高效色譜法測定風味發(fā)酵乳中的三氯蔗糖

林婷，劉強欣*，聞佳鈺，俞婕，董葉箐，孫文閃

綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司（杭州 310051）

三氯蔗糖（sucralose），俗稱蔗糖素，是一種高倍甜味劑，具有無能量、高甜度、安全性好等特點，是最理想的甜味劑之一，被包括中國在內(nèi)的30多個國家批準作為甜味劑使用[1]。風味發(fā)酵乳除了具有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)及各種維生素外，還有抑制腸道中有害微生物生長繁殖、增進人體消化吸收的作用，因此備受消費者喜愛。添加三氯蔗糖可以調(diào)節(jié)風味發(fā)酵乳的口味，但近年來科學研究發(fā)現(xiàn)，三氯蔗糖會增加人們罹患白血病及其他各種癌癥的風險[3-4]。我國嚴格限制風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖使用量，因此風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的檢測方法研究非常重要。

食品中三氯蔗糖的測定方法有很多[2]，主要有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-11]、離子色譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-16]、氣相色譜法[17]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖然靈敏度高，但其設備昂貴，不利于實驗室普遍推廣，還有基質(zhì)效應影響等；離子色譜在檢測中具有對前處理要求高，易受陰離子干擾等缺點；氣相色譜法前處理需進行衍生，較為繁瑣；液相色譜法儀器成本低、普及率高、準確性好，因此作為首選方法。由于相關風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的研究相對較少，試驗通過前處理條件優(yōu)化，以期得到簡單快速準確的測定方法，便于三氯蔗糖液相色譜法的推廣使用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，默克）；三氯蔗糖（純度99.9%，BePure）；固相萃取柱（HLB萃取柱）；Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5.0 μm；博納艾杰爾）；試驗用水（一級水，美國Millipore超純水儀制備）；混合微孔濾膜（0.22 μm）；風味發(fā)酵乳（市售）。

1.1.2 主要儀器與設備

高效液相色譜儀器（Shimadzu LC-20A，配有示差檢測器，日本島津公司）；電子天平（BSA224S型，德國賽多利斯）；高速冷凍離心機（ST16R，賽默飛世爾）；電熱板（EH20B，萊伯泰科）；超聲波清洗器（KQ5200E，昆山舒美）；渦旋振蕩器（Multi-TubeVortexer型）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

標曲儲備液：精確稱取0.025 g（精確至0.000 1 g）三氯蔗糖至于25 mL容量瓶中，加入15 mL超純水，溶解后，定容到刻度，其中三氯蔗糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL。置于4 ℃冰箱中保存，保存期為6個月。

標準工作液：分別準確吸0.015，0.050，0.100，0.200，0.500和1.000 mL三氯蔗糖儲備液于6個10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成三氯蔗糖的系列標準溶液（0.001 5，0.005 0，0.010 0，0.020 0，0.050 0和0.100 0 g/L），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取5 g（精確至0.001 g）試樣置于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋混合器上渦旋3 min后加入10 mL乙腈，繼續(xù)渦旋3 min，超聲波提取20 min，以8 000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至150 mL燒杯中。殘渣中加入20 mL乙腈水溶液（50+50，V/V），渦旋3 min，以8 000 r/min離心3 min，重復提1次，合并上清液于同一燒杯中。將燒杯置于電熱板上，于210 ℃蒸發(fā)至液體在10 mL左右，用30 mL水分三次沖洗燒杯，合并沖洗液置于50 mL離心管中。

將全部提取濃縮液移入已活化的固相萃取柱（HLB萃取柱，用5 mL甲醇，5 mL水活化），用5 mL水淋洗萃取柱，待柱中液體完全排出后，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于50 ℃氮吹至近干，殘渣用1 mL乙腈水溶液（20+80，V/V）溶解，過0.22 μm混合濾膜，上機測試。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：乙腈-水=20∶80（V/V）；檢測器采用示差檢測器；進樣量20 μL；流速1 mL/min。圖1為三氯蔗糖標準溶液的液相色譜圖。

圖1 標準溶液中三氯蔗糖的液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化

風味發(fā)酵乳是指除了80%以上奶粉之外，還加入果蔬、谷物、食品添加劑等原料的發(fā)酵乳制品。三氯蔗糖具有極好的水溶性，故依據(jù)目標物質(zhì)的溶解性質(zhì)，該方法研究比較超純水、甲醇水溶液和乙腈水溶液3種提取試劑，通過計算回收率比較各提取劑的提取效果。結(jié)果（圖2）表明乙腈水提取試劑時提取效果（回收率）最好。原因分析可能是采用超純水、甲醇水溶液進行提取時，提取液中會含有水溶性的蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)，會在后續(xù)過固相萃取柱時存在堵塞萃取小柱的風險，增加目標物質(zhì)的損失，且含有蛋白質(zhì)的上機試樣會對整個色譜系統(tǒng)尤其是對于液相色譜柱產(chǎn)生極大的不良影響。采用先加水增加液固比，加之乙腈使蛋白質(zhì)變性，具有較好的沉淀效果。綜合考慮，采取乙腈水作為提取試劑。

圖2 不同提取溶劑對于三氯蔗糖提取效果的影響

2.1.2 提取時間的優(yōu)化

該方法研究比較不同超聲時間（5，10，20和30 min）對于三氯蔗糖提取效率的影響。結(jié)果（圖3）顯示超聲時間與提取效率基本呈正相關關系，在20 min時可以獲得較好的回收率，而繼續(xù)增加超聲時間提取效率并無明顯增加，故選擇提取時間為20 min。

圖3 不同提取時間對于三氯蔗糖提取效果的影響

2.1.3 提取液濃縮方式的優(yōu)化

由于提取液中有機相約占50%，比例較高，提取液直接過固相萃取柱不利于凈化柱對目標物質(zhì)（三氯蔗糖）的吸附，則需要通過提取液濃縮的方式將有機相比例降低。試驗方法比較50 ℃氮吹儀吹干、210 ℃電熱板烤干和沸水浴蒸發(fā)皿蒸干3種濃縮方法。現(xiàn)有氮吹儀的單次使用最大限值為10 mL，樣品提取液需進行多次氮吹，而且提取液中水分幾乎占到一半，提取液不易吹干，耗時較長；沸水浴蒸發(fā)皿蒸干容易爆沸，不利于大批量樣品同時處理；用210 ℃電熱板烤干，10余個試液可以同時進行，可以節(jié)約時間，提高工作效率，因此選擇210 ℃電熱板烤干進行提取液的濃縮。

2.1.4 固相萃取柱的優(yōu)化

風味發(fā)酵乳主要含有奶粉、果蔬、谷物、食品添加劑等原料物質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在會干擾化合物的測定，影響方法的靈敏度、精密度和準確度。因此選擇合適的淋洗液來除去雜質(zhì)以降低雜質(zhì)對于結(jié)果的干擾作用尤為重要。研究超純水、5%甲醇水、10%甲醇水、20%甲醇水作為淋洗液處理試樣。結(jié)果（圖4）表明三氯蔗糖含量隨著淋洗液有機相比例的提高而降低，超純水凈化效果最佳，其他3種淋洗液回收率偏低，可能由于淋洗液中甲醇會將萃取柱中目標物質(zhì)洗脫，甲醇含量越高造成目標物質(zhì)損失越大，使得目標物質(zhì)回收率偏低。故選擇超純水作為淋洗液。

圖4 不同淋洗液對于三氯蔗糖提取效果的影響

選擇合適的溶劑將吸附在固相萃取柱填料上的目標物洗脫也是十分重要的一環(huán)，研究甲醇、80%甲醇水、50%甲醇水、20%甲醇水作為洗脫液處理試樣。結(jié)果（圖5）表明三氯蔗糖含量隨著洗脫液有機相比例的升高而提高，甲醇的洗脫效果最佳，其他3種洗脫液洗脫效果較差，故選擇甲醇作為洗脫液。

圖5 不同洗脫液對于三氯蔗糖提取效果的影響

2.2 方法的線性范圍及檢出限

方法的檢出限（LOD）的確定參考GB 22255—2014《食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》[18]，通過空白樣品不斷降低三氯蔗糖標準溶液的添加濃度，當在儀器上色譜峰達到3倍信噪比（S/N）時對應的加標濃度即為檢出限，定量限（LOQ）的確定參考GB 22255—2014通過空白樣品不斷降低標準溶液的添加濃度，當在儀器上色譜峰達到10倍信噪比（S/N）時對應的添加濃度即為定量限。以濃度和峰面積建立標準曲線，得到對應的線性方程及相關系數(shù)，在一定濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈正比例關系，線性關系良好（見表1）。

表1 三氯蔗糖的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 回收率及精密度試驗

對不含三氯蔗糖的風味發(fā)酵乳在0.003，0.015和0.300 g/kg（定量限、5倍定量限和限量值）3個水平下進行添加回收試驗，按照1.2.2方法處理后進行測定6次，計算添加回收率（見表2）

從表2可以得出，該測定方法下三氯蔗糖的回收率滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[19]要求（90%～110%），且相對標準偏差低于5%，由此可以看出測定結(jié)果穩(wěn)定。

表2 回收率及相對標準偏差（n=6）

2.4 實際樣品測試

運用試驗方法對購自超市的5份風味發(fā)酵乳進行測定分析，每個樣品重復測定2次。結(jié)果表明5個樣本中1份樣品含有三氯蔗糖，檢出情況見表3（其中樣品色譜圖見圖6，空白樣品色譜圖見圖7）。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品營添加劑使用標準》[20]中風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖使用限量，所檢出的陽性樣品低于0.300 g/kg，符合國家標準要求。

表3 樣品中三氯蔗糖的測定

圖6 風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的液相色譜圖

圖7 空白樣品中三氯蔗糖的液相色譜圖

3 結(jié)論

試驗建立固相萃取柱凈化-液相色譜示差檢測器測定風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖含量檢測方法，重點研究提取試劑、提取時間、提取液的濃縮方法、固相萃取柱溶劑4個方面，試驗結(jié)果表明，前處理提取凈化效果對檢測結(jié)果準確性有很大的影響，固相萃取柱可有效消除風味發(fā)酵乳中雜質(zhì)對目標物的干擾。該方法測定結(jié)果準確、穩(wěn)定、可靠，三氯蔗糖在0.001 5～0.100 0 g/mL之間線性關系良好，平均回收率為90.3%～96.7%，方法定量限為0.003 g/kg，優(yōu)于GB 22255—2014[18]中規(guī)定的0.007 5 g/kg。該方法更加便于在日常工作中的推廣，為風味發(fā)酵乳中三氯蔗糖的測定提供重要參考。方法不足之處在于使用測定的檢測器為液相示差檢測器，然而示差檢測器對環(huán)境溫度有著極高的要求，且無法進行梯度洗脫。