HNRNPC可能成為肺腺癌獨立的預(yù)后因子

胡濱濱，張 明

(蘇州大學(xué)附屬高郵醫(yī)院 腫瘤科，江蘇 高郵 225600)

表觀遺傳學(xué)是研究可逆、可遺傳的表型變化，不涉及核DNA序列的變化[1]。雖然表觀遺傳學(xué)的全部范圍尚未確定，但其一般含義是指化學(xué)修飾主要包括DNA、RNA甲基化，組蛋白修飾以及非編碼RNA修飾和染色質(zhì)重排。在表觀遺傳修飾中，DNA甲基化和組蛋白修飾得到了很好的研究，例如DNA中的5-甲基胞嘧啶甲基化已經(jīng)在多種腫瘤中影響著基因表達。近些年的對于甲基化藥物的研究已經(jīng)取得明顯的進展，如去甲基化藥物地西他濱和阿扎胞苷，以及組蛋白去乙?；敢种苿┤_明，為治療臨床疾病提供了更多策略[2-3]。而對于RNA，已經(jīng)在生物體中鑒定了100多種RNA的修飾[4]，RNA甲基化是RNA修飾的主要形式，廣泛存在于各種類型的RNA中，如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA以及mRNA中。特別是mRNA的N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是哺乳動物基因表達的必需調(diào)節(jié)因子[5-6]。其他修飾如5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)和N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine，m1A)[7]。其中，m6A修飾約占mRNA修飾的80%，近年來廣泛被關(guān)注和研究。RNA m6A修飾是可逆的，其生物學(xué)效應(yīng)主要通過“編碼器”，“擦碼器”和“讀碼器”蛋白介導(dǎo)[8]。編碼器是將甲基化修飾“寫入”RNA的過程，即介導(dǎo)RNA的甲基化修飾的過程，包括METTL3(Methyltransferase-like 3)、METTL14(Methyltransferase-like 14)、WTAP(Wilms tumor suppressor-1-associated protein)和ZC3H13(Zinc finger CCCH-type containing 13)[9]。 擦碼器可以“擦除”RNA甲基化修飾信號，即介導(dǎo)RNA的去甲基化過程，包括FTO(Fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5)[10-11]。讀碼器負(fù)責(zé)“讀取” RNA甲基化信息并參與下游RNA的翻譯和降解，包括YTHDC1(YTH domain-containing 1)、YTHDC2(YTH domain-containing 2)、YTHDF1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1)、YTHDF2(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2)和HNRNPC(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)[12]。越來越多的體外和體內(nèi)研究揭示了m6A甲基化修飾在調(diào)節(jié)多種生物過程中的起到關(guān)鍵的作用，包括精子發(fā)生[13]、神經(jīng)發(fā)生[14]、性別決定[15-16]等。異常m6A修飾在不同類型癌癥的進展中起著至關(guān)重要的作用[17]，尤其是作為乳腺癌[18]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[19]和白血病的癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑[20]。異常的m6A修飾對癌癥的生長和進展至關(guān)重要，這表明m6A修飾途徑可能是癌癥治療的一個有前途的治療靶點。

肺癌是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，5年生存率僅為16.6%[21]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%。在NSCLC中，兩種主要亞型是肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUSC)，分別占病例的50%-60%和30%。越來越多的研究表明，異常的m6A 甲基化在包括肺癌在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。去年Li[22]等人通過TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫來探討m6A調(diào)節(jié)劑分子與肺腺癌的關(guān)系，本研究與Li等人的研究部分相類似，同樣也探討了m6A甲基化分子的表達情況。但與之不同的是，接下來的研究是按照各個分子是否與生存相關(guān)進行。為證實研究的可靠性，對GEO(Gene Expression Omnibus)中的數(shù)據(jù)進行分析來進一步驗證，從而試圖揭示肺腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，有助于助開發(fā)新的有效靶向治療方案。

1 材料和方法

1.1 RNA-seq數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析

從TCGA肺腺癌癌項目官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/repository)下載基因表達數(shù)據(jù)(535例腫瘤組織和59例正常肺組織，數(shù)據(jù)類型：HTSeq-FPKM)和相應(yīng)的臨床信息。排除正常肺織樣本，使用箱形圖顯示離散變量的表達差異[23]。最后，522例肺腺癌患者和臨床資料)的RNA-Seq基因表達水平3 HTSeq FPKM數(shù)據(jù)并進一步分析。

1.2 統(tǒng)計分析

用limma軟件包分析了535例腫瘤組織和59例正常肺組織中12個編碼已知m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的基因的表達情況(FC>1、p<0.05；logFC<0 的差異表達基因為下調(diào)基因，logFC>0 的差異表達基因為上調(diào)基因)。提取這12個基因的表達矩陣和與樣品相關(guān)的臨床信息。使用R中的pheatmap、vioplot和corrplot軟件包生成熱圖、小提琴圖和表達相關(guān)圖。使用Kaplan-Meier方法分別計算12個m6A調(diào)節(jié)劑表達與肺腺癌患者的生存曲線。使用Cox回歸與TCGA患者的總體存活相關(guān)的臨床病理學(xué)特征。使用危險比(HRs)超過1表示為危險基因，而HRs<1表示保護基因。Cox回歸分析用于比較HNRNPC/YTHDF2的表達對生存率的影響以及其他臨床特征(年齡、分期、組織浸潤程度、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠處轉(zhuǎn)移狀態(tài))。最后，采用kruskal(KS)檢驗和logistic回歸評估臨床因素與HNRNPC表達之間的關(guān)聯(lián)。缺失的臨床數(shù)據(jù)通過列表刪除進行處理；如果缺少任何參數(shù)的值，則整個樣本將從分析中排除。OS的定義是從診斷日期到死亡日期的時間間隔?；蚋摺⒌捅磉_是基于中位數(shù)確定的。所有統(tǒng)計分析均使用R軟件(V.3.5.1)進行。

1.3 使用基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)進行驗證

為了確保TCGA隊列結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的GSE68465驗證HNRNPC表達水平。數(shù)據(jù)集包括443個肺腺癌和19個相鄰的非腫瘤組織樣本。以及來驗證HNRNPC是否是肺腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子。

2 結(jié)果分析

2.1 TCGA隊列中肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征

2020年6月從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了522個具有臨床和基因表達數(shù)據(jù)的原發(fā)性腫瘤(見表1)。診斷時的中位年齡為67歲。研究發(fā)現(xiàn)臨床I期有279例(54.3%)，II期124例(24.1%)，III期85例(16.5%)和IV期26例(5.1%)。組織浸潤為T1的有172例(33.1%)，T2的有281例(54.1%)，T3的有47例(9.1%)，T4的有19例(3.7%)。510例中有175例(34.3%)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。378例中有25例(6.7%)有遠處轉(zhuǎn)移。中位隨訪時間為18.3個月(范圍0～227個月)。

表1 肺腺癌患者的臨床病理學(xué)特征Table 1 Clinicopathological features of lung adenocarcinoma

2.2 RNA m6A甲基化相關(guān)基因在肺腺癌中的表達

考慮每種RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)劑在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要生物學(xué)功能。首先，比較了TCGA數(shù)據(jù)庫中535個肺腺癌組織和59個正常肺組織中12種RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的表達水平。與正常肺組織相比，其中在肺腺癌組織中HNRNPC、YTHDF3、METTL3、YTHDF1、YTHDF2是相對高表達的，WTAP、FTO、ZC3H13、METTL14是低表達(見圖1a～1b，表2，p<0.05)。不同RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的相關(guān)比率從弱到強相關(guān)(見圖1c)。大多數(shù)RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子之間的關(guān)系呈是正相關(guān)的，但是FTO和HNRNPC是呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的。在這些基因中METTL14和YTHDC1基因最為相關(guān)，即當(dāng)METTL14基因表達上調(diào)時、YTHDC1基因表達很有可能上調(diào)(見圖1c)。

表2 RNA m6A調(diào)節(jié)劑的表達Table 2 Expression of RNA m6A regulators

圖1 RNA m6A甲基化相關(guān)基因在肺腺癌和正常肺組織中的表達Fig.1 Expression of RNA m6A methylation regulators in lung adenocarcinoma and normal tissues

2.3 生存結(jié)果和Cox回歸分析

除去正常肺組織對照組后，繪制肺腺癌中所有差異表達的m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的生存曲線。發(fā)現(xiàn)僅僅YTHDF2和HNRNPC的表達與肺腺癌患者生存相關(guān)，即YTHDF2的高表達有更好的生存、HNRNPC低表達有更好的生存(見圖2)。

圖2 TCGA隊列中所有差異表達的m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的生存曲線 Fig.2 Survival curve of all differentially-expressed m6A methylation regulators in TCGA cohort

采用單因素Cox回歸分析顯示HNRNPC的表達與總體生存相關(guān)([HR]:1.012 046 411；95%CI:1.000 432 8-1.023 794 84；p=0.042)(見表3)。與生存相關(guān)的其他臨床病理變量包括臨床分期、組織浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(見表3)。雖然在前文所述Kaplan-Meier生存分析表明，YTHDF2高表達組預(yù)后好于YTHDF2低表達組(p=0.029)，但是通過單因素Cox回歸結(jié)果表明YTHDF2的表達與肺腺癌患者生存關(guān)系不大(見表4)。

表4 使用Cox回歸的TCGA患者與總體存活和臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)及變量選擇后的多因素生存模型(YTHDF2) Table 4 Association of TCGA patients with overall survival and clinicopathological features using Cox regression and multivariate survival model after variable selection (YTHDF2)

隨后對這兩個基因行多因素Cox回歸分析，結(jié)果表明僅僅HNRNPC的表達以及臨床分期可以作為生存獨立的預(yù)后因子(HR=1.012 369 230, 95%CI:1.000 351 911-1.024 530 914，p=0.044)(見表3)、(見圖3)，即HNRNPC在肺腺癌中可能作為獨立危險預(yù)后因子。

圖3 Multivariate分析模型(森林圖)Fig.3 Multivariate analysis model (Forest map)

表3 使用Cox回歸的TCGA患者與總體存活和臨床病理學(xué)特征的關(guān)聯(lián)及變量選擇后的多因素生存模型(HNRNPC)Table 3 Association of TCGA patients with overall survival and clinicopathological features using Cox regression(HNRNPC) and multivariate survival model after variable selection (HNRNPC)

2.4 HNRNPC的表達和肺腺癌患者臨床病理學(xué)的關(guān)系

HNRNPC的表達與性別(p=0.02)、臨床分期(p=0.026)、遠處轉(zhuǎn)移(p=0.014)和組織浸潤深度(p=0.001)顯著相關(guān)(見圖4)。使用logistic回歸分析顯示HNRNPC在肺腺癌中的表達與臨床分期(IV vs I,OR=3.692 308)和組織浸潤深度(T2 vs T1,OR=1.776 471; T4 vs T1,OR=6.303 030)顯著相關(guān)(見表5,p<0.05)。這些結(jié)果表明在肺腺癌，HNRNPC的表達水平傾向于與臨床分期和組織浸潤深度相關(guān)。

圖4 HNRNPC表達和臨床病理特征的關(guān)系(Kruskal(KS)檢驗)Fig.4 Relationship between HNRNPC expression and clinicopathological features(Kruskal (KS) test)

2.5 使用GEO數(shù)據(jù)庫驗證

使用GSE68465進行生存分析提示HNRNPC低表達組有更好的生存(p=0.009，見圖5a)。單因素Cox分析顯示HNRNPC的高表達與肺腺癌患者較低的總生存率相關(guān)，HR為1.367(95%CI：1.038-1.801，P=0.026)(見圖5b)。多因素Cox分析表明，HNRNPC表達水平是獨立的預(yù)后因素，HR為1.393(95%CI:1.060-1.831，p=0.017)(見圖5c)。通過驗證后結(jié)果與之前TCGA數(shù)據(jù)庫一致,兩次結(jié)果表明HNRNPC在肺腺癌中可能作為獨立危險預(yù)后因子。

圖5 采用GEO進行數(shù)據(jù)驗證(GSE68465)Fig.5 Validation by GEO (GSE68465)

3 討 論

表觀遺傳學(xué)近年來已成為一個熱門話題，m6A甲基化修飾是100多種不同RNA修飾中最豐富的化學(xué)修飾。1974年m6A修飾最初是在poly(A)RNA部分中被鑒定，并且預(yù)測它可能在mRNA加工中起作用[24]。有證據(jù)表明RNA m6A修飾與腫瘤增殖、分化、腫瘤發(fā)生[25]、增殖[26]、侵襲[25]和轉(zhuǎn)移[27]有關(guān)。m6A修飾調(diào)節(jié)基因可能作為原癌基因或抑癌基因在腫瘤中發(fā)揮重要作用。

癌癥是一種復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳疾病，涉及癌基因和抑癌基因的突變和失調(diào)[28]。其中，表觀遺傳修飾可以通過抑制抑癌基因的表達和增強癌基因的表達來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[29]。近年來，肺癌領(lǐng)域m6A修飾的研究逐漸進入研究者們的視野。Chao等[30]認(rèn)為m6A去甲基化酶ALKBH5通過下調(diào)FOXM1 mRNA的m6A修飾水平和促進FOXM1的表達，影響間歇性缺氧條件下肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。同樣作為擦碼器，F(xiàn)TO通過降低肺鱗狀細(xì)胞癌中MZF1 mRNA轉(zhuǎn)錄物中的m6A甲基化水平和mRNA穩(wěn)定性來增強MZF1表達，從而起到腫瘤啟動子的作用[31]。FTO可以通過上調(diào)USP7的表達來促進NSCLC細(xì)胞的生長[32]。對于相關(guān)閱讀蛋白的研究，已經(jīng)有研究結(jié)果表明，YTHDF2通過促進6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶mRNA的翻譯來促進肺癌細(xì)胞的生長[33]。因此在肺癌中，m6A相關(guān)基因和蛋白表達水平有可能成為腫瘤分子診斷的潛在標(biāo)志物，也將為臨床上分子靶向治療的發(fā)展提供新的靶點。本研究是從生物信息學(xué)的角度發(fā)掘m6A甲基化因子在肺腺癌中的作用。

近期，Gao[34]等人從TCGA數(shù)據(jù)庫中女性肺腺癌隊列進行研究，該研究結(jié)果有助于評估女性肺腺癌患者的預(yù)后提供重要的理論支持。本研究首先評估了m6A調(diào)控相關(guān)基因表達譜，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)m6A調(diào)節(jié)因子在肺腺癌中差異表達。其中HNRNPC、YTHDF3、METTL3、YTHDF1、YTHDF2表達上調(diào)；WTAP、FTO、ZC3H13、METTL14下調(diào)。然后探索了這些分子之間的內(nèi)在聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)METTL14和YTHDC1是相關(guān)性最大的。也就是說，當(dāng)METTL14高表達時，YTHDC1很可能表達上調(diào)。隨后對這些差異表達的基因進行生存分析，Kaplan-Meier生存分析顯示僅僅HNRNPC和YTHDF2的表達與總體存活相關(guān)。然后，通過multivariate分析顯示HNRNPC可以成為肺腺癌總生存期的獨立預(yù)后因素。隨后，使用logistic regression回歸的單因素分析顯示HNRNPC在肺腺癌中的表達與臨床分期(IV vs I,OR=3.692 308)、組織浸潤深度(T2 vs T1,OR=1.776 471；T4 vs T1,OR=6.303 03)(p<0.05)顯著相關(guān)。最后通過GEO數(shù)據(jù)庫進行驗證,最后得出HNRNPC可能成為肺腺癌的獨立預(yù)后因素。

在多種腫瘤或腫瘤細(xì)胞系中觀察到HNRNPC的異常上調(diào)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[35]，肝細(xì)胞癌[36]，黑素瘤[37]和肺癌[38]。作為RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)，HNRNPC參與RNA剪接[39-40]、非特異性RNA輸出[41]、RNA表達[35,42]、穩(wěn)定性[43-44]、3'末端加工[45]和翻譯[46]。敲除HNRNPC可以減少細(xì)胞增殖并增強依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這表明HNRNPC在GBM中起著致癌基因的作用[35]。同樣，HNRNPC過表達與胃癌細(xì)胞的化療耐藥密切相關(guān)，高表達水平的HNRNPC與臨床預(yù)后不良有關(guān)[47]。KHSRP和HNRNPC可通過激活I(lǐng)FN-α-JAK-STAT1信號通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[48]。最近，Huang[49]等人發(fā)現(xiàn)HNRNPC的過表達通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)促進口腔鱗狀細(xì)胞的癌變。在我們的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPC在肺腺癌組織中表達上調(diào)。然后進一步發(fā)現(xiàn)HNRNPC的表達水平與肺腺癌患者的總生存期相關(guān)，且與臨床分期和組織浸潤深度相關(guān)。最后發(fā)現(xiàn)HNRNPC可能作為獨立的預(yù)后因素，從而可能為肺腺癌提供新的治療靶點。

4 結(jié) 論

肺腺癌和正常對照之間發(fā)生的變化的RNA m6A甲基化調(diào)節(jié)因子，可能在肺腺癌的進展中起著至關(guān)重要的作用。HNRNPC表達可能是肺腺癌的潛在預(yù)后分子標(biāo)志物，但是需要更多的研究進一步驗證。