常規(guī)玉米與濕貯玉米不同比例組合對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響

彭述宇，曲永利，高偉星，曲嘉晨，劉紅志，苗人方

（黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

近年來，隨著奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，飼料原料的短缺與開發(fā)利用也成為我國各養(yǎng)殖場的一大挑戰(zhàn)。玉米能夠為奶牛中提供一定量的淀粉和蛋白，是我國奶牛日糧中的重要能量飼料之一。但由于我國玉米產(chǎn)量供不應(yīng)求，玉米價格持續(xù)增長，導(dǎo)致奶牛飼養(yǎng)成本也隨之增高，探索利用玉米的新方式成為研究關(guān)注點。高水分玉米籽粒濕貯不僅可使玉米的營養(yǎng)成分得到長期保存、提高玉米利用率，還可降低玉米市場價格波動的影響。韓吉雨等研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高水分濕貯玉米可降低奶牛飼養(yǎng)成本、提高生產(chǎn)效益。然而，飼喂大量高降解率的濕貯玉米也容易產(chǎn)生較多脂肪酸使瘤胃pH 降低，打破瘤胃內(nèi)菌體平衡，造成乳酸積累，易引起瘤胃酸中毒的風(fēng)險。目前，常規(guī)玉米與濕貯玉米在奶牛日糧中如何搭配使用尚未見報道。本試驗利用體外產(chǎn)氣法探究常規(guī)玉米與濕貯玉米間不同比例組合對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響，篩選出適宜的比例組合，為規(guī)?；膛隹茖W(xué)利用濕貯玉米、降低奶牛飼料成本提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 籽粒水分為25%～35%、處于完熟期的全穗玉米顆粒（先達(dá)101）于2020 年10 月取自黑龍江省九三管局大西江農(nóng)場玉米種植地。2020 年10 月于黑龍江省嫩江縣大西江麒源牧場將其進(jìn)行脫粒、粉碎、壓實、密封貯藏，于2021 年6 月25 日進(jìn)行采集；常規(guī)玉米采集于大慶市禾豐牧業(yè)粉碎過篩后的玉米粉。2 種飼料樣品的實測常規(guī)養(yǎng)分見表1。

表1 濕貯玉米和常規(guī)玉米主要營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

1.2 瘤胃液采集 瘤胃液取自黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城試驗基地3 頭飼喂壓縮玉米秸稈且裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛。在試驗當(dāng)天晨飼前2 h 采集瘤胃液，將其混合置于預(yù)先通有CO并且用瘤胃液潤洗的保溫瓶中，蓋嚴(yán)后迅速帶回實驗室?；靹蚝蠼?jīng)4 層紗布過濾，置于39℃水浴中恒溫并向容器中持續(xù)通入CO，使瘤胃液保持在厭氧狀況下保存待用。

1.3 體外發(fā)酵試驗 采用單因素試驗設(shè)計，以常規(guī)玉米作為對照組（100:0），在干物質(zhì)基礎(chǔ)上將常規(guī)玉米與濕貯玉米以不同比例組合作為發(fā)酵底物（70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、0:100），每個組合設(shè)置3 個重復(fù)，同時設(shè)置3 個空白對照組（不放置底物），用于校正產(chǎn)氣。參考MenKe 等的方法配置緩沖液，調(diào)節(jié)pH 至6.0～7.0，預(yù)熱到39℃并持續(xù)通入CO，將采集處理好的瘤胃液與緩沖液以1:2 的比例混合配置成人工瘤胃培養(yǎng)液，在水浴中保持39℃恒溫并持續(xù)通入CO至飽和。

準(zhǔn)確稱取0.4 g 發(fā)酵底物置于飼料分析纖維濾袋中，密封后送至100 mL 的培養(yǎng)管底部（空白組不放入任何底物），在玻璃針管活塞表面均勻涂抹適量的醫(yī)用凡士林，起到潤滑和防止玻璃針管漏氣作用，迅速將45 mL混合好的人工培養(yǎng)液分裝到各培養(yǎng)管中，排盡管內(nèi)空氣并記錄初始刻度，將培養(yǎng)管放入39℃水浴恒溫振蕩器（DSHZ-600）開始進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)48 h 發(fā)酵后將培養(yǎng)管放入冷水中終止發(fā)酵。將每組平行樣發(fā)酵液倒入50 mL離心管中，測定其pH 之后進(jìn)行離心（4℃，4 000 r/min，30 min)，取上清液分裝到10 mL 離心管中，置于-20℃冰箱中進(jìn)行冷藏，用于氨態(tài)氮（NH-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測定。取出纖維濾袋反復(fù)清洗后，于烘箱中65℃烘干48h，測定其干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）和淀粉（Starch）含量。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 產(chǎn)氣量（Gas Production，GP）的測定 分別在2、4、8、12、24、48 h 準(zhǔn)確記錄玻璃針管的刻度值，根據(jù)公式計算各時間點的產(chǎn)氣量。

GPt=（Vt–V0）–（Vt–V0）

式中，GPt 為樣品在t 時刻玻璃針管的刻度值（mL）；Vt為樣品發(fā)酵t 小時后記錄玻璃針管的刻度值；V0為樣品在剛開始發(fā)酵時記錄玻璃針管的刻度值；Vt為空白組發(fā)酵t 小時后記錄玻璃針管的刻度值；V0為空白組在剛開始發(fā)酵時記錄玻璃針管的刻度值。

1.4.2 各項參數(shù)的測定及營養(yǎng)物質(zhì)降解率的計算 發(fā)酵液pH 采用梅特勒F2-Standard 便攜式pH 酸度計測定每組發(fā)酵液的pH，重復(fù)3 次，取平均值。利用高效液相色譜法（HPLC），取經(jīng)偏磷酸固氮處理冷凍保存的瘤胃液解凍后于12 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.45 μm 水相濾膜過濾后，取20 μL 上清液分裝于1.5 mL 的色譜進(jìn)樣瓶中上機(jī)進(jìn)行HPLC 分析，通過峰面積外標(biāo)法定量計算出有機(jī)酸的濃度。參照馮宗慈等比色法測定瘤胃液NH-N 的濃度。取10 mL 瘤胃液在3 500～4 000 r/min 離心10 min，量取2 mL 上清液，置于15 mL 試管內(nèi)，再加入8 mL 0.2 mol/L 鹽酸至10 mL搖勻，用分光光度計測定其消光值并代入回歸公式，計算結(jié)果乘以樣品的稀釋倍數(shù)就即為原樣中NH-N 濃度。將發(fā)酵結(jié)束的底物連同纖維袋用清水清洗后，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）65℃烘干48 h 后，使用電子天平稱重為DM 含量；采用凱氏定氮法[FOSS 凱氏定氮儀（邦億精密量儀有限公司）]測定底物殘渣的CP 含量；采用淀粉試劑盒（索萊寶生物科技有限公司）測定底物殘渣的Starch 含量。干物質(zhì)降解率（DMD）、粗蛋白質(zhì)降解率（CPD）、淀粉降解率（SD）計算公式：

DM（CP、SD）降解率=[發(fā)酵底物中DM（CP、SD）量（g）–底物殘渣DM（CP、SD）量（g）]/發(fā)酵底物DM（CP、SD）量（g）×100%

1.4.3 組合效應(yīng)值 參考王旭等的組合效應(yīng)計算公式，計算每個組合底物發(fā)酵48 h 后測定各參數(shù)的單項組合效應(yīng)值（SFAEI）和綜合組合效應(yīng)值（MFAEI）：

單項組合效應(yīng)值=（組合實測值– 加權(quán)估算值）/加權(quán)估算值

綜合組合效應(yīng)值=各單項組合效應(yīng)值之和

其中，加權(quán)估算值=A 原料的實測值×A 原料的百分比+B 原料的實測值×B 原料的百分比。

1.5 統(tǒng)計分析 采用Excel 2016 整理試驗數(shù)據(jù)，通過SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較，<0.05 為差異顯著，>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)玉米與濕貯玉米不同比例組合對48 h 體外發(fā)酵GP 的影響 由表2 得出，除12 h 之外，各發(fā)酵時間點常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合對GP 的影響差異顯著（<0.05），各比例組合GP 值均隨發(fā)酵時間的增加而增加，但隨著發(fā)酵時長增加至12 h 后，濕貯玉米組合比例高于50:50 的組合GP 逐漸呈下降趨勢。50:50組合48 h 產(chǎn)氣量高于70:30、60:40、30:70 和0:100 組合（<0.05）。與對照組（100:0）相比，濕貯玉米組合比例低于60:40 或高于40:60 組合，隨著發(fā)酵時間延長至12 h 后，GP 均低于對照組。

表2 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對GP 的影響

2.2 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對VFA 的影響 由表3 可見，與對照組相比，各比例組合丁酸濃度無顯著差異；各組間丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度存在差異顯著（<0.05），且均低于對照組；70:30 比例組的乙酸濃度低于其他各組（<0.05）；乙酸/丙酸隨濕貯玉米組合比例的增加隨之增加（<0.05）。

表3 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對VFA 的影響

2.3 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對pH、NH-N 及營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響 由表4 可見，經(jīng)48 h 體外發(fā)酵之后，與對照組相比，各比例組合pH維 持在5.66～5.85（>0.05）；60:40、50:50、40:60、30:70、0:100 組合NH-N 濃度穩(wěn)定在0.16～0.17 mg/dL，高于對照組和70:30 組（<0.05）。DMD 和CPD 隨著濕貯玉米組合比例的增加而增加。對照組DMD 低于50:50、40:60、30:70 和0:100 組合（<0.05）；對照組的CPD 低于0:100 組合（<0.05），與其他比例組合相比均差異不顯著；對照組SD 低于其他各組（<0.05），且0:100 組合最高（45.24%）。

表4 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對pH、NH3-N 及營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

2.4 常規(guī)玉米與濕貯玉米不同配合比例的組合效應(yīng)值 通過SFAEI 來評定不同組合經(jīng)48 h 體外發(fā)酵的組合效應(yīng)。由表5 可見，GP 在70:30 組合表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)；TVFA 在50:50 和30:70 組合表現(xiàn)出正效應(yīng)；pH在70:30、60:40 和40:60 組合表現(xiàn)出正效應(yīng)；NH-N 在70:30 組合表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)；DMD 在70:30 和60:40 組合表現(xiàn)出負(fù)效應(yīng)；CPD 在70:30 和30:70 組合表現(xiàn)出正效應(yīng)；SD 在70:30、60:40 和50:50 組合表現(xiàn)出正效應(yīng)。各比例組合MFAEI 在60:40、50:50、40:60 和30:70 組合表現(xiàn)出正效應(yīng)，其中50:50 組合表現(xiàn)出最高值（0.597 6）。

表5 常規(guī)玉米與濕貯玉米不同配合比例的組合效應(yīng)值

3 討論

3.1 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對GP 的影響 發(fā)酵GP 反映了瘤胃液中的瘤胃微生物對飼料中碳水化合物及蛋白質(zhì)含碳部分的降解活性和飼料可降解率高低，產(chǎn)生的氣體越多，表明瘤胃微生物活性越高，可降解物質(zhì)含量越高。有研究表明，產(chǎn)氣量與干物質(zhì)降解率呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果表明，各比例組合GP 值均隨著發(fā)酵時間的延長隨之增加，可能是不同類型飼料組合后，蛋白質(zhì)與碳水化合物比例發(fā)生變化，影響飼料的發(fā)酵潛力；隨著濕貯玉米比例增高、發(fā)酵時間延長，GP 值的增長幅度呈下降趨勢，經(jīng)48 h 發(fā)酵后，0:100 組合GP 最低（118.60 mL/g），50:50 組合GP 最高（163.00 mL/g）。祁宏偉等研究表明，玉米經(jīng)過濕貯后其干物質(zhì)、有機(jī)化合物及能量在奶牛瘤胃、小腸和總腸中的降解率高于干貯玉米，過高的營養(yǎng)物質(zhì)降解率會影響瘤胃酸堿值，大量脂肪酸積累導(dǎo)致瘤胃酸度增加，進(jìn)一步抑制有益菌的生物活性，降低了微生物對飼料中可降解物的降解能力。濕貯玉米比例越高，pH 隨著發(fā)酵時間的增加而下降，瘤胃微生物活動可能受到限制，導(dǎo)致GP 隨之降低。在50:50 組合中，可能是適當(dāng)?shù)慕到饴誓芷胶饬鑫肝⑸锏纳姝h(huán)境，提供足夠的可利用物使其較為充分發(fā)揮生物活性，GP 表現(xiàn)出最大值。

3.2 常規(guī)玉米與濕貯玉米的不同比例組合48 h 體外發(fā)酵對pH、NH-N、VFA 及營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響 瘤胃pH 是能夠直接反映瘤胃內(nèi)環(huán)境發(fā)酵水平的一項重要指標(biāo)，可綜合反映瘤胃微生物和代謝產(chǎn)物有機(jī)酸的產(chǎn)生、吸收、排放及瘤胃健康狀況。瘤胃液pH 范圍在5.5～7.5，理想范圍在6.6～7.0，瘤胃pH 過低，會引起瘤胃代謝疾病等風(fēng)險。在本試驗中，由于玉米經(jīng)體外發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酸無法被吸收代謝，積累在瘤胃液中致使pH 降低，維持在5.66～5.85，但屬于正常參考范圍。

NH-N 是由飼料中含氮物質(zhì)分解產(chǎn)生的，適宜的NH-N 濃度有利于微生物生長和菌體蛋白合成，瘤胃液中NH-N 濃度可反映飼料蛋白質(zhì)降解速度和菌體蛋白的合成情況，是瘤胃代謝中的重要指標(biāo)。在本試驗結(jié)果中，各組合NH-N 濃度在0.09～0.17 mg/dL。但Sharif 等研究指出，瘤胃液NH-N 濃度在6.3～27.5 mg/dL 較為適宜。本試驗中瘤胃液中的NH-N 濃度主要來源于降解常規(guī)玉米與濕貯玉米中的蛋白質(zhì)，且相比濕貯玉米，常規(guī)玉米CPD 較低，可能與可供瘤胃微生物利用降解的蛋白質(zhì)含量不足有關(guān)，生物活性有所下降，且常規(guī)玉米營養(yǎng)物質(zhì)降解率低，產(chǎn)生NH-N 濃度略低，不利于微生物菌體蛋白的合成。但對照組和各組合間NH-N 濃度差異顯著，常規(guī)玉米與濕貯玉米組合的NH-N 濃度顯著提高；然而濕貯玉米的比例越大，pH 下降越快可能會抑制菌體活性，NH-N 濃度反而降低，說明濕貯玉米比例過高不益于微生物的生長。

VFA 主要是由乙酸、丙酸和丁酸組成，是反芻動物能量利用中一個重要中間產(chǎn)物，也是瘤胃微生物維持和生長的主要能量來源，瘤胃中VFA 濃度可反映瘤胃微生物對飼料中碳水化合物消化代謝活動情況，其濃度和瘤胃發(fā)酵類型等取決于飼料的種類及組成。本試驗結(jié)果表明，在濕貯玉米各比例組合中，50:50 組合乙酸、丁酸和TVFA 濃度均表現(xiàn)出最高值，其他組合可能由于瘤胃微生物活性受限制或原料營養(yǎng)物質(zhì)可降解率低，產(chǎn)生有機(jī)酸濃度略低。本研究中，與對照組相比，各組合之間隨著濕貯玉米組合比例增加，乙酸/丙酸也隨之增加，乙酸/丙酸為1.62～2.02。不同生理階段泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸中乙酸/丙酸的正常參考范圍（1.36～5.25），本研究結(jié)果與其相符。經(jīng)過一定時間的貯存發(fā)酵后，濕貯玉米含高瘤胃降解率的淀粉易產(chǎn)生VFA，大量積累會降低瘤胃液中pH，有益菌在pH 較低的環(huán)境中活性可能會受到抑制。而本試驗供體瘤胃液為乙酸發(fā)酵型，乙酸分解菌的活性較強(qiáng)，在此情況下仍然能夠降解玉米中的部分纖維成分提供一定量的乙酸，經(jīng)發(fā)酵后致使乙酸濃度略高于丙酸。蔣林樹等研究也顯示，高油玉米在體外瘤胃發(fā)酵得到的乙酸濃度高于丙酸。在本試驗結(jié)果也表明，與對照組相比，各組合乙酸濃度均無顯著變化，而丙酸濃度隨著濕貯玉米比例的增加呈下降趨勢。

濕貯玉米經(jīng)過一段時間的貯存發(fā)酵后，營養(yǎng)成分的消化率都有所提高，但飼喂大量高降解率物質(zhì)也會給反芻動物瘤胃健康造成一定危害。本試驗結(jié)果中，隨著濕貯玉米比例增大，飼料DMD 和CPD 均隨之增高，SD各組合間無顯著差異，但均高于對照組，高瘤胃降解物質(zhì)可能會對奶牛瘤胃環(huán)境產(chǎn)生影響。因此，在飼喂管理中應(yīng)合理調(diào)整好常規(guī)玉米與濕貯玉米的配比，在提高玉米利用率的同時也要防止奶牛瘤胃酸中毒等情況發(fā)生。

3.3 常規(guī)玉米與濕貯玉米的組合效應(yīng)值分析 通過多項試驗指標(biāo)對比分析，結(jié)合MFAEI 可對結(jié)果進(jìn)行更為客觀準(zhǔn)確的評定。本試驗結(jié)果表明，各比例組合的SFAEI 均有所不同，結(jié)合48 h 的GP 值、TVFA、pH、NH-N、DMD、CPD 和SD 計算得出的MFAEI 在70:30 組合為負(fù)值，60:40、50:50、40:60、30:70 組合均為正值，其中50:50 組合MFAEI 表現(xiàn)最佳。說明適宜比例組合的常規(guī)玉米與濕貯玉米能夠提高奶牛瘤胃的整體發(fā)酵性能，改善飼料利用率，有助于提高奶牛生產(chǎn)潛能，但濕貯玉米比例過高也會給奶牛瘤胃的發(fā)酵潛力帶來一定負(fù)面影響，增加濕貯玉米的飼喂風(fēng)險。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，將常規(guī)玉米與濕貯玉米以不同比例組合進(jìn)行奶牛體外發(fā)酵試驗，通過對各項發(fā)酵參數(shù)測定結(jié)果及組合效應(yīng)的計算值進(jìn)行對比分析，2 種原料組合比例為50:50 時效果較好。