牦牛NLRP基因家族全基因組鑒定及轉(zhuǎn)錄組分析

鮑 麒，張曉蘭 ，黃 純，梁春年，李吉葉，褚 敏，閻 萍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所,蘭州 730050；2.甘肅省牦牛繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730050；3.青海大通種牛場(chǎng),西寧 810000)

NLRP蛋白家族最早在人上被發(fā)現(xiàn)，共有14個(gè)家族成員，可以分為免疫相關(guān)蛋白和生殖相關(guān)蛋白。免疫相關(guān)蛋白主要在先天免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能，包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP10和NLRP12，生殖相關(guān)蛋白主要在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中起作用，包括NLRP2、NLRP4、NLRP5、NLRP7、NLRP8、NLRP9、NLRP11、NLRP13 和NLRP14[1]。NLRP蛋白的基本結(jié)構(gòu)主要由3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域組成，第一個(gè)是氨基端的PYD(Pyrin domain)，該結(jié)構(gòu)域包含92個(gè)氨基酸，主要功能是介導(dǎo)蛋白之間的相互作用，第二個(gè)是中間的NACHT結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是以4個(gè)相近的含核苷水解酶域的蛋白合起來(lái)命名的,包括神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(Neuronal apoptosis inhibitor protein, NAIP)、Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體轉(zhuǎn)錄激活子(Class Ⅱ major histocompatibility complex trans-activator, CⅡTA)、來(lái)源于柄孢霉的非親和位點(diǎn)蛋白 (HET-E)、哺乳動(dòng)物端粒酶相關(guān)蛋白(Telomerase associated protein 1, TP1)。最后是羧基端的LRRs(Leucine-rich repeats)結(jié)構(gòu)域[2]，該結(jié)構(gòu)域含有9-12個(gè)亮氨酸重復(fù)，主要功能是介導(dǎo)自身調(diào)節(jié)、蛋白間的相互作用和病原相關(guān)分子模式的傳感。

近年來(lái)對(duì)NLRP基因的研究主要集中在炎癥小體上。NLRP家族中的炎癥體包含NLRP1和NLRP3炎癥小體。炎癥小體是由胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體參與組裝的多蛋白復(fù)合物。炎癥小體活化后可促進(jìn)炎癥因子的成熟和釋放，從而參與先天免疫過(guò)程。炎癥小體募集天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)，引起capase-1蛋白水解pro-IL-1b和pro-IL-18，產(chǎn)生成熟的活性細(xì)胞因子[3]。NLRP1炎癥體由感受器NLRP1、結(jié)合蛋白ASE和效應(yīng)蛋白Caspase-1三個(gè)部分組成，能夠促進(jìn)IL-18，IL-1b及IL-33的成熟，在炎癥發(fā)生時(shí)起作用[3]。在NLRP蛋白中，NLRP10是唯一一個(gè)缺乏LRR結(jié)構(gòu)域的家族成員。有研究表明，該蛋白是炎癥和細(xì)胞凋亡的多功能負(fù)調(diào)節(jié)劑，能激活促炎性半胱天冬酶、半胱天冬酶-1和半胱天冬酶-5[4]。另外，與生殖相關(guān)的NLRP基因也備受關(guān)注。小鼠中Nlrp2是卵母細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，敲除掉該基因的雌性小鼠的繁殖率會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著下降[5]。Nlrp4和Nlrp9在小鼠上具有特異性復(fù)制的特點(diǎn)，在小鼠中Nlrp4有7個(gè)拷貝基因，Nlrp9有3個(gè)拷貝基因[6]。Nlrp4g參與了小鼠早期胚胎的發(fā)育，在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)[7]。Nlrp9的復(fù)制基因可能沒(méi)有具體的功能，有研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲除Nlrp9a和Nlrp9e或在合子中沉默Nlrp9b對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育沒(méi)有明顯的影響，表明在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中可能不需要Nlrp9的參與[8]。嚙齒類動(dòng)物中沒(méi)有Nlrp7，被認(rèn)為是在物種進(jìn)化過(guò)程中由Nlrp2復(fù)制而形成的，二者基因位點(diǎn)相近，由Nlrp2執(zhí)行Nlrp7的功能[9]。NLRP7不僅在免疫活動(dòng)中發(fā)揮作用，還是一種母源印記基因，相關(guān)研究表明NLRP7印記狀態(tài)的異常會(huì)導(dǎo)致人胚胎發(fā)育的異常[10]，從而造成葡萄胎或者流產(chǎn)現(xiàn)象的發(fā)生。

牦牛是生活在海拔2 500-6 000 m的青藏高原及其鄰近地區(qū)的一種獨(dú)特的家畜，自古以來(lái)，牦牛是青藏高原地區(qū)牧民必不可缺的家畜，為高原地區(qū)的牧民提供了吃、住、行等基本生存保證[11]。牦牛能適應(yīng)高海拔地區(qū)的嚴(yán)寒、缺氧、缺草等惡劣自然條件，是哺乳動(dòng)物中研究高海拔適應(yīng)性的理想物種[12]。與大部分一年一胎的牛科動(dòng)物相比，牦牛的性成熟時(shí)間晚[13]，生殖性能差，每?jī)赡晟惶セ蛎咳晟齼商?。其次，牦牛體外受精的囊胚發(fā)育率低，影響牦牛生產(chǎn)。近年來(lái)，多個(gè)NLRP基因在牦牛生殖相關(guān)的研究中被報(bào)道，如陳虹[14]在牦牛卵巢蛋白質(zhì)分析中鑒定到NLRP5在卵母細(xì)胞和受精卵中高表達(dá)；楊芳[15]通過(guò)對(duì)牦牛和犏牛睪丸的比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)NLRP14的上調(diào)可能會(huì)造成原始生殖細(xì)胞或未分化精原細(xì)胞的積累，進(jìn)而加劇生殖細(xì)胞凋亡，表明該家族基因在牦牛上也發(fā)揮重要作用。目前，NLRP基因家族在人、小鼠基因組上被完整鑒定，但在牦牛上尚無(wú)報(bào)道。本研究對(duì)牦牛NLRP基因家族進(jìn)行系統(tǒng)性分析，可為進(jìn)一步研究牦牛NLRP基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 牦牛NLRP基因家族的鑒定

從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[16]下載已知人類NLRP蛋白序列(見(jiàn)表1)，使用BLSAT+軟件[17]構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，同源比對(duì)牦牛蛋白序列。牦牛參考基因組、蛋白序列和注釋文件來(lái)源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=wild+yak)。同時(shí)利用HMMER軟件對(duì)人NLRP蛋白序列建立HMM模型，在牦牛全基因組蛋白序列中搜索同源序列，篩選閾值設(shè)置為E-value<1×10-5，去除可變剪切后，同時(shí)滿足兩種鑒定方法的序列被認(rèn)為是牦牛NLRP基因家族成員，基因名字以基因組注釋文件給定的名稱命名。

表1 人類NLRP蛋白信息Table 1 Human NLRP proteins

1.2 牦牛NLRP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用ClustalW[18]對(duì)鑒定出的牦牛NLRP蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA-X軟件[19]對(duì)牦牛、小鼠、大鼠、狗、牛、人NLRP蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。最后使用Evolview軟件(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行美化處理。

1.3 牦牛NLRP蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線生物信息學(xué)軟件Expasy Protoparam[20]、SignaIP 5.0 Server[21]、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Wolf PSORT[22]分別預(yù)測(cè)NLRP蛋白長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白亞細(xì)胞定位情況。采用在線工具GSDS[23]對(duì)牦牛NLRP基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

1.4 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI在線工具CD-search[24]和PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)[25]對(duì)鑒定出的牦牛NLRP蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域鑒定。利用MEME[26]分析NLRP保守基序(默認(rèn)參數(shù))，并用TBtools[27]進(jìn)行展示。運(yùn)用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析NLRP蛋白的磷酸化位點(diǎn)，并且統(tǒng)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的個(gè)數(shù)。采用SOPMA[28]預(yù)測(cè)牦牛NLRP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[29]查詢牦牛NLRP的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 牦牛NLRP基因家族的表達(dá)分析

牦牛不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(PRJNA362606)[30]。首先，利用fastq-dump軟件(https://ncbi.github.io/sra-tools/fastq-dump.html)將下載得到的SRA文件轉(zhuǎn)換為fastq格式文件, 對(duì)于上述所有過(guò)濾后的RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用fastp[31]對(duì)下載的原始數(shù)據(jù)需要進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理，得到的clean data 用于后續(xù)分析。在Hisat2(2.1.0版)中使用Hisat2-build命令[32]，默認(rèn)參數(shù)下構(gòu)建基因組索引。隨后利用featureCounts計(jì)數(shù), 得到每個(gè)基因在各個(gè)樣本中的raw counts。在這項(xiàng)研究中，我們使用FPKM作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄豐度(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)，利用R腳本根據(jù)各個(gè)樣本的raw counts計(jì)算出基因的表達(dá)量構(gòu)建出基因表達(dá)矩陣，共18個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本。最后提取NLRP基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R軟件對(duì)其進(jìn)行分析、聚類和可視化。

2 結(jié)果分析

2.1 牦牛NLRP基因家族成員的鑒定及蛋白理化特性分析

從牦牛基因組中共鑒定出8個(gè)NLRP基因家族成員(見(jiàn)表2)，按照注釋文件中的信息命名。蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示：牦牛NLRP蛋白分子量介于113 117.63-124 957.17 Da之間，蛋白長(zhǎng)度介于996-1 098之間，等電點(diǎn)介于5.52-8.27之間，消光系數(shù)介于70 340-130 560之間，不穩(wěn)定系數(shù)介于44.74-57.41之間，脂肪族指數(shù)介于88.57-98.02之間。8個(gè)NLRP蛋白均為不穩(wěn)定、無(wú)信號(hào)肽、無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，不同的NLRP蛋白定位有所差異，NLRP3、NLRP6和NRLP12均定位于細(xì)胞質(zhì)膜，NLRP5和NLRP14定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或者細(xì)胞核，NLRP8定位于細(xì)胞核中，NLRP2和NLRP9定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。所有的NLRP蛋白都有絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(見(jiàn)表3)，磷酸化位點(diǎn)數(shù)依次為絲氨酸>蘇氨酸>酪氨酸，每個(gè)家族成員的磷酸化位點(diǎn)個(gè)數(shù)介于86～102個(gè)之間。其中，NLRP14含有的磷酸化位點(diǎn)最多(102個(gè))，NLRP2最少(83個(gè))。

表2 牦牛NLRP蛋白基本信息和編碼蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Basic information of NLRP proteins and physiological and chemical properties of their encoded proteins

表3 牦牛NLRP蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 3 Phosphorylation site prediction of NLRPs of yak

2.2 NLRP蛋白氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)ClustalW對(duì)8個(gè)NLRP蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示NLRP蛋白的氨基酸序列相似度低(見(jiàn)圖1)。兩兩比對(duì)分?jǐn)?shù)在17.1%到38.4%不等。其中NLRP3和NLRP12的比對(duì)分?jǐn)?shù)最高(38.4%)，NLRP2和NLRP5的比對(duì)分?jǐn)?shù)最低(17.1%)。序列中部分位點(diǎn)Y、R、E、V、F在所有蛋白序列中完全一致。

圖1 牦牛NLRP蛋白氨基酸序列比對(duì)情況Fig.1 Amino acid sequence alignment of NLRP proteins in yak

利用MEGA X對(duì)8個(gè)牦牛、8個(gè)黃牛、14個(gè)人、10個(gè)狗、12個(gè)大鼠和19個(gè)小鼠NLRP蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)。從進(jìn)化樹(shù)的結(jié)構(gòu)可以看出不同家族成員在進(jìn)化上已經(jīng)發(fā)生了分離，同一家族成員氨基酸序列相似度高，在6個(gè)物種中都聚在一起。免疫相關(guān)和生殖相關(guān)的NLRP蛋白已分開(kāi)(Group Ⅰ和Group Ⅱ)，生殖相關(guān)的NLRP蛋白之間相似度要高于免疫相關(guān)蛋白。通過(guò)與已驗(yàn)證的人、小鼠等物種的NLRP蛋白序列比對(duì)，進(jìn)一步確認(rèn)注釋文件的準(zhǔn)確性。

圖2 牦牛NLRP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NLRP proteins in yak

2.3 基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，NLRP基因內(nèi)含子數(shù)量介于8-12個(gè)之間，外顯子數(shù)目介于9-13個(gè)之間。5′-UTR和3′-UTR的長(zhǎng)短差異較大，3′-UTR長(zhǎng)度要大于5′-UTR。NLRP8和NLRP2沒(méi)有5′-UTR和3′-UTR結(jié)構(gòu)，NLRP9、NLRP5、NLRP12和NLRP6沒(méi)有5′-UTR結(jié)構(gòu)。從基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果上看，免疫相關(guān)蛋白和生殖相關(guān)蛋白沒(méi)有顯著區(qū)別。

圖3 牦牛NLRP家族成員基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of NLRP family members in yak

MEME預(yù)測(cè)結(jié)果顯示牦牛NLRP蛋白存在10種保守基序(motif 1-10)(見(jiàn)圖4)，長(zhǎng)度分別為34、49、49、48、21、48、50、41、39、29 bp。NLRP5、NLRP12和NLRP14沒(méi)有motif 4。NLRP14的motif數(shù)量最多(16個(gè))，NLRP6數(shù)量最少(10個(gè))。10個(gè)motif中，C、D、L、N、G、D位點(diǎn)的一致性較好(見(jiàn)圖5)。牦牛NRLP蛋白與其他物種相同，都具有該家族代表性保守結(jié)構(gòu)域：NACHT、PYRIN和LRR(見(jiàn)圖6)。

圖4 牦牛NLRP蛋白保守基序分布Fig.4 Conserved motifs of NLRP proteins in yak

圖5 牦牛NLRP蛋白典型保守基序序列圖Fig.5 Typical conserved motif sequences of NLRP proteins in yak

圖6 牦牛NLRP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig.6 Conserved domains of NLRP proteins in yak

2.4 牦牛NLRP家族蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)牦牛NLRP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果(見(jiàn)表4)，牦牛NLRP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要元件為α-螺旋，其次依次為無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。為了解蛋白之間的功能聯(lián)系和在生物系統(tǒng)中的工作原理，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢了8個(gè)NLRP蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖7)。NLRP2和NLRP14的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相似，都與PYCARD、1L1B、1L18、NEK7和MAVS互作。NLRP3、NLRP6和NLRP12也與PYCARD互作。NLRP5、NLRP8和NLRP9具有獨(dú)立的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。NLRP5與BMP15、ZAR1、RAD16等蛋白存在相互作用。NRLP8和MEFV、TAF8、TAF3等蛋白互作。NLRP9與TBK1、UBC、TTC12等蛋白互作。

圖7 牦牛NLRP家族成員蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein-protein interaction network of NLRP family members in yak

表4 NLRP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Table 4 Secondary structure of NLRP proteins in yak

2.5 NLRP基因在牦牛不同組織中的表達(dá)

為了研究NLRP基因家族在牦牛不同組織中的表達(dá)情況，本研究從公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI下載了牦牛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[30]，獲得了8個(gè)牦牛NLRP基因在6種組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，牦牛NLRP基因在6種組織中的表達(dá)較為微弱或者不表達(dá)(見(jiàn)圖8)。NLRP2只在肺臟和脾臟中檢測(cè)到表達(dá)。NLRP3、NLRP5在6種組織中均有表達(dá)，二者均在脾臟中的表達(dá)量最高。NLRP6在腎臟中的表達(dá)量要高于脾臟和肺臟。NLRP8在脾臟和肝臟中檢測(cè)到表達(dá)。NLRP9僅在脾臟中檢測(cè)到。NLRP12在心臟中不表達(dá)，在其他組織中表達(dá)。NLRP14只在肺和腎臟中檢測(cè)到。

圖8 NLRP基因在牦牛不同組織的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of NLRP genes in different tissues of yak

注：基因表達(dá)熱圖中的每個(gè)小方塊代表每個(gè)基因，基因的表達(dá)量由小方塊的顏色深度來(lái)表示。行表示每個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)，列表示每個(gè)樣本中所有基因的表達(dá)。表達(dá)量值按照行進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并基于平均連接算法進(jìn)行聚類.

3 討 論

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，動(dòng)物基因組的測(cè)定以及注釋信息的完善，使得我們能夠通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析基因的相關(guān)信息，從序列的角度直接解析基因的各種信息，對(duì)目標(biāo)基因可能存在的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[33]。本研究共鑒定出牦牛NLRP基因家族的8個(gè)成員，其中免疫相關(guān)的有NLRP3、NLRP6和NLRP12，生殖相關(guān)的有NLRP2、NLRP5、NLRP8、NRLP9和NLRP14。

NLRP基因在很多物種中被鑒定出來(lái)，但是在物種之間存在很大差異。例如，在靈長(zhǎng)類上已鑒定出14個(gè)NLRP基因[34]，在黃牛上已鑒定出8個(gè)NLRP基因[35]，在小鼠上已鑒定出20個(gè)NLRP基因[36]，在狗上已鑒定出11個(gè)NLRP基因[35]。小鼠基因組上缺失了NLRP7、NLRP8、NLRP11和NLRP13，但在NLRP1、NRLP4和NLRP9上發(fā)生了復(fù)制，其發(fā)生復(fù)制和平行擴(kuò)張的都是與生殖相關(guān)的基因。與小鼠不同的是，牦牛NLRP家族中免疫相關(guān)基因缺失NLRP1和NLRP10，生殖相關(guān)基因缺失NLRP4、NLRP7、NLRP11和NLRP13，同時(shí)也沒(méi)有鑒定出平行擴(kuò)張的基因。物種間的比對(duì)結(jié)果顯示，NLRP家族部分基因在進(jìn)化過(guò)程中是保守的，如NLRP3(牦牛與人有84%相同，牦牛與小鼠有80%相同，人與小鼠有82%相同，牦牛與黃牛有99%相同)；而部分生殖相關(guān)基因NLRP5(牦牛與人有71%相同，牦牛與小鼠有63%相同，人與小鼠有50%相同，牦牛與黃牛有99%相同)與NLRP14(牦牛與人有83%相同，牦牛與小鼠有70%相同，人與小鼠有62%相同，牦牛與黃牛有99%相同)序列在物種間的差異較大，這可能是生殖相關(guān)基因進(jìn)化更為快速導(dǎo)致的。牦牛NLRP蛋白除了都含有NLRP蛋白家族獨(dú)有的PYRIN、NACHT和LRR保守結(jié)構(gòu)域，還預(yù)測(cè)出NOD2_WH和FISNA結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖6)。NOD2_WH這種有翼的螺旋結(jié)構(gòu)在NOD2蛋白中被發(fā)現(xiàn)[37]，但它的分子功能尚不清楚。FISNA結(jié)構(gòu)域在魚(yú)類和其他脊椎動(dòng)物中存在，該域經(jīng)常與NACHT域相關(guān)聯(lián)[38]，具體功能尚無(wú)報(bào)道。

一些蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)因子傳遞及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過(guò)程中存在相互作用，這種不同蛋白之間的相互作用構(gòu)成了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，牦牛NLRP2、NLRP3、NLRP6、NLRP12、NLRP14與均與參與炎癥反應(yīng)的蛋白PYCARD存在相互作用。PYCARD是凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白，能夠被NLRP3募集，并且與天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)形成多蛋白聚合的炎癥小體，它的作用是激活caspase-1，通過(guò)促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答[39]。NLRP2、NLRP6、NLRP14均與MLKL互作。MLKL是混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白，相關(guān)研究表明在沒(méi)有凋亡蛋白抑制劑(IAPs)和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)情況下，MLKL對(duì)于TLR誘導(dǎo)的NRLP3激活有重要作用[40]。NLRP5與TLE6、BMP15、FIGLA、NPM2、GDF9等參與生殖過(guò)程的蛋白互作，BMP15蛋白由卵母細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子基因BMP15編碼，在綿羊中發(fā)現(xiàn)該基因的自然突變可以以劑量敏感的方式導(dǎo)致排卵率和不育表型的增加[41]。另外，綿羊GDF9基因突變以類似于BMP15失活突變的方式導(dǎo)致排卵率增加和不孕，表明GDF9對(duì)綿羊正常卵泡發(fā)育至關(guān)重要[42]。

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示牦牛NRLP基因家族成員在6個(gè)組織中的表達(dá)存在差異。免疫相關(guān)基因NLRP3在脾臟中表達(dá)較高，可能與脾臟作為最大的免疫器官有關(guān)。NLRP5在6個(gè)組織中表達(dá)，在脾臟中的表達(dá)量要高于其他組織(見(jiàn)圖8)。相關(guān)研究表明NLRP5在豬上的同源物在早期胚胎發(fā)育中起作用，受精卵中NLRP5的表達(dá)被抑制會(huì)導(dǎo)致胚胎的早期發(fā)育受到抑制[43]。在合子基因組激活前，NLRP5的轉(zhuǎn)錄物在母豬植入前胚胎中顯著下調(diào)直到盒子基因組激活后檢測(cè)不到任何表達(dá)，表明NLRP5基因是母豬早期胚胎發(fā)生所必需的，提示該基因可能在合子基因組激活中發(fā)揮重要作用。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)揭示NLRP5也與生殖細(xì)胞標(biāo)記蛋白GDF9、BMP15、ZAR1等存在相互作用(見(jiàn)圖7)。NLRP8在牦牛脾臟和肝臟中檢測(cè)到微弱表達(dá)，該基因在嚙齒類動(dòng)物基因組中缺失，在其他物種中其研究尚無(wú)報(bào)道。NLRP14只在肺臟和腎臟中檢測(cè)到，相關(guān)研究表明其在卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，該基因的沉默會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[45]。

從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及基因表達(dá)譜的結(jié)果來(lái)看，部分NLRP基因及蛋白的功能很難完全劃分為免疫和生殖兩部分，它們的功能是復(fù)雜的。從文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果來(lái)看，NLRP基因既可以在免疫方面發(fā)揮作用，又能夠參與動(dòng)物的生殖過(guò)程。NLRP7是與動(dòng)物生殖相關(guān)的基因，但是也有研究發(fā)現(xiàn)該基因在先天免疫系統(tǒng)中也起作用，編碼的蛋白同樣能夠招募ASC促進(jìn)caspase-1激活和促進(jìn)IL-1調(diào)節(jié)因子和IL-18的成熟[46]。NLRP9在此前研究中被認(rèn)為是生殖相關(guān)基因，在小鼠卵巢中表達(dá)，參與合子基因組的激活[47]。此外，玉香等[48]在對(duì)NLRP9在仔豬組織中的表達(dá)、定位及在豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)細(xì)胞中的功能研究中發(fā)現(xiàn)NLRP9參與了腸粘膜免疫過(guò)程，其表達(dá)主要定位于小腸上皮、睪丸和卵巢中。

4 結(jié) 論

通過(guò)同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域搜索，在牦牛基因組中鑒定出牦牛8個(gè)NLRP家族成員，并且通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析確定牦牛NLRP基因家族的分類和進(jìn)化關(guān)系，并且通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)牦牛NLRP基因家族的基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)查詢蛋白互作關(guān)系，進(jìn)一步了解牦牛NLRP蛋白與其他蛋白之間的功能聯(lián)系，為確定基因功能提供參考。最后利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，初步展示了NLRP基因在牦牛不同組織中的表達(dá)情況，上述分析將為后續(xù)牦牛NLRP基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。