樣品細(xì)粉，精密稱定，分別置于50 mL錐形瓶中，加入氨水0.5 mL，加入25 mL無水乙醇，稱其質(zhì)量，混勻，超聲（功率100 kW）45 min，過濾，濾液分別加入50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶液溶解并并稀至刻度，搖均，即得。

1.2.2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取2，4，6，8和10 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度試驗(yàn)

取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿質(zhì)量濃度分別為5，1.75和2.5 μg/mL的對照品貯備液（將1.2.2.1的溶液稀釋100倍）10 μL進(jìn)樣，連續(xù)5次，測定3種生物堿的峰面積積分比值，計(jì)算精密度（SRSD）。結(jié)果顯示，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿SRSD分別為0.33%，0.36%和0.42%，表明精密度良好。

圖1 準(zhǔn)溶液色HTPLC圖

圖2 樣品HTPLC圖

表1 精密度試驗(yàn)

1.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.2.2.2的供試品溶液，分別于0，4，8，16和24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿SRSD分別為1.1%，1.6%和1.8%，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

表3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批附子和白喉烏頭藥材3份，按1.2.2.1的方法制備成供試品溶液，并按1.2.1的色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示，樣品中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿平均含量的SRSD分別為0.97%，1.3%和1.5%。

1.2.3.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取已測知含量的樣品5分，每份0.19 g，分別精密加入1.00 mL新烏頭堿對照品溶液（質(zhì)量濃度29.0 μg/mL）、1.00 mL烏頭堿對照品溶液（質(zhì)量濃度20.75 μg/mL）和1.00 mL次烏頭堿對照品溶液（質(zhì)量濃度0.200 μg/mL），按1.2.2.2的方法制備供試品液，測定含量并按式（1）計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)注曲線的繪制

圖4 烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積值為縱坐標(biāo)，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品的質(zhì)量濃度C（μm/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖3～圖5所示。新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的曲線方程分別為y=6 075x-131.8（r=0.99921），y=70 664x-1455.3，r=0.99918，y=857821x-7 967.6，r=0.99916。新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿分別在1～5，0.35～1.75和0.5～2.5 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖3 新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)（n=5）

2.3 樣品測定

按1.2.2.1的方法制備供試品溶液，按1.2.1的色譜條件進(jìn)樣測定，根據(jù)3個(gè)成分的線性回歸方程，對附子和白喉烏頭提取液中的成分含量進(jìn)行計(jì)算，如式（2）所示。

表5 樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

在試驗(yàn)條件下，對照品及試樣中各組分均能達(dá)到基線分離，且峰形良好。用無水乙醇作提取劑，超聲提取45 min，提取效率最高。建立的高翔液相色譜法同時(shí)測定附子和白喉烏頭中新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量的方法，經(jīng)方法學(xué)考察，全部達(dá)到檢測要求。通過測定不同批號(hào)的該草烏，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量具有一定差異性。