歐姆加熱和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)豬肉糜制品品質(zhì)特性的影響

戴妍，盧憶，鄔威2,，高曉光3,，張靜，戴瑞彤*

1. 重慶化工職業(yè)學(xué)院環(huán)境與質(zhì)量檢測(cè)學(xué)院（重慶 401228）；2. 西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院（重慶 400715）；3. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（石家莊 050000）；4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）

近年來(lái)，隨著消費(fèi)人群對(duì)健康食品和高質(zhì)量食品的認(rèn)識(shí)明顯提高，越來(lái)越多的消費(fèi)者追求高品質(zhì)食品。如何在提升食品營(yíng)養(yǎng)健康水平的前提下改良食品品質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。在肉品研發(fā)領(lǐng)域，如何生產(chǎn)出更為健康、低成本、環(huán)境友好的肉制品以滿足市場(chǎng)需要，一直以來(lái)也是研究熱點(diǎn)之一，越來(lái)越多的研究涉及以肉糜為基礎(chǔ)，輔以淀粉、蛋清、卡拉膠、褐藻膠、酶制劑等黏合劑的低鹽/減鹽重組肉制品方向[1-2]。

有很多酶體系（多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶）主要用于固定食品中蛋白質(zhì)系統(tǒng)，它們通過(guò)在食品體系中蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵，通過(guò)粘合食品成分，促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)凝膠的形成，從而生產(chǎn)出較好質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)的產(chǎn)品。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（transglutaminases，TG）在提高肉制品質(zhì)構(gòu)方面的應(yīng)用最為廣泛[3]。即使食品中食鹽量較低，通過(guò)添加一定量的蛋白酶催化肉制品內(nèi)部的交聯(lián)反應(yīng)，提升內(nèi)部成分聯(lián)結(jié)，從而形成較好的質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)。外源性微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（microbial transglutaminase，MTGase）屬于谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的一種，可以催化肌動(dòng)球蛋白、明膠和膠原蛋白中ε-（γ-glutamyl）-lysine共價(jià)鍵的形成[4-5]，而且它可以作為很強(qiáng)的黏合劑，在加工過(guò)程中可以顯著增強(qiáng)肉品的彈性、硬度和強(qiáng)度[5]，而添加蛋清（egg white）、魔芋粉（konjac flour，KF）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidases，PPO）、漆酶（laccases）、酪氨酸酶（tyrosinase）等也有助于提高蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用，促進(jìn)肉制品良好品質(zhì)形成[3]。

歐姆加熱是一種新型快捷的電極加熱方式，主要通過(guò)誘導(dǎo)食物自身導(dǎo)電達(dá)到加熱的目的。歐姆加熱比傳統(tǒng)加熱食品有諸多優(yōu)點(diǎn)，如有更好的感官特性和食用品質(zhì)等[6-8]。前人研究表明，快速歐姆加熱方式顯著提高魚(yú)糜凝膠保水性能[9]。同時(shí)使用歐姆加熱和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（0.5% TG酶）處理制備豬肉糜制品方向的研究國(guó)內(nèi)外還是空白，通過(guò)對(duì)比水浴加熱，探明歐姆加熱法制備的豬肉糜制品特點(diǎn)，由于歐姆加熱本身對(duì)于肉中蛋白質(zhì)變性程度并不比水浴加熱高，對(duì)于肉糜制品質(zhì)構(gòu)（凝膠）形成可能沒(méi)有太大優(yōu)勢(shì)，此次試驗(yàn)通過(guò)考慮加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，考察能否通過(guò)歐姆加熱這種快速加熱的方式達(dá)到與通常水浴加熱肉糜制品同樣的效果，從而提升肉糜制品加工效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬肉背最長(zhǎng)?。ㄊ惺?，剔去可見(jiàn)脂肪，放入攪碎機(jī)攪碎，每次試驗(yàn)所需肉量由試驗(yàn)處理組的數(shù)量決定，共做4次重復(fù)性試驗(yàn)）；雞蛋白粉（食品級(jí)，北京九州天瑞科技有限公司）；鮮蛋黃液（北京德青源公司）；谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（食品級(jí)，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司）；多聚磷酸鹽（食品級(jí)，青島菲利特食品配料有限公司）；KCl、NaCl、MgCl2、酒石酸鉀鈉、CuSO4、NaOH等（國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；蛋白酶抑制劑PMSF（Amresco公司）；5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、SDS和牛血清白蛋白等（生化試劑，北京索來(lái)寶有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室自制歐姆加熱設(shè)備，主要由交流電源、支架箱、加熱單元、電流傳感器、DHC8P電壓表、DPH8P電流表、熱電偶溫度計(jì)等組成[10]，其中加熱單元設(shè)計(jì)為內(nèi)徑4.2 cm、長(zhǎng)度16 cm；調(diào)和機(jī)（德國(guó)博朗）；DK-8B電熱恒溫水槽（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；CR-400色差計(jì)（日本美能達(dá)公司）；Evolution60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)熱電公司）；TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀（英國(guó)Stable Micro Systems公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell system蛋白電泳儀（美國(guó)Biorad公司）；凱氏定氮儀（德國(guó)Foss公司）；S-3400N掃描電鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬肉糜制品制備過(guò)程

準(zhǔn)備1 000 g新鮮豬肉糜，依次加入0.3%三聚磷酸鹽、10%鮮蛋黃液、10%脫水蛋白粉及30%冰水，添加TG酶處理組肉糜還需要將0.5% TG酶混合在肉糜中，置于調(diào)和機(jī)混合（中低速檔位），肉糜中心溫度不超過(guò)15 ℃，分別取400 g混合好的豬肉糜用于歐姆加熱和水浴加熱。

歐姆加熱（不添加TG酶）：交流電源（50 Hz、3.5 kW）、電壓梯度（9 V/cm）對(duì)豬肉糜進(jìn)行加熱，豬肉糜制品的最冷溫度＞95 ℃時(shí)，立即關(guān)閉電源后取出冷卻至室溫。

水浴加熱（不添加TG酶）：將混合好的肉糜灌入塑料腸衣（內(nèi)徑4.2 cm、長(zhǎng)度16 cm）中，將肉糜帶著腸衣直接放入水浴加熱槽子（100±2 ℃）進(jìn)行加熱，豬肉糜制品最冷溫度＞95 ℃時(shí)，立即關(guān)閉電源后取出冷卻至室溫。

歐姆加熱（添加TG酶）：將肉糜采用歐姆加熱到中心溫度（37±2 ℃），立即關(guān)閉電源，保溫30 min后再加熱，豬肉糜制品最冷溫度＞95 ℃時(shí)，立即關(guān)閉電源后取出冷卻至室溫。

水浴加熱（添加TG酶）：將肉糜灌入塑料腸衣后，放入水浴槽子進(jìn)行加熱，肉糜中心溫度達(dá)到37± 2 ℃，關(guān)閉電源，保溫30 min后加熱豬肉糜制品最冷溫度＞95 ℃時(shí)，取出冷卻至室溫，將豬肉糜樣品用于如下指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 蒸煮率損失和壓榨損失分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]的方法，蒸煮率損失采用稱重法測(cè)定，待樣品加熱冷卻至室溫后，用濾紙輕輕擦拭肉糜制品表面的水分后用天平稱其質(zhì)量。按照式（1）進(jìn)行計(jì)算。壓榨損失（expressible moisture）用離心法測(cè)定，肉樣體積為1.5 cm×1.5 cm×2.5 cm，質(zhì)量3.76±0.29 g，肉樣用4層濾紙包裹后放置于50 mL離心管中。樣品在4 ℃，用4 000×g離心40 min后稱其質(zhì)量，按式（2）進(jìn)行計(jì)算。測(cè)定4個(gè)處理組豬肉糜樣品的蒸煮率損失和壓榨損失。

1.3.3 顏色分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]的方法，分別切開(kāi)4個(gè)處理組豬肉糜樣品，在切面上隨意選取4個(gè)點(diǎn)，用色差計(jì)測(cè)定色澤參數(shù)值（L*、a*、b*）。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9，13]的方法，將冷卻好的4個(gè)處理組豬肉糜樣品在室溫下（25 ℃）冷卻2 h后，測(cè)定其質(zhì)構(gòu)指標(biāo)，將3～5塊平行的樣品（直徑4 cm、高度2 cm）放在質(zhì)構(gòu)儀臺(tái)面上，用直徑為6 mm的金屬圓形探刺頭刺破樣品（刺破深度1.5 cm，探頭下降速度1 mm/s，每塊樣品刺3～6次），測(cè)試參數(shù)包括破碎力（g）和形變（cm）。

1.3.5 豬肉糜肌原纖維蛋白的提取及SDS-PAGE分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法，將2 g切碎的豬肉糜樣品加入到pH 6.5的20 mL肌纖維提取緩沖液（150 mmol/L氯化鈉、25 mmol/L氯化鉀、3 mmol/L氯化鎂，4 mmol/L EDTANa2和1 mmol/L PMSF）中。按10000×g勻漿10 s，將樣液離心（4 ℃，按5000×g離心30 min），含有肌原纖維蛋白沉淀物的樣液用緩沖液（50 mmol/L氯化鉀和5 mmol/Lβ-巰基乙醇）沖洗3遍，重復(fù)上述勻漿和離心過(guò)程。用此溶液提取沉淀，勻漿，得到的懸濁液為樣品液肌原纖維蛋白的提取液。懸濁液的濃度用雙縮脲法測(cè)定。將提取4個(gè)處理組豬肉糜樣品的肌原纖維蛋白，采用SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度12.5%，濃縮膠濃度4%。蛋白樣品按1∶1與樣品緩沖液[含有8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.025 mol/L Tris（pH 6.8）、0.075 mol/L DTT、0.104 mol/L SDS和0.05%溴酚蘭]混合?；旌虾蟮臉悠芬河梅兴訜? min。取約20 μg肌原纖維蛋白液上樣（采用蛋白marker作為對(duì)照）。凝膠用小型的Bio-Rad蛋白電泳儀做分離，采用恒流模式（30 mA）保持1.5 h后，取出凝膠，用考馬斯亮藍(lán)染液R-250（1 g/L）染色1 h后，用脫色液（120 mL/L甲醇和75 mL/L乙酸）隔夜脫色，脫色后的凝膠用凝膠成像儀拍照。

1.3.6 凝膠游離巰基含量分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]的方法，利用5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）比色法測(cè)定4個(gè)處理組豬肉糜樣品的游離巰基含量，將2.0 g肌肉加入50 mL pH8.0緩沖液（5.0% SDS，0.10 mol/L Tris）。勻漿后將樣品液放入80 ℃水浴中加熱30 min，離心（5000×g，20 min），濾液中的蛋白濃度用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定（280 nm）。樣品液用緩沖液稀釋至1.5 mg/mL，測(cè)試樣品液將0.5 mL上述樣品液、2.0 mL Tris緩沖液（0.10 mol/L、pH8）及0.50 mL的DTNB溶液（含有10 mmol/L DTNB，0.10 mol/L Tris，pH8）混合?？瞻讟悠芬簩?% SDS溶液0.50 mL，0.10 mol/L Tris緩沖液2.0 mL以及DTNB溶液0.50 mL混合后于412 nm比色，吸光系數(shù)用11400 L/（mol·cm）計(jì)算，總游離巰基含量的結(jié)果表示為nmol/mg。

1.3.7 凝膠掃描電鏡分析

將4個(gè)處理組的豬肉糜樣品切成5 mm×5 mm×5 mm小塊，用2.5%戊二醛溶液固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗，1%鋨酸固定，依次使用30%，50%，70%，80%，90%和100%乙醇脫水后，干燥噴金后置于Hitachi S-3400N掃描電鏡下觀察[16]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行分析，ANOVA及Duncan法用于所有處理組各指標(biāo)顯著性差異（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐姆加熱與水浴加熱對(duì)豬肉糜樣品的加熱時(shí)間影響

在不加入TG酶的前提下，歐姆加熱組和水浴加熱組豬肉糜樣品的加熱時(shí)間分別為6±1 min和35±2 min。在加入TG酶后，歐姆加熱組和水浴加熱組豬肉糜樣品的加熱時(shí)間分別為37±2 min和67±1 min。歐姆加熱肉糜制品所需時(shí)間為水浴加熱處理組的1/6～1/2。

2.2 顏色變化分析

4個(gè)處理組豬肉糜樣品的顏色變化分析如表1所示。在所有4個(gè)豬肉糜處理組樣品中，亮度值（L*）與黃度值（b*）無(wú)顯著性差異（p＞0.05），歐姆加熱組肉糜樣品（無(wú)TG酶）的a*（-0.50）顯著低于（p＜0.05）水浴加熱（無(wú)TG酶）組（0.60）。原因可能是此次試驗(yàn)歐姆加熱肉糜制品的終點(diǎn)溫度（95～120 ℃）比水浴加熱的要高（95～100 ℃），造成豬肉糜樣品a*的下降可能引起一定程度的褪色，可能與肉糜內(nèi)部色素蛋白含量、肌原纖維蛋白降解或者氧化，以及蛋液差異等有一定關(guān)系[17]，但總體而言，歐姆加熱與水浴加熱肉制品顏色差異不大，苑善振等[18]也認(rèn)為不同保溫時(shí)間的歐姆加熱與水浴加熱組均在紅度值a*和亮度值L*上無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。

表1 歐姆加熱和水浴加熱（添加或不添加TG酶）肉糜制品的顏色變化分析

2.3 蒸煮率、壓榨損失及游離巰基含量分析

表2顯示4個(gè)處理組豬肉糜樣品蒸煮率損失、壓榨損失及游離巰基含量分析。巰基的氧化可能導(dǎo)致食品內(nèi)部二硫鍵形成，同時(shí)可能會(huì)加強(qiáng)肉制品內(nèi)部組織交聯(lián)，形成較為堅(jiān)硬的組織結(jié)構(gòu)[9]?？傮w來(lái)看，4個(gè)處理組豬肉糜樣品的蒸煮率損失以及游離巰基含量無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。歐姆加熱組豬肉糜樣品（無(wú)TG酶）的壓榨損失（20.06%）顯著低于水浴加熱處理組（無(wú)TG酶）的壓榨損失（24.26%）（p＜0.05），但是當(dāng)加入0.5% TG酶時(shí)，歐姆加熱和水浴加熱處理組的豬肉糜樣品的壓榨損失無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。壓榨損失在一定程度上反映了肉的保水性變化，由于升溫速率快，歐姆加熱肉糜制品可能比水浴加熱處理組含有更多的水分，也就是有較好的保水性能。Tadpitchayangkoon等[9]認(rèn)為，無(wú)論有沒(méi)有蛋清的加入，歐姆加熱處理的魚(yú)糜制品顯示出更好的保水性能。Ngel-Rendón等[19]采用20 V/cm加熱豬肉2～3 min，認(rèn)為保水性與平底鍋加熱11 min保水性無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)結(jié)果總體與Tadpitchayangkoon等[9]和Ngel-Rendón等[19]的研究結(jié)論相似。

表2 歐姆加熱和水浴加熱（添加或不添加TG酶）肉糜制品的蒸煮率、壓榨損失及巰基含量分析

2.4 質(zhì)構(gòu)分析

表3顯示4個(gè)處理組豬肉糜制品質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析。歐姆加熱組（無(wú)TG酶）豬肉糜樣品的破碎力、形變以及凝膠強(qiáng)度與水浴加熱處理組（無(wú)TG酶）樣品無(wú)顯著性差異。歐姆加熱處理組（0.5% TG酶）樣品的破碎力（1 305.34 g）和凝膠強(qiáng)度（1 184.21 g·cm）顯著高于（p＜0.05）歐姆和水浴處理組（無(wú)TG酶）（p＞ 0.05），歐姆加熱處理組豬肉糜（0.5% TG酶）樣品的破碎力（1 305 g）顯著高于水浴加熱處理組樣品（1 166.54 g）（p＜0.05）。Dondero等[13]也認(rèn)為加入0.5% TG酶的牛肉蛋白樣品凝膠強(qiáng)度相比對(duì)照組提升了88%（p＜0.05）。Tadpitchayangkoon等[9]認(rèn)為歐姆加熱雖然加熱速度快，但其蛋白質(zhì)降解與解聚水平比較輕微，最終加熱后的肉制品質(zhì)構(gòu)及凝膠水平可能弱于傳統(tǒng)水浴加熱處理組。范大明等[20]認(rèn)為可能加熱速率過(guò)快，蛋白質(zhì)分子就沒(méi)有足夠的時(shí)間變性展開(kāi)而影響其最終的聚集，而試驗(yàn)通過(guò)適當(dāng)提高歐姆加熱肉糜制品的終點(diǎn)溫度范圍，使歐姆加熱與水浴加熱后的豬肉糜凝膠強(qiáng)度水平相當(dāng)。

表3 歐姆加熱和水浴加熱（添加或不添加TG酶）肉糜制品質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)分析

2.5 電泳分析

圖1顯示的是4個(gè)處理組豬肉糜樣品肌纖維蛋白SDS-PAGE分析。從圖1可以看出，4個(gè)處理組豬肉糜蛋白條帶整體差異不大，歐姆加熱結(jié)合TG酶處理組肉糜的MHC條帶略深于其他處理組，其他條帶沒(méi)有明顯差異，可能應(yīng)用歐姆加熱這種快速加熱的方式可以有效抑制肉品內(nèi)部?jī)?nèi)源酶作用，試驗(yàn)結(jié)果與苑善振等[18]和Tadpitchayangkoon等[9]研究的肉糜制品結(jié)論較為一致。

圖1 歐姆加熱和水浴加熱（添加或不添加TG酶）豬肉糜制品蛋白電泳分析

2.6 掃描電鏡分析

圖2顯示4個(gè)處理組豬肉糜樣品掃描電鏡分析。歐姆加熱和水浴加熱后的豬肉糜樣品（無(wú)TG酶）無(wú)明顯差異，形成的內(nèi)部結(jié)構(gòu)是多孔松散的。水浴加熱豬肉糜樣品（含0.5% TG酶）內(nèi)部結(jié)構(gòu)仍然是多孔松散的，而歐姆加熱豬肉糜樣品（含0.5% TG酶）的孔隙略較，結(jié)構(gòu)更為緊密。Chin等[16]認(rèn)為，TG酶與肉中蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)可以降低肌纖維內(nèi)部之間的孔隙，而不加入TG酶的樣品結(jié)構(gòu)更為松散。Ngel-Rendón等[21]研究平底鍋、歐姆加熱、真空以及慢燉方式加熱豬肉到相同終點(diǎn)溫度（65～70 ℃），肌纖維結(jié)構(gòu)表明，歐姆加熱的肌纖維結(jié)構(gòu)更為緊密、空隙較小。試驗(yàn)結(jié)果與Chin等[16]和Ngel-Rendón等[21]研究結(jié)論大致一致。

圖2 歐姆加熱和水浴加熱（添加或不添加TG酶）豬肉糜制品掃描電鏡分析（×500倍）

3 結(jié)論

歐姆加熱豬肉糜樣品處理組的加熱時(shí)間為水浴加熱處理組時(shí)間的1/6～1/2，沒(méi)有經(jīng)過(guò)TG酶處理時(shí)，歐姆加熱處理組a*（-0.5）和壓榨損失（20.06%）顯著低于水浴加熱處理組凝膠（p＜0.05），其他指標(biāo)（質(zhì)構(gòu)特性、凝膠結(jié)構(gòu)、電泳分析）2個(gè)處理組之間無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò)0.5% TG酶處理時(shí)，歐姆加熱處理組樣品的破碎力（1 305.34 g）和凝膠強(qiáng)度（1 184.21 g·cm）顯著高于水浴加熱處理組樣品（p＜0.05），其形成的內(nèi)部結(jié)構(gòu)略為致密。經(jīng)過(guò)0.5% TG酶處理的豬肉糜樣品肌纖維蛋白MHC條帶略為深于未經(jīng)過(guò)TG酶處理組樣品。其他指標(biāo)無(wú)明顯差異，因此歐姆加熱（經(jīng)0.5% TG酶）肉糜制品可以形成與傳統(tǒng)水浴加熱處理組相當(dāng)?shù)氖秤闷焚|(zhì)，后續(xù)研究可針對(duì)TG酶的酶解條件進(jìn)行摸索，結(jié)合歐姆加熱，進(jìn)一步提升肉品的食用品質(zhì)。