葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠空腸損傷及腸上皮細(xì)胞組成變化的研究

匡雁玲，萬(wàn)志成，李 佩，陳欽亮，楊彩梅，劉金松，劉玉蘭，王 丹*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

腸道作為機(jī)體與外界接觸面積最大的器官，其健康狀況對(duì)機(jī)體至關(guān)重要。腸道主要由肌肉層、黏膜層以及覆蓋于黏膜層上的腸上皮構(gòu)成。腸上皮由腸道干細(xì)胞不斷增殖分化而來(lái)的各種功能細(xì)胞組成，包括腸吸收細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞等。腸道具有消化吸收作用——消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，運(yùn)輸電解質(zhì)和分泌蛋白質(zhì)等用途，維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。此外，腸道還構(gòu)成一道具有免疫作用的屏障來(lái)防御有害物質(zhì)入侵機(jī)體。據(jù)報(bào)道，腸道各種功能細(xì)胞組成的改變與腸道炎癥性疾病（炎癥性腸病、腸應(yīng)激綜合征等）的發(fā)生以及如膿毒癥和敗血癥等消化道疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，研究腸道損傷后，腸道各種功能細(xì)胞的組成變化對(duì)預(yù)防各種腸道疾病具有十分重要的意義。

研究表明，葡聚糖硫酸鈉（DSS）會(huì)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，導(dǎo)致小鼠腸道黏膜和組織損傷。炎癥性腸炎（IBD）小鼠腸道干細(xì)胞增殖活性會(huì)下降，并會(huì)使得腸道干細(xì)胞向杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞等分泌型細(xì)胞分化。同樣，相關(guān)研究也報(bào)道DSS 誘導(dǎo)小鼠第7 天后結(jié)腸中會(huì)出現(xiàn)異常分化的潘氏細(xì)胞，其分泌的防御素表達(dá)上調(diào)，而杯狀細(xì)胞無(wú)顯著影響。目前的研究主要是探究DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后破壞腸道屏障，并對(duì)腸道干細(xì)胞增殖分化造成的影響?？漳c作為機(jī)體胃腸道的前端，在DSS 誘導(dǎo)下其是否也會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)并影響腸上皮細(xì)胞的組成目前還不明確。因此，本試驗(yàn)旨在研究DSS 誘導(dǎo)小鼠損傷后，空腸組織形態(tài)學(xué)、ATP 含量、炎性因子表達(dá)以及腸上皮細(xì)胞組成的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 12 只體重（21.74±1.05）g 的6 周齡雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠購(gòu)自北京貝恩特生物科技有限公司。DSS 的分子量為6 000～50 000，購(gòu)自MP Biomedicals 公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)將12 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和DSS 組，每組6 只，組間體重?zé)o明顯差異，飼喂基礎(chǔ)日糧，自由飲水，室溫25℃，光照/黑暗時(shí)間設(shè)置為12 h/12 h。適應(yīng)期2 周后開始正式試驗(yàn)。對(duì)照組繼續(xù)飲用純凈水，而DSS 組則飲用添加了2.5% DSS 的純凈水。第8 天，小鼠禁食4 h 后稱重處死，取空腸前端約1 cm 2 份，分別置于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定，然后收集空腸組織放于-80℃待測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 代謝表型 每天在同一時(shí)間點(diǎn)觀察小鼠的行為情況及體況，記錄腹瀉情況、觀察糞便及肛門出血情況，并記錄體重。根據(jù)小鼠體重、糞便形態(tài)以及出血情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分表1。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)分析

1.3.2.1 HE 染色分析 將固定于4% 多聚甲醛的空腸組織樣品制成HE 染色切片，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察空腸的組織形態(tài)。具體制備方法及形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定參照Liu 等。

1.3.2.2 透射電鏡分析 將固定于2.5% 戊二醛的空腸組織樣品，通過處理后進(jìn)行電鏡觀察，具體測(cè)定方法參照華洪葳。

1.3.3 空腸組織中ATP 含量的測(cè)定 空腸組織中ATP 含量測(cè)定具體方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行操作，試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3.4 空腸組織中炎性細(xì)胞因子、腸道干細(xì)胞和各種功能細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)量測(cè)定 炎性細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-（）、白細(xì)胞介素-1（）、白細(xì)胞介素-6（）；腸道干細(xì)胞標(biāo)記基因包括亮氨酸重復(fù)序列 G 蛋白偶聯(lián)受體5（）、無(wú)剛毛鱗甲復(fù)合體樣蛋白2（）；腸道功能細(xì)胞標(biāo)記基因包括分泌黏蛋白（）、堿性磷酸酶（）、溶菌酶（）的mRNA 表達(dá)量用Real-time PCR 技術(shù)分析，以為內(nèi)參基因，采用Livak的2法進(jìn)行計(jì)算。所需試劑購(gòu)自TaKaRa 公司，引物序列見下表2。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析2 個(gè)處理組間差異，以<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 DSS 處理對(duì)小鼠體重、腹瀉分?jǐn)?shù)及疾病指數(shù)的影響如圖1 所示，與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠肛門出血和體重降低，其中第5 天體重顯著降低，第6、7、8 天體重極顯著降低；與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠的腹瀉分?jǐn)?shù)和疾病指數(shù)均在第5 天開始出現(xiàn)極顯著差異。

圖1 DSS 處理對(duì)小鼠代謝表型影響

2.2 DSS 處理對(duì)小鼠的空腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 如圖2 和表3 所示，對(duì)照組小鼠空腸的隱窩-絨毛軸結(jié)構(gòu)完好，而DSS 組小鼠空腸的隱窩-絨毛軸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。與對(duì)照組相比，DSS 組空腸的絨毛高度/隱窩深度極顯著降低，其中絨毛高度極顯著降低，而隱窩深度差異不顯著。

表3 DSS 處理對(duì)小鼠空腸形態(tài)學(xué)的影響

圖2 DSS 處理小鼠空腸HE 染色結(jié)果（100×）

2.3 DSS 處理對(duì)小鼠空腸中炎癥細(xì)胞因子相對(duì)mRNA 表達(dá)的影響 如表4 所示，與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠空腸組織中的炎性因子、、的mRNA 的表達(dá)量均顯著提高。

表4 DSS 處理對(duì)小鼠中空腸中炎癥因子的mRNA 表達(dá)的影響

2.4 DSS 處理對(duì)小鼠空腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖3所示，對(duì)照組小鼠空腸上皮細(xì)胞均未發(fā)生明顯損傷，表現(xiàn)為微絨毛緊密排列，緊密連接正常，線粒體正常。然而，DSS 組小鼠的空腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損呈微絨毛略有稀疏，緊密連接略有模糊，且存在少部分的線粒體固縮等現(xiàn)象。

圖3 DSS 處理對(duì)小鼠空腸上皮超微結(jié)構(gòu)的影響（Hitachi TEM system，×2.5 K）

2.5 DSS 處理對(duì)小鼠空腸中ATP 含量的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠空腸中ATP 含量極顯著降低。

圖4 DSS 處理對(duì)小鼠空腸中ATP 含量的影響

2.6 DSS 處理對(duì)小鼠空腸腸道干細(xì)胞以及各種功能細(xì)胞標(biāo)記基因的影響 如表5 所示，與對(duì)照組相比，DSS 組小鼠空腸干細(xì)胞的標(biāo)記基因及杯狀細(xì)胞的標(biāo)記基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)量顯著降低，腸吸收細(xì)胞的標(biāo)記基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)量極顯著降低，潘氏細(xì)胞的標(biāo)記基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)量有顯著降低的趨勢(shì)（=0.061）。

表5 DSS 處理對(duì)小鼠空腸中腸道干細(xì)胞和各種功能細(xì)胞標(biāo)記基因mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

腸道在受不同的外源因素（細(xì)菌、內(nèi)毒素、病毒等）影響下，會(huì)造成腸道黏膜損傷，腸道屏障功能破壞，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而發(fā)生腸炎。研究表明，給小鼠飲用含DSS 的純凈水會(huì)促使腸道發(fā)生時(shí)間依賴性炎癥反應(yīng)，從而造成小鼠腸道損傷。DSS 主要通過刺激機(jī)體產(chǎn)生過量的炎性細(xì)胞因子（、、等），激活NF-B 信號(hào)通路，進(jìn)而激活下游靶基因產(chǎn)生促炎介質(zhì)，誘導(dǎo)腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此，本試驗(yàn)采用DSS 來(lái)構(gòu)建小鼠的腸道損傷模型，以研究DSS 誘導(dǎo)的腸道損傷與空腸線粒體代謝和各種功能細(xì)胞組成變化的相關(guān)性。

研究表明，小鼠受到抗生素或者其他藥物刺激后，小鼠的代謝表型變化是最為直接的，包括采食量、體重、DAI 等。因此實(shí)驗(yàn)中常用小鼠的體重情況和DAI 評(píng)分來(lái)評(píng)估其具體病情。Kuprys 等研究發(fā)現(xiàn)，DSS 誘導(dǎo)小鼠體重顯著下降、結(jié)腸顯著縮短，DAI 顯著升高。這與本試驗(yàn)結(jié)果類似，DSS 組小鼠體重顯著降低，嚴(yán)重者可觀察到肛門出血，且腹瀉指數(shù)和DAI 顯著升高。小鼠體重降低可能是由于飲水中添加DSS 降低了小鼠飲水量和采食量；而肛門出血和腹瀉比例增加可能是由于DSS 誘導(dǎo)了結(jié)腸炎性細(xì)胞因子的升高以及破壞了結(jié)腸的屏障功能。

腸黏膜形態(tài)可以反映腸道屏障的完整性，常通過絨毛高度和隱窩深度來(lái)評(píng)價(jià)其受損程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DSS 組小鼠空腸的隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)受損，且絨毛高度顯著降低。Zhou 等研究發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素刺激會(huì)誘導(dǎo)小腸的絨毛高度和隱窩深度降低。綜上所述，推測(cè)DSS 刺激破壞了小鼠空腸黏膜屏障，并且可能伴有炎癥。

研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激會(huì)導(dǎo)致空腸炎性因子、、的表達(dá)上調(diào)。Qin 等研究發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎會(huì)伴隨著結(jié)腸中炎性細(xì)胞因子（、、）表達(dá)增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即DSS 處理會(huì)誘導(dǎo)小鼠空腸組織中的炎性因子、和的mRNA 表達(dá)量顯著升高。推測(cè)可能是因?yàn)镈SS 誘導(dǎo)腸道屏障的通透性以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透性發(fā)生改變，造成腸道損傷。

腸道上皮的完整性是抵御外界環(huán)境中細(xì)菌和病毒等入侵機(jī)體的關(guān)鍵。本研究通過電鏡觀察腸道上皮結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，DSS 組小鼠空腸上皮細(xì)胞微絨毛的排列略有稀疏，緊密連接略有模糊，且存在少部分的線粒體固縮等現(xiàn)象。線粒體作為產(chǎn)生ATP 的關(guān)鍵場(chǎng)所，因此我們推測(cè)DSS 可能影響空腸中ATP 的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，DSS 組小鼠空腸中ATP 含量減少，這可能是因?yàn)镈SS破壞了線粒體形態(tài)，降低了線粒體膜電位，影響了線粒體發(fā)生氧化磷酸化反應(yīng)。Cao 等研究表明，LPS 誘導(dǎo)仔豬腸道損傷時(shí)會(huì)伴隨小腸線粒體能量代謝紊亂，這與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

腸上皮細(xì)胞的完整性是腸屏障功能的基礎(chǔ)。腸道干細(xì)胞主要參與腸道的自我更新和維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。腸道干細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生各種功能細(xì)胞，成熟并遷移至絨毛頂端來(lái)發(fā)揮作用。潘氏細(xì)胞主要位于小腸隱窩中，能夠分泌溶菌酶（）、防御素等來(lái)抵御內(nèi)源性微生物刺激腸上皮，從而起到保護(hù)腸道屏障的作用，還能夠產(chǎn)生微環(huán)境為腸道干細(xì)胞提供生態(tài)位以維持其自我更新。杯狀細(xì)胞是一種分泌型腸上皮細(xì)胞，能夠分泌黏蛋白（）來(lái)防止外源因素對(duì)腸道屏障的損害。腸吸收細(xì)胞是腸道功能細(xì)胞中數(shù)量最多的一類細(xì)胞，主要參與機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。Khaloian 等研究發(fā)現(xiàn)，克羅恩病（CD）小鼠中Lgr5ISC 表達(dá)減少，且其分化異常，產(chǎn)生大量潘氏細(xì)胞。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DSS 組小鼠空腸中腸道干細(xì)胞的標(biāo)記基因和杯狀細(xì)胞的標(biāo)記基因的表達(dá)顯著降低，腸吸收細(xì)胞的標(biāo)記基因的表達(dá)極顯著降低，潘氏細(xì)胞的標(biāo)記基因的表達(dá)有顯著降低的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明DSS 處理降低了小鼠空腸中腸道干細(xì)胞及各種功能細(xì)胞數(shù)量。Davidson 等研究結(jié)果顯示，DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸腸道干細(xì)胞數(shù)量降低。綜上，DSS 處理降低了空腸中腸道干細(xì)胞數(shù)量，并且可能抑制了腸道干細(xì)胞向各種功能細(xì)胞分化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，DSS 刺激誘導(dǎo)小鼠空腸發(fā)生炎癥反應(yīng)，造成腸道損傷，降低了空腸中腸道干細(xì)胞和各種功能細(xì)胞的數(shù)量。