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    大孔吸附樹脂法純化黑玉米花青素工藝

    2022-06-13 06:47:38王曉婷康明麗宋麗君閆家蔭
    食品工業(yè) 2022年5期
    關鍵詞:大孔花青素流速

    王曉婷,康明麗*,宋麗君,閆家蔭

    河北科技大學食品與生物學院(石家莊 050018)

    黑玉米(Black corn,ZeamaysL.)又稱為黑糯米、紫玉米,是被子植物門單子葉植物綱,為禾本目玉蜀黍屬植物[1]。與其他谷物相比,營養(yǎng)價值極高[2],并且含有豐富的微量元素、不飽和脂肪酸和人體必需氨基酸,尤其含有豐富的花青素,賦予黑玉米多種保健功能,既可作為糧食食用也可用于保健產(chǎn)品中。在膳食健康化的新潮流下,黑玉米產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展,又因其易于種植且產(chǎn)量較高而產(chǎn)地遍布全國[3]。雖然黑玉米中花青素含量較為豐富,但因提取出的黑玉米花青素粗提液含有大量多糖、脂肪和蛋白質而不易保存,且在黑玉米花青素純化工藝方面還未完善,所以亟需選取合適的純化方法對其進行純化。

    大孔吸附樹脂是一類具有大孔結構的高分子吸附材料,主要通過物理途徑進行篩選和純化樣品。根據(jù)不同的極性和單體結構的不同,主要分為極性、中極性和非極性3類[4]。據(jù)研究報道,利用大孔吸附樹脂在中草藥成分純化中做過大量研究,如黃酮類化合物精制、皂苷類精制、生物堿類精制以及復方制劑類精制等[8]。大孔吸附樹脂法純化花青素的研究較多,如:趙文娟等[5]利用大孔吸附樹脂法分離純化黑果枸杞中的原花青素,探究其分離純化的工藝條件;劉麗南等[6]利用大孔樹脂法對山楂中的原花青素進行分離純化,并對動脈血管的舒張作用進行探究;原紅霞等[7]在5種大孔吸附樹脂中篩選出分離純化靜樂黑枸杞花青素的最佳大孔吸附樹脂,并優(yōu)化其純化條件。黑玉米花青素的研究重點在于其營養(yǎng)保健功能和特殊藥理作用兩方面[21],對黑玉米花青素純化工藝尚待優(yōu)化。試驗在相關參考文獻基礎上,選用3種不同極性的大孔吸附樹脂,通過靜態(tài)吸附和解吸試驗篩選出適合分離純化黑玉米花青素的大孔吸附樹脂,對靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸試驗進行研究,探究對黑玉米花青素最佳的分離純化條件,并與純化前濃度進行對比,為黑玉米花青素純化工藝提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 黑玉米花青素的提取

    “黑珍珠”黑玉米,采摘自河北省邢臺市威縣,采摘時間為2020年5月。取新鮮黑玉米籽粒在60 ℃恒溫干燥后磨粉并過0.452 mm(40目)篩得粗提物,在干燥、0 ℃且避光的場所保存。將濃度52%的酸性酶液添加到粗提物中,在40 ℃下恒溫振搖15 min后抽濾,將所收集的濾液置于旋轉蒸發(fā)儀中進行富集濃縮,在轉速5 000 r/min條件下高速離心20 min,去除蛋白質、脂肪等雜質得到濃縮后的濾液,于0 ℃低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 試驗藥品

    乙酸乙酯(分析純,天津市永大化學制劑廠);AB-8型大孔吸附樹脂(一級品,天津市光復精細化工廠);X-5型大孔吸附樹脂(一級品,天津市光復精細化工廠);DM130型大孔吸附樹脂(一級品,天津市光復精細化工廠);氫氧化鈉(分析純,天津市大陸化學試劑廠);鹽酸(優(yōu)級純,天津市歐博凱化工有限公司);無水乙醇(分析純,天津市永大化學制劑廠);纖維素酶(生化試劑,北京索萊寶科技有限公司);石油醚(分析純,天津市永大化學試劑有限公司);檸檬酸(分析純,天津市大陸化工有限公司);抗壞血酸(分析純,天津歐博凱化工有限公司)。

    1.1.3 儀器與設備

    FA2204B電子天平(上海市安亭電子儀器廠);RE-600旋轉蒸發(fā)儀(上海市亞榮生化儀器廠);LGJ-10D真空冷凍干燥機(北京四環(huán)科學儀器廠有限公司);FW-100高速萬能粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);DHG-9003BS電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療儀器制造有限公司);UV-5100B紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 大孔吸附樹脂的活化

    參考許先猛等[9]的方法對大孔吸附樹脂進行活化,對3種大孔吸附樹脂分別使用90%的乙醇浸泡24 h,抽濾晾干,加入蒸餾水重復沖洗至水不渾濁再抽濾至無醇味為止,使用去離子水配制的5%氫氧化鈉溶液,按照2∶1比例對大孔吸附樹脂浸泡12 h,抽濾晾干,加入蒸餾水重復沖洗至水不渾濁再抽濾至無醇味為止,使用去離子水配制的5%鹽酸溶液,按照2∶1比例對大孔吸附樹脂浸泡12 h,之后抽濾晾干,加入蒸餾水重復沖洗再抽濾直至中性且無明顯味道。晾干,常溫下儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 靜態(tài)吸附率和解吸率的計算

    準確稱取2.0 g大孔吸附樹脂于150 mL錐形瓶中,加入40 mL黑玉米花青素粗提液樣品溶液,在25 ℃條件下恒溫振蕩12 h,振蕩速率250 r/min,抽濾晾干,用100 mL 90%乙醇洗脫。通過式(1)和(2)計算吸附率和解析率。

    式中:c初始為樣液吸附前的初始濃度,mg/mL;c吸附后為樣液吸附后的吸附濃度,mg/mL;c解吸液為解吸液中花青素的濃度,mg/mL;V解吸液為解吸液的體積,mL;V吸附后為平衡吸附后樣液的體積,mL。

    1.2.3 大孔吸附樹脂對黑玉米花青素靜態(tài)吸附與解吸試驗

    1.2.3.1 吸附時間對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    準確稱取2.0 g大孔吸附樹脂于150 mL錐形瓶中,加入40 mL 1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液樣品溶液,在25 ℃條件下恒溫振蕩12 h,振蕩速率250 r/min,每隔1 h取樣測定樣品中的黑玉米花青素含量,以時間為橫坐標、吸附率為縱坐標,繪制大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線[10]。

    1.2.3.2 吸附溫度對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    準確稱取2.0 g大孔吸附樹脂于150 mL錐形瓶中,加入40 mL 1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液樣品溶液,在15,20,25,30和35 ℃條件下恒溫振蕩12 h,振蕩速率250 r/min,每隔1 h取樣測定樣品中的黑玉米花青素的含量,以時間為橫坐標、吸附率為縱坐標,繪制大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線。

    1.2.3.3 pH對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    準確稱取2.0 g大孔吸附樹脂于150 mL錐形瓶中,加入40 mL 1.5 mg/mL的黑玉米花青素粗提液樣品溶液,在25 ℃條件下恒溫振蕩12 h,并用5%磷酸氫二鈉和5%磷酸二氫鈉微調樣品pH為2.0,3.0,4.0,5.0和6.0,振蕩速率250 r/min,每隔1 h取樣測定樣品中的黑玉米花青素含量,以時間為橫坐標、吸附率為縱坐標,繪制大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線。

    1.2.3.4 大孔吸附樹脂的解吸動力學曲線

    將吸附完全的大孔吸附樹脂抽濾晾干置于具塞錐形瓶中,加入不同體積分數(shù)乙醇溶液對大孔樹脂進行解吸,并以時間為橫坐標,解吸液中的黑玉米花青素含量為縱坐標,繪制靜態(tài)解吸曲線[11]。

    1.2.4 大孔吸附樹脂對黑玉米花青素動態(tài)吸附與解吸試驗

    上樣黑玉米花青素粗提液經(jīng)過已處理的大孔吸附樹脂,通過濕法裝柱至LG聚四氟活塞層析柱中層析,收集層析后的濾液,測定吸附殘液中的黑玉米花青素濃度。因在大孔吸附樹脂的吸附下,隨著樣液體積的增加,花青素濃度降低,為表現(xiàn)在不同條件下大孔吸附樹脂的吸附效果,以吸附殘液的體積為橫坐標、殘液中的黑玉米花青素濃度為縱坐標,繪制花青素動態(tài)吸附曲線。在達到泄漏點濃度(即吸附濾液濃度為進樣前濃度的1/10)時停止進樣。用蒸餾水清洗層析柱并取出作為濾層的大孔吸附樹脂,此時大孔吸附樹脂吸附幾近飽和,使用一定體積分數(shù)的乙醇溶液為解吸劑對大孔吸附樹脂進行洗脫,以解吸液的體積為橫坐標、解吸液中的花青素含量為縱坐標,繪制動態(tài)解吸曲線[12]。

    1.2.4.1 上樣量對動態(tài)吸附效果的影響

    當濾液中的花青素濃度為上樣提取液中花青素濃度的1/10時,認為達到泄漏點濃度。收集50 mL經(jīng)過預處理的大孔吸附樹脂,濕法裝柱裝入層析柱中,加入120 mL質量濃度1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液,控制其流速60 mL/h,收集濾液,每10 mL為1個單位,測定其中的花青素濃度,并以濾液體積為橫坐標,10 mL濾液中的黑玉米花青素濃度為縱坐標,繪制動態(tài)吸附曲線。

    1.2.4.2 上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響

    在層析柱中濕法裝柱50 mL經(jīng)過預處理的大孔吸附樹脂,并加入120 mL質量濃度1.5 mg/mL黑玉米花青素粗提液,控制其流速為20,40,60,80和100 mL/h,收集濾液,每10 mL為1個單位,測定其中的花青素濃度,并以濾液體積為橫坐標,10 mL濾液中的黑玉米花青素濃度為縱坐標,繪制動態(tài)吸附曲線。

    1.2.4.3 解吸液濃度對動態(tài)解吸效果的影響

    對吸附飽和的大孔吸附樹脂需要使用合適的解吸液進行解吸處理,解吸液的選擇主要是不同體積分數(shù)的乙醇溶液。因此,選擇使用150 mL的40%,50%,60%,70%和80%的乙醇溶液,以流速60 mL/h進行解吸,以10 mL為1個單位收集解吸液并測定黑玉米花青素濃度,以濾液體積為橫坐標,10 mL解吸液中的黑玉米花青素濃度為縱坐標,繪制動態(tài)解吸曲線。

    1.2.4.4 解吸流速對動態(tài)解吸效果的影響

    對吸附飽和的大孔吸附樹脂需要使用合適的解吸液進行解吸處理,解吸液為150 mL體積分數(shù)60%的乙醇溶液,以流速20,40,60,80和100 mL/h進行解吸,測定解吸液中的黑玉米花青素解吸率,以解吸液流速為橫坐標,解吸率為縱坐標,繪制動態(tài)解吸柱形圖。純化效率驗證試驗取純化后的黑玉米花青素提取液于分光光度計,根據(jù)花青素標準品標準曲線計算濃度,對比純化前的提取液,比較純度差異[13]。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    每組試驗重復3次,結果以平均值±標準差的形式表示,使用SPSS Statistics 25進行數(shù)據(jù)分析,通過Duncan檢驗分析各組數(shù)據(jù)的差異顯著性(p<0.05),并使用Origin 2019繪圖。

    2 試驗結果

    2.1 大孔吸附樹脂對黑玉米花青素靜態(tài)吸附與解吸試驗結果

    2.1.1 不同大孔吸附樹脂的選擇

    對3種大孔吸附樹脂進行靜態(tài)吸附和解吸試驗,結果如圖1所示。在靜態(tài)吸附試驗時,AB-8型樹脂的吸附率可達91.3%,DM-130型樹脂的吸附率達84.9%,而X-5型樹脂的吸附率較小,結果為76.6%。可能是花青素含有多個羥基和酚羥基基團,比較容易被含有酯基的吸附樹脂所吸引形成氫鍵結合,從而分離親水物質和疏水物質,而AB-8型樹脂屬于弱極性大孔吸附樹脂,對水溶性、弱極性物質的純化極佳,所以能夠達到較高的吸附率。X-5型樹脂主要為苯乙烯型非極性共聚體,適用于大分子物質分離純化[14],對于花青素雜質的吸附過多,造成成品含量較低。DM-130型樹脂為聚苯乙烯型吸附樹脂,適用于具有疏水性的物質提取[15],較AB-8型有一定差異。解吸過程中,與X-5型樹脂和DM-130型樹脂相比,AB-8型樹脂的解吸率較高。綜合吸附試驗考慮,AB-8型大孔吸附樹脂更適合用于對花青素的吸附。

    圖1 不同大孔吸附樹脂的選擇結果

    2.1.2 吸附時間對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    由圖2可以看出,AB-8型大孔吸附樹脂在0~2 h內(nèi)吸附率急劇增加,在9 h后增長速率減緩,之后達到吸附平衡,并在12 h時吸附率達97.6%。通過試驗可以得知,AB-8型大孔吸附樹脂對黑玉米花青素具有良好的吸附效果,出現(xiàn)先增快后增慢的情況主要原因可能是前期即0~7 h時吸附樹脂未飽和,開始大量吸附花青素,到后期9~12 h時吸附近飽和,原因可能是AB-8型大孔吸附樹脂中的疏水基開始排斥有效物質或者粗提液中花青素吸附完畢,導致吸附率達到最高點并保持平衡。因此,根據(jù)吸附動力學研究,大孔吸附樹脂的吸附時間9 h較好。

    圖2 吸附時間對AB-8型大孔吸附樹脂吸附率的影響

    2.1.3 吸附溫度對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    由圖3可以看出,溫度對AB-8型大孔吸附樹脂的吸附效果有顯著的影響。溫度在15~25 ℃時,吸附率逐漸增大,在15~35 ℃時吸附率逐漸降低,在25 ℃時達到最高點。原因可能是高溫下,分子活動劇烈,吸附樹脂不易形成分子鍵對有效物質進行捆綁,溫度過低又導致有效成分分子活動速率減小不利于分子鍵力的形成,從而吸附率降低[16]。因此,采用25 ℃作為AB-8型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附的溫度較好。

    圖3 溫度對AB-8型大孔吸附樹脂吸附率的影響

    2.1.4 pH對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    由圖4可以看出,pH對大孔吸附樹脂的吸附能力有較大影響。pH 2~3時,AB-8型吸附樹脂的吸附率較低,pH 5時吸附率最高。pH 5~9時,吸附率逐漸降低。原因可能是黑玉米花青素為弱酸性物質,因此更適合在酸性條件下進行吸附,堿性環(huán)境還可能會破壞花青素的結合鍵位,造成吸附率不高,吸附效果不好[17]。在酸性條件下對花青素吸附率較低的原因是酸性環(huán)境使大孔吸附樹脂失水,大孔吸附樹脂孔徑增大,導致對花青素吸附率較低[18]。因此,采用pH 5作為AB-8型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附的試驗條件較好。

    圖4 pH對AB-8型大孔吸附樹脂吸附率的影響

    2.2 動態(tài)吸附試驗

    2.2.1 上樣量對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響上樣量對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響如圖5所示。樣品體積40 mL時,殘液質量濃度為0.149 mg/mL,為原提取液質量濃度1.5 mg/mL的10%,即殘液質量濃度達到泄漏點質量濃度。殘液質量濃度達到樣品質量濃度的1/10時的樣品量為最佳上樣量體積,即殘液質量濃度突然增大時的體積作為上樣終點。過少的上樣量可能會導致吸附效率降低,無法發(fā)揮吸附能力,而過多的上樣量會導致大孔吸附樹脂再生能力減弱,造成試驗樣品的浪費,也導致大孔吸附樹脂的吸附效率降低,所以選擇上樣量40 mL較好。

    圖5 上樣量對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    2.2.2 上樣流速對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    上樣流速不同,導致花青素分子在AB-8型大孔吸附樹脂內(nèi)部的擴散作用不同,因此上樣流速對吸附效果的影響較大。在不同流速的影響下,隨著流出液體積增加,吸附率逐漸降低,使得殘夜質量濃度上升。通過圖6可以看出,流速20和40 mL/h時,流出液體積20 mL左右時殘液質量濃度達到泄漏點濃度,使得泄漏點時的濃度過小,原因是上樣流速過慢造成大孔吸附樹脂吸附到上樣樣品飽和后無法持續(xù)吸附,造成吸附時間增長,吸附效率降低。上樣流速80和100 mL/h時,流速過快,大孔吸附樹脂還未吸附飽和,形成的分子鍵因為流速過快而被破壞,上樣樣品停留時間過短也會造成吸附效率降低,并且造成樣品的過多耗費[19]。由圖6可知,上樣流速60 mL/h時,流出液體積20 mL即可達到泄漏點,耗費少,濃度高,吸附效率高,并且節(jié)約時間,有利于后期試驗,故上樣速率選擇60 mL/h。

    圖6 上樣速率對AB-8型大孔吸附樹脂吸附效果的影響

    2.2.3 解吸液濃度對AB-8型大孔吸附樹脂解吸效果的影響

    在不同體積分數(shù)乙醇溶液的洗脫下,解吸率表現(xiàn)出不同程度的增加,隨著流出液體積增加,流出液中花青素濃度降低,以達到解吸效果。由圖7可以看出,隨著流出液體積增多,流出液質量濃度出現(xiàn)先增大后減小趨勢,原因可能是隨著洗滌液增多,原先吸附的有效物質逐漸減少,造成質量濃度降低。觀察發(fā)現(xiàn),所有洗滌液全部在25 mL出現(xiàn)質量濃度高峰,隨后逐步降低。其中:40%和80%乙醇溶液洗滌時,在80和90 mL才達到泄漏點,對于洗滌液的體積要求過高;60%和70%乙醇溶液洗滌時,在80 mL時達到泄漏點,對于洗滌液濃度要求過高并且泄漏點明顯滯后,造成效率過低;50%乙醇溶液洗滌時,泄漏點固定在60 mL,并且后續(xù)增加流出液體積,濃度變化不大,提取效率高。關于洗滌劑體積分數(shù)越高洗出液質量濃度反而越低,可能的原因是有效物質是黑玉米花青素,為水溶性物質,有機試劑濃度過高會導致溶液溶解的有效物質減少,達到飽和后不能繼續(xù)溶解造成泄漏點之后,解吸效率減少[19]。因此綜合考慮,試驗選擇50%的乙醇溶液為解吸液體積分數(shù),并且解吸液體積為65 mL。

    圖7 解吸液體積分數(shù)對AB-8型大孔吸附樹脂解吸效果的影響

    2.2.4 解吸流速對AB-8型大孔吸附樹脂解吸效果的影響

    由圖8可以看出,隨著流速增加,解吸率呈先逐漸增長,再趨于平緩,最后呈逐漸下降趨勢,流速50 mL/h時,解吸率達到最高。原因可能是:流速較慢時,解吸液在層析柱中停留時間過長,造成解吸液解吸飽和,解析效率較低,之后提高流速,吸附效率逐漸增高,最后因流速過快,解吸液未能成功洗脫而直接流出層析柱[20],造成浪費,解吸效率也逐漸降低。因此,綜合考慮選擇解吸流速50 mL/h較為合適。

    圖8 解吸流速對AB-8型大孔吸附樹脂的解吸效果的影響

    2.2.5 純化效率驗證試驗

    經(jīng)過對純化數(shù)據(jù)驗證,與未處理的花青素粗提液純度40.5%相比,純化后黑玉米花青素提取液純度達73.8%,濃度提高近1倍,說明大孔吸附樹脂有效提高黑玉米花青素濃度。

    3 討論

    通過AB-8型大孔吸附樹脂對黑玉米花青素進行分離純化,AB-8型大孔吸附樹脂可有效分離黑玉米花青素粗提液中的雜質成分,提高黑玉米花青素的純度。與前人研究對比,效果較明顯。

    3.1 利用同種類型的大孔吸附樹脂純化效果不同

    楊敏[24]利用AB-8型大孔吸附樹脂純化紫玉米中的花青素,可將純度提高至89.6%,純化效果顯著,原因是利用乙醇提取的粗提液中紫玉米花青素的含量較高,提取率較高,為90.49%,在純化過程中可顯著提高紫玉米花青素的純度。

    3.2 利用不同種類型的大孔吸附樹脂純化效果不同

    原紅霞等[7]利用HPD100型大孔吸附樹脂純化靜樂黑枸杞花青素后,純度提高至17.82%,純化效果不明顯,原因是非極性吸附樹脂,與弱極性吸附樹脂的AB-8型大孔吸附樹脂相比,純化花青素的效果較差,且因原料的不同,導致純化效果的差異。許志新等[23]利用D-101型大孔吸附樹脂純化紫玉米籽粒與穗軸中的花青素,利用70%乙醇-0.02%鹽酸(V/V)作為解吸液,純化后穗軸花青素純度提高至29.76%,籽粒花青素純度提高至22.64%,純度較低,原因可能是D-101型大孔吸附樹脂屬于非極性樹脂,在解吸液的選擇中,利用乙醇-鹽酸的混合液作為解吸液不利于黑玉米花青素的純化,純化效果較差。朱敏等[25]篩選出X-5型大孔吸附樹脂對黑玉米花青素提取效果較好,與AB-8型大孔吸附樹脂吸附率接近,原因是X-5型樹脂的吸附率常數(shù)較大,對黑玉米花青素的吸附速率快吸附效果好。

    3.3 利用同種大孔吸附樹脂對不同物質純化效果不同

    李三省等[22]利用AB-8型大孔吸附樹脂純化黑果枸杞中的原花青素,純化后濃度提高至62.36%,純化濃度不高,原因可能是AB-8型大孔吸附樹脂屬于弱極性吸附樹脂,對原花青素的吸附效果較差而對花青素的吸附效果較好,故利用AB-8型大孔吸附樹脂純化原花青素效果較差。陳紅玲等[26]利用AB-8型大孔樹脂純化玉米須中的總黃酮,純化效果較高,純度為87.9%,原因可能是總黃酮屬于黃酮類物質,與花青素相比,更適合于AB-8型大孔吸附樹脂的純化。

    利用試驗條件純化效果顯著,純化度較高,具有重要的研究意義,從而完善黑玉米花青素的分離純化工藝。

    4 結論

    試驗通過研究3種大孔吸附樹脂對黑玉米花青素純化效果的影響,以靜態(tài)吸附率和解吸率為指標,發(fā)現(xiàn)AB-8型大孔吸附樹脂綜合效果最佳。

    結果表明:在靜態(tài)吸附試驗中,調節(jié)上樣液pH 5,在25 ℃的吸附溫度下吸附時間達到9 h效果較好;在動態(tài)吸附和解吸試驗中,上樣量40 mL、上樣流速60 mL/h、解吸液乙醇體積分數(shù)50%、解吸液體積65 mL和解吸流速50 mL/h時效果較好。

    利用上述試驗條件純化黑玉米花青素后,黑玉米花青素提取液純度到73.8%,比純化前的濃度提高近1倍左右,外觀形態(tài)為紫黑色粉末,純化效果較為明顯,故可利用AB-8型大孔吸附樹脂分離純化黑玉米花青素。

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