液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬組織中58種獸藥殘留

熊增星，劉青，連琦，張文中，胡文斌*

1.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（南昌 330001）；2.上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司（上海 200233）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸銨（分析純，德國(guó)Merck公司）；試驗(yàn)用水為GB/T 6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水；標(biāo)準(zhǔn)溶液混標(biāo)（1.0 mg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；實(shí)際樣品來(lái)源于超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

API 6500+四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó) AB SCIEX公司）；SIL-30 AC 220V高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司）；IKA T18數(shù)顯型高速分散機(jī)（德國(guó)IKA公司）；HITACHI CR22N高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）；N-EVAP112型氮吹濃縮儀（美國(guó)Organomatian公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將多種獸藥混標(biāo)溶液（1.0 mg/mL）用甲醇稀釋成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用基質(zhì)空白溶液配成質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配，所有溶液放置于-18 ℃避光保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.00 g樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，按12 000 r/min均質(zhì)提取2 min后，在振蕩器上振蕩10 min；按8 000 r/min冷凍離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL離心管中，重復(fù)提取1次，合并上清液，待凈化。

采用QuEChERS對(duì)樣品凈化，取10 mL上清液加入到QuEChERS獸殘凈化小管中，渦旋混勻，按4 000 r/min，離心5 min，取5 mL上清液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL初始流動(dòng)相溶解，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定。此次研究采用空白基質(zhì)加標(biāo)樣品比較4種不同凈化方式的凈化效果。

1.3.3 儀器條件

一段時(shí)期以來(lái)，各地各級(jí)公安機(jī)關(guān)反饋認(rèn)為，不少公安類警察高校畢業(yè)生入警工作后，角色進(jìn)入慢、適應(yīng)能力不強(qiáng)，警務(wù)一線中所需要的實(shí)踐、實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用能力存在諸多不足之處。而制約這一問(wèn)題的主要瓶頸在于警察高校在應(yīng)用型人才的培養(yǎng)方面尚存短板，尤其是實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理方面普遍存在不重視、不規(guī)范、隨意性大等問(wèn)題，整體把控意識(shí)不強(qiáng)、力度不夠，實(shí)驗(yàn)、實(shí)訓(xùn)教學(xué)所必需的較為規(guī)范嚴(yán)謹(jǐn)?shù)幕竟芾眢w系尚未形成乃至實(shí)現(xiàn)。

1.3.3.1 液相色譜條件

Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸銨），流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫條件：0～1.5 min，99% A；1.5～10 min，99%～70% A；10～18 min，70%～20% A；18～21 min，20%～10% A；21～23 min，99% A。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization source，ESI）；掃描模式為正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)采集方式（multiple reaction monitoring，MRM）；氣簾氣壓力40 psi；離子源溫度550 ℃；噴霧氣40 psi；輔助加熱氣40 psi；碰撞氣：9 psi；電噴霧電壓5 500 V，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察Waters C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）對(duì)58種獸藥的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離效果明顯，峰形較好，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖見(jiàn)圖1。因此，選擇Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分離柱。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖（100 ng/mL）

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以流動(dòng)注射方式在正離子模式下對(duì)58種化合物混標(biāo)溶液（100.0 ng/mL）進(jìn)行母離子（Q1）全掃描，確定各目標(biāo)化合物的母離子，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描（MS2），對(duì)去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)化合物選擇2對(duì)響應(yīng)值高的特征離子對(duì)作為定量及定性離子對(duì)，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。液相色譜分離中采用乙腈和0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸銨）作為流動(dòng)相，通過(guò)對(duì)梯度洗脫優(yōu)化，使目標(biāo)化合物得到較好的分離，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 58種化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜采集參數(shù)及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.2 樣品前處理方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

對(duì)于豬組織中多類獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)分析，提取溶劑的選擇最關(guān)鍵。在選擇提取溶劑時(shí)，要考慮目標(biāo)物在溶劑中的溶解度、溶劑與基質(zhì)的浸透效果等因素。常用的提取溶劑有乙腈[7-9]、乙腈水溶液[10-11]、乙酸乙酯[12]、二氯甲烷、甲醇以及水的緩沖鹽[13]。樣品經(jīng)乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇提取后溶液中油脂含量較多，且雜質(zhì)去除效果不好，難控制[14]。乙腈是一種極性溶劑，當(dāng)用其作為提取溶劑時(shí)，能夠避免樣品中的脂肪也被過(guò)多提取，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)沉淀也起到很好效果。一定比例的水相調(diào)整乙腈極性可以同時(shí)兼顧多種極性不同的目標(biāo)化合物。由于凈化步驟選用固相萃取，若水相含量過(guò)高，則可能會(huì)使目標(biāo)化合物在固相萃取中被吸附，影響回收率，且后續(xù)氮吹濃縮過(guò)程也可能會(huì)受到影響[15]。綜合多種因素考慮，試驗(yàn)選擇80%乙腈水溶液作為最佳提取溶劑。

2.2.2 凈化方式的優(yōu)化

試驗(yàn)通過(guò)空白樣品在5.0 μg/kg水平下加標(biāo)回收，比較HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4種凈化方式對(duì)豬肉、豬肝、豬肚3種基質(zhì)中58種化合物回收率的影響，如圖2所示。結(jié)果表明：與其他3種凈化方法相比，樣品經(jīng)QuEChERS凈化后，3種基質(zhì)回收率在80%～110%的獸藥數(shù)量最多，分別為24，44和38種；低于60%或超過(guò)120%的獸藥數(shù)量相對(duì)較少，只有3，1和5種，顯示出較好的回收率效果。HLB凈化方式在豬肝、豬肚基質(zhì)中的回收率與QuEChERS相當(dāng)，而在豬肉基質(zhì)的回收率稍差一些；PRiMEHLB和正己烷除脂凈化方式相對(duì)較差。實(shí)際試驗(yàn)中HLB凈化方案操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，因此選用QuEChERS凈化。

圖2 不同凈化方式對(duì)豬肉、豬肝、豬肚組織中58種獸藥的回收率在各區(qū)間的分布

接表1

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

在優(yōu)化的提取、凈化和質(zhì)譜分析條件下，58種化合物在空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度（1.0～100.0 ng/mL）與對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。在基質(zhì)空白樣品中，添加一定濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算得58種化合物的檢出限分別為0.3～1.5 μg/kg，以定量離子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限分別為1.0～5.0 μg/kg，其中紅霉素的檢出限和定量限分別為1.5 μg/kg和5.0 μg/kg，其他57種化合物的檢出限和定量限為0.3 μg/kg和1.0 μg/kg，符合我國(guó)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限的要求，可滿足日常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需求，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 回收率與精密度

在1.0，2.0和5.0 μg/kg水平上，進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)，考察豬肉基質(zhì)的回收率和精密度。按照1.3.2處理樣品，各制備6份加標(biāo)樣品，上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。平均加標(biāo)回收率在63.9%～130.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，SRSD，n=6）為0.08%～10.15%，方法準(zhǔn)確度和精密度滿足要求。以60%～120%為標(biāo)準(zhǔn)，有83%種化合物的回收率落在合理范圍內(nèi)，只有少數(shù)化合物的回收率小于60%或大于120%，如替硝唑、磺胺嘧啶、惡喹酸、雙氟沙星、差向金霉素、替米考星等?？紤]到試驗(yàn)方法分析的獸藥種類較多，各化合物極性相差較大，對(duì)于有少數(shù)回收率不好的獸藥，屬于正常現(xiàn)象[16]。對(duì)于回收率不太好的獸藥，該方法的檢出限低于我國(guó)限量標(biāo)準(zhǔn)，所以即使回收率較差也可以保證檢出率。

表2 豬肉基質(zhì)樣品中3個(gè)濃度下加標(biāo)回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

接表2

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定豬肉、豬肝、豬肚等組織中58種獸藥殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定方法。比較HLB、QuEChERS、PRiMEHLB、正己烷除脂4種凈化方式對(duì)豬肉、豬肝、豬肚3種基質(zhì)中58種化合物回收率的影響，最終選取QuEChERS為最佳凈化方式。方法僅需1次前處理就可實(shí)現(xiàn)對(duì)喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、磺胺增效劑、四環(huán)素類、硝基咪唑類、林克胺類、抗病毒類八類獸藥殘留檢測(cè)。與國(guó)標(biāo)中按化合物類別分別檢測(cè)的方式相比，該方法不僅操作簡(jiǎn)便、檢驗(yàn)過(guò)程速度快、結(jié)果可靠，還節(jié)約大量有機(jī)試劑，減少人力和時(shí)間成本，提高檢測(cè)效率。該方法在養(yǎng)豬企業(yè)、豬肉類生產(chǎn)加工企業(yè)、市場(chǎng)監(jiān)管等部門(mén)使用中具有廣闊的前景。