茯神中乳酸脫氫酶抑制劑的提取篩選與質譜分析

莊思遠，周旭，劉箬瑤，劉春明，李賽男，張語遲

長春師范大學中心實驗室（長春 130032）

茯神（Poria cumRadix Pini）是多孔菌科（Polyporaceace）真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]的干燥菌核中間抱有松根的部分。茯神中主要含有多糖類和三萜類化學成分[1-3]，其三萜類化合物是主要的藥效成分之一[4]?，F(xiàn)代研究表明，三萜具有抗炎[5]、抗腫瘤[6]、抗病毒[7]、抗氧化[8]等作用。

常用的三萜提取方法有浸提法、回流法、超聲微波協(xié)同提取法。傳統(tǒng)的浸提法，提取時間長、能耗高、提取率低。超聲提取是一種新型的物理提取技術，能顯著提高活性成分得率[9-10]。此次試驗采用響應面法優(yōu)化超聲波輔助溶劑提取法提取茯神中總三萜成分，對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

乳酸脫氫酶是生物體內(nèi)糖酵解途徑中一種至關重要的氧化還原酶。腫瘤對人類健康有著極大的危害。乳酸脫氫酶在調(diào)節(jié)腫瘤細胞之間的能量代謝的過程中具有重要作用，使其成為抗腫瘤治療的新靶點[11]。以超濾技術作為快速活性篩選方法，以茯神三萜類化合物為研究目標，篩選茯神中乳酸脫氫酶抑制劑。

超濾質譜是“超濾”技術和“質譜”技術的一種完美結合[12-13]。首先選取生物酶如乳酸脫氫酶等作為與疾病相關的生物靶分子，將酶和小分子在體外進行孵化和結合，對結合產(chǎn)物進行分離并進行質譜分析，篩選能夠與酶結合的分子。超濾質譜技術適用于從傳統(tǒng)中藥中篩選乳酸脫氫酶抑制劑，該方法快速、靈敏，具有高通量的特點，為腫瘤等治療藥物的篩選與開發(fā)提供了科學有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料

茯神，長春市同仁堂藥店，經(jīng)長春師范大學中心實驗室劉春明教授鑒定為茯神。

1.1.2 供試試劑

乳酸脫氫酶（生產(chǎn)批號：1001918117），瑞士Fluka公司；齊墩果酸（批號：H04J9Z62784）、對照品3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸（Y03D7S25360）、茯苓酸（Y05J8S39371）和松苓新酸（Y08J7H8750），上海源葉生物科技有限公司；其他試劑（均為分析純），北京化工廠；PBS緩沖溶液，瑞士Bueke公司；UPLC流動相所用乙腈（色譜純），美國Thermo Fisher公司；試驗用水為超純水，美國Millipore公司。

1.1.3 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；分析型色譜柱（Sun FireTMC18色譜柱250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），美國Waters公司；恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；UPLC-Q Extractive MS超高效液相色譜-軌道阱高分辨質譜儀，美國Thermo Scientific公司；離心機，美國Sigma公司；超濾離心管，德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 茯神總三萜的提取工藝

將茯神置于攪拌機中絞碎，稱取1.0 g粉末于燒杯中，按一定比例加入適量體積分數(shù)的乙醇，在一定溫度和時間下進行超聲提取。提取結束后，將提取液進行過濾。將濾液定容到25 mL容量瓶中，備用。

1.2.2 茯神提取總三萜的單因素試驗

設計提取試驗中各單因素考察情況，如表1所示。除說明考察變量條件不同外，其他影響因素均設置為料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數(shù)90%、提取時間1 h、提取次數(shù)1次。

表1 茯神提取總三萜單因素試驗設計表

1.2.3 茯神總三萜提取率優(yōu)化

在單因素試驗基礎上，對總三萜提取的影響因素進行優(yōu)化。利用Design-Expert 8.0軟件設計中心組合試驗，進行分析，研究茯神總三萜的最佳提取工藝。試驗中茯神總三萜提取率的各影響因素與其對應的水平編碼設計如表2所示。

表2 響應面法分析因子及水平表

1.2.4 總三萜含量的測定

1.2.4.1 標準曲線繪制

準確稱取5.0 mg干燥的齊墩果酸標準品置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，稀釋至刻度搖勻，即為質量濃度0.2 mg/mL的標準品溶液。分別精確吸取0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6和0.7 mL該標準品溶液于5 mL容量瓶中，水浴揮盡溶劑，加0.3 mL新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，于75 ℃反應15 min，冰水冷卻，加冰醋酸至刻度，搖勻，在550 nm波長下測定吸光度[10]。以齊墩果酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得吸光度與濃度的回歸方程y=72.314x-0.066 4，R2=0.999。結果表明齊墩果酸在0.002～0.014 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關系，如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標準曲線

圖1 齊墩果酸標準曲線

1.2.4.2 茯神總三萜的提取及含量測定

準確稱取1.0 g茯神粉末，加入一定體積的乙醇溶液，在規(guī)定溫度下超聲提取一定時間后，減壓過濾，定容至25 mL容量瓶中，吸取2 mL，按照1.2.4.1測定樣品吸光度，按式（1）計算總三萜得率[14]。

采用單因素試驗考察超聲時間、超聲次數(shù)、料液比、乙醇體積分數(shù)對茯神總三萜提取率的影響，依據(jù)單因素試驗結果確定因素水平范圍，利用Design-Expert 8.0為輔助手段設計響應面試驗。

1.2.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Sun FireTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm），以乙腈（A）和水（B）作為液相色譜流動相，洗脫方式為梯度洗脫。流動相梯度程序：0～20 min，50%～80% A，20～35 min，80%～92% A，35～42 min，92% A，42～52 min，92%～95% A，52～57 min，95% A，57～90 min，95%～100% A；流速：0.3 mL/min；波長：210 nm，進樣量：20 μL，柱溫：30 ℃。

1.2.6 UPLC-Q-Exactive條件

高效液相色譜選擇二元線性梯度洗脫：流動相A為0.2%醋酸水溶液，流動相B為乙腈。流動相梯度程序：樣品進樣量10 μL；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。液相色譜二極管陣列檢測器（DAD）通過三通閥與質譜連接，質譜離子源為電噴霧離子源（ESI），分析模式為負離子模式；掃描范圍m/z100～1000；離子肼條件：離子源噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣輔助氣為氮氣，流速為20 L/min，離子肼壓力為3.1×107Pa；金屬毛細管溫度為350 ℃，金屬毛細管電壓為3.5V。

1.2.7 乳酸脫氫酶抑制劑活性測定

20 μL 50 mg/mL樣品溶液分別與90 μL 0.2 U/mL乳酸脫氫酶、0.5 U/mL乳酸脫氫酶、1.0 U/mL乳酸脫氫酶，在100 μL PBS緩沖溶液37 ℃水浴鍋中孵育30 min，將未結合的小分子與結合的復合物通過超濾膜分離。在室溫下，用超濾膜過濾（YM-30000 Da）并離心（12000×g）10 min。加入100 μL 50%甲醇水溶液（50∶50，V/V，pH 3.30）沖洗結合的化合物，通過離心機離心10 min，若膜上還殘留有結合的復合物，則重復上一步驟?？瞻捉M試驗用相同體積的PBS緩沖溶液替代酶，其他條件與試驗組相同，最后得到的溶液用高效液相色譜檢測。

增強因子反映了三萜類物質與乳酸脫氫酶的結合能力的大小[15]。樣品對酶的增強因子按式（2）計算。

式中：A1為與乳酸脫氫酶結合的化合物的吸光度；A2為未與乳酸脫氫酶結合的化合物初始的吸光度。

2 結果分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對總三萜提取率的影響

稱取1.0 g茯神粉末，分別加入20 mL 60%，70%，80%，90%和95%乙醇，超聲提取1 h，提取1次，離心，按標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總三萜提取率，結果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數(shù)對總三萜提取率的影響

如圖2所示，隨乙醇體積分數(shù)的增加，提取率呈現(xiàn)出先增大而后逐漸下降的趨勢，在70%時提取率達到最高。主要原因可能是增大乙醇體積分數(shù)可以促使細胞溶脹，有利于提取劑向細胞內(nèi)部的滲透，從而提高總三萜的提取率。但乙醇體積分數(shù)過高，導致溶液體系的極性下降，使茯神中的醇溶性與脂溶性雜質競爭溶劑，水溶性三萜不易溶出，導致總三萜提取率呈現(xiàn)出下降的趨勢。因此選擇乙醇體積分數(shù)70%為最佳提取體積分數(shù)。

2.1.2 料液比對總三萜提取率的影響

稱取1.0 g茯神粉末，分別加入10，15，20，25和30 mL 70%乙醇，超聲提取1 h，離心，按標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總三萜提取率，料液比與總三萜提取率的關系如圖3所示。

由圖3可知，隨溶劑用量的增加，總三萜的提取率相應增高，由于溶劑用量增加，藥材與溶劑接觸面積增大，并且能夠增大固液濃度差，有利于擴散速度的提高。當溶劑用量大于15 mL時，總三萜的提取率增高趨勢變緩，為避免溶劑浪費，料液比選擇1∶15（g/mL）。

圖3 料液比對總三萜提取率的影響

2.1.3 提取時間對總三萜提取率的影響

稱取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，分別超聲提取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，離心，按標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總三萜提取率，超聲時間與總三萜提取率的關系如圖4所示。

由圖4可知，超聲波在較短時間內(nèi)能夠對茯神總三萜進行充分的提取，超聲時間越長，總三萜提取率越高。但超過1 h，總三萜提取率增大緩慢，可能由于超聲時間過長，其他物質也會溶出，在提取溶劑量不變的情況下會影響三萜物質的溶出。故超聲時間選取1 h。

圖4 提取時間對三萜提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對三萜提取率的影響

稱取1.0 g茯神粉末，加入15 mL 70%乙醇，超聲提取1.0 h，分別提取1，2，3和4次，離心，按標準曲線項下測定樣品吸光度，計算總三萜提取率，超聲時間與總三萜提取率的關系如圖5所示。

由圖5可知，隨提取時間的增加，總三萜的提取率相應增高，可能是提取次數(shù)增加，可以使藥材與溶劑接觸面積增大，提取率不斷增大。當提取次數(shù)為3次時，總三萜的提取率增高趨勢變緩。為了節(jié)省時間，提取次數(shù)選取3次。

圖5 提取次數(shù)對總三萜提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化茯神總三萜提取工藝

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析

響應面優(yōu)化茯神總三萜提取試驗結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計方案與試驗結果

運用Design-Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合，求得茯神總三萜提取率（Y）與乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）的方程：Y=0.54+8.556E-003A+0.028B+0.041D+0.012C+0.012AB-0.02AC+0.026AD+0.019BC+7.937E-003BD-3.313E-003CD-0.023A2-0.064B2-0.055C2+1.586E-004D2。因素的方差分析見表4。

表4 方差分析

由表4可以得出，模型F=40.90，p＜0.000 1，建立的模型極顯著（p＜0.01）。該數(shù)學模型與茯神總三萜的實際提取率情況擬合良好。對各因素進行綜合分析表明：一次項A、D不顯著，B、C極顯著，說明乙醇體積分數(shù)和提取時間2個因素的影響較小，提取次數(shù)對提取率影響顯著且最大，其次為料液比；交互項基本不顯著，說明4個因素之間的交互變化影響相對較小。在超聲提取過程中，各因素對總三萜提取得率影響的三維響應面如圖6所示。

圖6 茯神總三萜超聲提取響應面圖

由圖6可知，隨乙醇體積分數(shù)的增加，三萜提取率先升高后降低，這可能的原因是：其他醇溶性雜質溶出，導致三萜類組分的溶出量相對減少，但乙醇體積分數(shù)對三萜提取率影響不大；增加提取時間，能夠提高三萜提取率，但是增加的比例比較緩慢，說明增加提取時間對三萜提取率的影響不大；增加料液比和提取次數(shù)，能提高三萜提取率，可能是由于增加料液比與次數(shù)有利于三萜物質的溶出。

2.2.2 最佳提取工藝的預測和試驗驗證

根據(jù)Design-Expert 8.0建立的數(shù)學模型確定優(yōu)化后的茯神總三萜提取工藝條件：乙醇提取體積分數(shù)70%、提取時間1 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下，模型推測提取率為1.98%。對優(yōu)化后的茯神總三萜提取工藝條件進行驗證試驗，結果顯示，茯神總三萜提取率為2.106%±0.002%，符合預期結果。

2.3 茯神三萜提取物對乳酸脫氫酶的抑制作用

20 μL茯神提取物溶液（50 mg/mL）未與乳酸脫氫酶結合的對照組以及分別與20 μL不同活度乳酸脫氫酶（0.2，0.5和1.0 U/mL）結合的試驗組的液相色譜圖如圖7所示。

圖7 茯神石油醚層提取物與乳酸脫氫酶結合的HPLC圖

圖7表明，茯神提取物中有4個成分可以與0.2，0.5和1.0 U/mL乳酸脫氫酶結合。分別對比各液相色譜峰面積，考察化合物與乳酸脫氫酶的結合能力。結果表明：化合物1，2，3和4對0.5 U/mL乳酸脫氫酶活性有較強的抑制作用，特別是化合物3抑制酶活性效果顯著?；衔?，2，3和4與不同濃度的乳酸脫氫酶的增強因子如表5所示。

表5 茯神提取物與乳酸脫氫酶結合強度表 單位：%

綜上，茯神提取物中化合物1，2，3和4與乳酸脫氫酶具有生物親和能力，對乳酸脫氫酶有一定的抑制作用，具有潛在的抗腫瘤的活性。各化合物對乳酸脫氫酶抑制效果強弱順序為茯苓酸（化合物3）＞松苓新酸（化合物4）＞去氫茯苓酸（化合物2）＞3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸（化合物1）。

2.4 應用HPLC-ESI-MS分析茯神石油醚層提取物中化學成分

按1.2.6小節(jié)操作，茯神石油醚層提取物中的化合物得到較好的分離，液相色譜圖如圖8所示。采用液相色譜與質譜聯(lián)用技術和標準品比對方法，對液相色譜主要化合物色譜峰相對應的質譜數(shù)據(jù)進行分析，結果如表6所示。

圖8 茯神石油醚層提取物

表6 茯神石油醚層有效成分的UPLC-Q-Exactive分析

化合物1的保留時間為37.50 min，在一級質譜中母離子為513.36[M-H]-，其二級質譜離子主要碎片是m/z467.35，m/z453.33，m/z451.32和m/z391.30，其中m/z467.35是母離子失去一個HCOOH產(chǎn)生的，m/z453.33是母離子失去一個CH3COOH產(chǎn)生的，m/z451.32是母離子失去一個HCOOH和一個CH4產(chǎn)生的，m/z391.30是母離子失去一個CH4、一個HCOOH和一個CH3COOH產(chǎn)生的[16]。結果與文獻報道3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸的主要碎片一致，其保留時間與3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸標準品一致，故推測為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸。

化合物2的保留時間為39.13 min，在一級質譜中母離子為525.34[M-H]-，其二級質譜離子主要碎片是m/z509.32，m/z465.34，m/z447.32和m/z355.22，其中m/z509.32是母離子失去一個CH4產(chǎn)生的，m/z465.34是母離子失去一個CH3COOH產(chǎn)生的，m/z447.32是母離子失去一個H2O和一個CH3COOH產(chǎn)生的，m/z355.22是母離子失去一個C9H14O2和一個CH4產(chǎn)生的[17]。結果與文獻報道去氫茯苓酸的主要碎片一致，其保留時間與去氫茯苓酸標準品一致，故推測為去氫茯苓酸。

化合物3的保留時間為39.75 min，在一級質譜中母離子為527.37[M-H]-，其二級質譜離子碎片主要是m/z465.34，m/z467.35和m/z405.31，其中m/z465.34是母離子失去一個CH4和一個HCOOH產(chǎn)生的，m/z467.35是母離子失去一個CH3COOH產(chǎn)生的，m/z405.31是母離子失去一個HCOOH、一個CH3COOH和一個CH4產(chǎn)生的[18]。結果與文獻報道茯苓酸主要碎片一致，其保留時間與茯苓酸標準品一致，故推測為茯苓酸。

化合物4的保留時間為49.12 min，在一級質譜中母離子為453.34[M-H]-，其二級質譜離子碎片主要是m/z435.27和m/z337.33，其中m/z435.27是母離子失去一個H2O產(chǎn)生的，m/z337.33是母離子失去兩分子CH4以及C24雙鍵麥氏重排后的產(chǎn)物[19-20]。結果與文獻報道松苓新酸主要碎片一致，其保留時間與松苓新酸標準品一致，故推測為松苓新酸。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法進行試驗設計，將茯神總三萜的提取工藝進行優(yōu)化，建立可較為準確預測茯神總三萜提取率的數(shù)學模型。各變量因素的影響強度：提取次數(shù)（C）最大，其次為料液比（B），乙醇體積分數(shù)（A）和提取時間（D）影響較小。茯神總三萜提取的最佳條件為乙醇提取體積分數(shù)70%、提取時間1 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶15（g/mL），總三萜提取率可達到2.106%±0.002%。

以液-質聯(lián)用技術作為研究方法，根據(jù)負離子模式下的質譜數(shù)據(jù)對茯神石油醚層提取物的化學成分進行了研究。結果表明，茯神石油醚層提取物中的化學成分主要為三萜類化合物。根據(jù)各色譜峰在質譜中的分子量和色譜保留時間，成功鑒定了茯神石油醚層提取物中4種三萜類化合物，分別為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、茯苓酸和松苓新酸。

利用超濾質譜法研究茯神石油醚層提取物對乳酸脫氫酶的抑制作用，結果表明對0.5 U/mL乳酸脫氫酶活性有較強的抑制作用，驗證了超濾質譜法是研究配體與酶的相互作用快速、靈敏、有效的分析方法。4種三萜類化合物與乳酸脫氫酶均具有生物親和能力，可以抑制乳酸脫氫酶生物活性，具有潛在的抗腫瘤活性。