瘤胃尼龍袋法中0 時(shí)間點(diǎn)的利用方式對(duì)飼料瘤胃降解特性的影響

劉俊杰，和暢翔，段月巖，楊 璐，何浩然，李 森，張 微

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

瘤胃尼龍袋法是一種評(píng)價(jià)飼料在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)降解速度和降解程度的試驗(yàn)方法。雖然瘤胃尼龍袋法應(yīng)用廣泛，但其測(cè)定結(jié)果會(huì)受試驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理、尼龍袋的規(guī)格、操作程序等諸多因素影響產(chǎn)生差異。因此，有必要對(duì)瘤胃尼龍袋法的操作規(guī)程及后續(xù)數(shù)據(jù)處理加以標(biāo)準(zhǔn)化。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也先后研究總結(jié)了一些瘤胃尼龍袋法的標(biāo)準(zhǔn)程序或建議方案。Vanzant 等對(duì)影響瘤胃尼龍袋法評(píng)價(jià)飼料瘤胃降解特性結(jié)果的各方面因素進(jìn)行了分析，并給出了標(biāo)準(zhǔn)化建議參數(shù)；張微等結(jié)合前人的建議、實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行程序以及有關(guān)試驗(yàn)研究結(jié)果，給出了瘤胃尼龍袋法評(píng)定羊飼料瘤胃蛋白質(zhì)降解率的建議方案，并指出在我國(guó)數(shù)學(xué)計(jì)算因素導(dǎo)致的差異應(yīng)該引起足夠重視。目前，國(guó)內(nèi)在使用瘤胃尼龍袋法測(cè)定瘤胃降解率時(shí)0 時(shí)間點(diǎn)的使用不一致。對(duì)同一批試驗(yàn)數(shù)據(jù)的0 時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行不同方式處理，擬合得到的瘤胃降解參數(shù)和瘤胃有效降解率可能存在較大差異，這可能也是造成不同研究間相同樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)可比性差的重要原因。因此，為了研究0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)瘤胃尼龍袋法評(píng)價(jià)飼料瘤胃降解特性結(jié)果的影響，本試驗(yàn)首先用瘤胃尼龍袋法測(cè)定玉米、豆粕、小麥秸、黑麥干草4 種羊常用飼料的瘤胃干物質(zhì)（DM）和粗蛋白質(zhì)（CP）降解率，然后對(duì)0 時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)依次進(jìn)行3種使用方式的參數(shù)擬合，最后綜合比較飼料瘤胃降解參數(shù)的差異，以期為羊的瘤胃尼龍袋法相關(guān)規(guī)程或標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用8 只3 周歲、體重為64.9～72.1 kg、正常驅(qū)蟲和免疫、健康狀況良好并裝有永久性瘤胃瘺管的云南半細(xì)毛羊羯羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。

1.2 飼料配制與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)所用飼糧按1.3 倍NRC（2007）維持營(yíng)養(yǎng)需要配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。飼糧精粗比為3:7，日糧組成為精補(bǔ)料0.48 kg、豆糠0.72 kg、青貯1.14 kg（含水量65%），每天07:00 和17:00 分2 次等量飼喂，先喂青貯，后飼喂混合均勻的精料和豆糠（按1:1 加水?dāng)嚢瑁?。試?yàn)期間，羊只單欄飼養(yǎng)，保證自由飲水，并定期打掃圈舍和護(hù)理瘤胃瘺管。試驗(yàn)前空腹稱重，正式投放尼龍袋前預(yù)試10 d，每期試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)羊休息2 d。試驗(yàn)于昆明易興恒畜牧科技有限公司羊場(chǎng)進(jìn)行。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（DM 基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分別測(cè)定玉米、豆粕2 種精料（0、2、4、8、16、24、36、48 h）和小麥秸、黑麥干草2 種粗料（0、4、8、16、24、36、48、72 h）各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃降解率，但0 h 的尼龍袋不投入瘤胃中，洗滌程序同其他時(shí)間點(diǎn)。

待測(cè)樣品粉碎并通過(guò)8 目篩，試驗(yàn)前65℃烘8 h，回潮24 h，稱取精料4.0 g 或者粗料2.5 g 左右放入已知重量的尼龍袋中。對(duì)每一種飼料樣品，每只羊每個(gè)待測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置2 個(gè)平行袋子，4 只羊?yàn)? 個(gè)重復(fù)。尼龍袋系在內(nèi)徑為3 mm、長(zhǎng)25 cm 的半軟塑料管底部，用橡皮筋固定，確保樣品不丟失、尼龍袋不脫落。試驗(yàn)采用“同時(shí)投入，依次取出”原則，于晨飼前投入瘤胃腹囊，精料分別于2、4、8、16、24、36、48 h 從瘤胃瘺管中取出，粗料分別于4、8、16、24、36、48、72 h 從瘤胃瘺管中取出，并立即用洗衣機(jī)（長(zhǎng)虹XPB30-875S，3 kg）在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下最高水位沖洗3 次，每次5 min。將洗凈的尼龍袋放入65℃的烘箱中烘48 h 至恒重，稱取尼龍袋及殘?jiān)闹亓浚⒛猃埓辛鑫肝唇到獾臍堅(jiān)占谧苑獯?，用于后續(xù)測(cè)定DM 和CP 含量。待測(cè)樣品的DM 和CP 含量見表2。

表2 待測(cè)樣品的DM 和CP 含量（DM 基礎(chǔ)） %

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 DM 和CP 含量按照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》（第3 版）方法測(cè)定。其中DM 使用恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）測(cè)定，CP 含量使用FOSS 半自動(dòng)凱式定氮儀（北京譜飛科技有限公司）測(cè)定。

1.5 計(jì)算方法 瘤胃降解參數(shù)擬合和瘤胃有效降解率計(jì)算參照?rskov 等提出的瘤胃動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型和計(jì)算公式計(jì)算。

1.5.1 瘤胃降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì) 飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率符合指數(shù)曲線：

dp=a+b（1–e）

式中，dp 為t 時(shí)刻某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率（%）；a 為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速降解部分（%）；b 為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的慢速降解部分（%）；c 為該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)慢速降解部分的降解速率（%/h）；t 為在瘤胃內(nèi)停留的時(shí)間（h）。利用各時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)瘤胃降解率和時(shí)間，計(jì)算a、b 和c 值。

1.5.2 飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃有效降解率 計(jì)算公式：

ED=a+b×c/（c+k）

式中，ED 為某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的有效降解率（%）。本試驗(yàn)中干草類飼料的瘤胃外流速率k 值取3.14%/h，精料取5%/h。

1.5.3 0 時(shí)間點(diǎn)逃逸率 計(jì)算公式：

樣品逃逸率=[空白試驗(yàn)裝袋樣品干物質(zhì)重（g）–空白試驗(yàn)袋中殘余物重（g）]/空白試驗(yàn)裝袋樣品干物質(zhì)重（g）×100%

1.5.4 0 h 時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)在瘤胃降解參數(shù)擬合中的3 種不同使用方式 方式1 不使用0 時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行瘤胃降解參數(shù)擬合。方式2 將0 時(shí)間點(diǎn)作為1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別與精料（2、4、8、16、24、48 h）和粗料（4、8、16、24、48、72 h）各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)一起進(jìn)行瘤胃降解參數(shù)擬合。方式3 將0 時(shí)間點(diǎn)作為空白對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)降解率進(jìn)行校正，該方法將0 時(shí)間點(diǎn)的降解率定義為樣品逃逸率，然后再進(jìn)行瘤胃降解參數(shù)擬合。具體校正方法：

校正裝袋樣品量=實(shí)際裝袋樣品量（g）×[1–樣品逃逸率（%）]

某目標(biāo)成分某時(shí)間點(diǎn)的降解量=[校正裝袋樣品量（g）×空白試驗(yàn)殘余物中某目標(biāo)成分的含量（%）]–[某時(shí)間點(diǎn)殘余物的重量（g）×某時(shí)間點(diǎn)殘余物中某成分的含量（%）]

某目標(biāo)成分某時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)降解率={某目標(biāo)成分某時(shí)間點(diǎn)的降解量（g）/[校正袋裝樣品量（g）×空白試驗(yàn)殘余物中某目標(biāo)成分的含量（%）]}×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用Excel 2010 初步整理后，用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件中NLIN 程序計(jì)算a、b、c 值，降解率和降解參數(shù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行多重比較及單因素方差分析，數(shù)據(jù)均采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)玉米DM 和CP 瘤胃降解特性的影響 如表3 所示，采用方式1 和方式2 統(tǒng)計(jì)得到的玉米DM 和CP 降解參數(shù)a 值、a+b 值以及ED 高于方式3（<0.05），b 值低于方式3（<0.05），而用方式1 與方式2 差異均不顯著。此外，3 種數(shù)據(jù)處理方式對(duì)玉米DM 和CP 的c 值以及玉米CP 的a+b 值均無(wú)顯著影響。

表3 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)玉米DM 和CP 瘤胃降解特性的影響

2.2 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)豆粕DM 和CP 瘤胃降解特性的影響 如表4 所示，除豆粕DM 的c 值和a+b 值在3 種方式間無(wú)差異外，采用方式1 和方式2 統(tǒng)計(jì)得到的DM 的降解參數(shù)a 值、ED 高于方式3（<0.05），b值低于方式3（<0.05），而采用方式1 與方式2 統(tǒng)計(jì)得到的DM 降解參數(shù)和ED 差異均不顯著。3 種方式統(tǒng)計(jì)得到的豆粕CP 降解參數(shù)和ED 均無(wú)顯著差異，但方式3 的ED 低于方式1 和2（>0.05）。

表4 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)豆粕DM 和CP 瘤胃降解特性的影響

2.3 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)小麥秸DM 和CP 瘤胃降解特性的影響 如表5 所示，就小麥秸而言，除DM 的c 值、a+b 值在3 種方式間無(wú)差異外，采用方式1 和方式2 統(tǒng)計(jì)得到的DM 的降解參數(shù)a 值和ED 高于方式3（<0.05），b 值低于方式3（<0.05），但方式1 與方式2 所得參數(shù)之間無(wú)差異。3 種數(shù)據(jù)處理方式除對(duì)CP 的b 值無(wú)影響外，在降解參數(shù)a 值、c 值和a+b 值差異顯著（<0.05），方式1 和方式2 的ED 無(wú)差異（>0.05），但高于方式3（<0.05）。

表5 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)小麥秸DM 和CP 瘤胃降解特性的影響

2.4 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)黑麥干草DM 和CP 瘤胃降解特性的影響 如表6 所示，對(duì)于黑麥干草來(lái)說(shuō)，除CP 的c 值外，3 種方式所得DM 和CP 的瘤胃降解參數(shù)和ED 均存在顯著差異（<0.05），其中方式3 中DM和CP 的a 值、a+b 值和ED 低于方式1 和2（<0.05），而b 值高于其他2 種方式（<0.05），方式2 中DM 的a 值和a+b 值高于方式1（<0.05），而DM 的c 值和CP 的a 值低于方式1（<0.05）。

表6 0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)黑麥干草DM 和CP 瘤胃降解特性的影響

2.5 4 種待測(cè)飼料原料0 時(shí)間點(diǎn)DM 和CP 的降解率（逃逸率）與快速降解部分a 值分析 如表7 所示，小麥秸和黑麥干草的0 時(shí)間點(diǎn)DM 逃逸率大于方式1 和3 計(jì)算得到的a 值（<0.05），方式2 計(jì)算得到黑麥干草DM的a 值高于方式1（<0.05）；方式1 計(jì)算得到的小麥秸和黑麥干草中CP 的a 值大于其0 h 逃逸率和方式2、3 得到的a 值（<0.05），0 h 逃逸率和方式2 得到的a值差異不顯著，玉米0 h 時(shí)間點(diǎn)DM 和CP 逃逸率和豆粕0 時(shí)間點(diǎn)DM 逃逸率與方式1、2 中a 值均無(wú)顯著差異（>0.05），與方式3 差異顯著（<0.05）；豆粕0 時(shí)間點(diǎn)CP 的逃逸率與方式2、3 中a 值無(wú)顯著差異。

表7 4 種待測(cè)飼料原料0 時(shí)間點(diǎn)DM 和CP 的降解率（逃逸率）與快速降解部分a 值分析

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)在使用瘤胃尼龍袋法測(cè)定瘤胃降解率時(shí)對(duì)0 時(shí)間點(diǎn)的使用不一致。一部分研究在測(cè)定飼料瘤胃降解特性時(shí)沒(méi)有設(shè)計(jì)0 時(shí)間點(diǎn)；一部分研究設(shè)置了0 時(shí)間點(diǎn)，與其他時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)一起用于降解參數(shù)擬合，而還有研究是將0 時(shí)間點(diǎn)作為空白對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)降解率進(jìn)行校正。顯然，對(duì)同一批試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行0 h時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)不同方式的處理，擬合得到的瘤胃降解參數(shù)和瘤胃ED 可能存在較大差異，這可能也是造成不同研究間相同樣品試驗(yàn)數(shù)據(jù)可比性差的重要原因。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同0 時(shí)間點(diǎn)的使用方式對(duì)4 種飼料的瘤胃降解參數(shù)a、b、c、a+b、ED 的影響不同。就飼料瘤胃ED 而言，方式1 和方式2 的ED 均高于方式3，且方式1 和方式2 之間差異不顯著。這說(shuō)明不用0 時(shí)間點(diǎn)或者將0 時(shí)間點(diǎn)作為一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算所得的飼料ED 無(wú)顯著差異，而經(jīng)過(guò)0 h 逃逸率校正后的飼料ED 顯著降低。

Mehrez 等所介紹的尼龍袋法中沒(méi)有用0 時(shí)間點(diǎn)的逃逸率進(jìn)行瘤胃降解率校正；馮仰廉等指出a 值是降解曲線在0 h 時(shí)間的截距，并用作圖法簡(jiǎn)便計(jì)算出的a、b、c 值與用最小二乘法得出的值相近；張微等根據(jù)原位尼龍袋技術(shù)的基礎(chǔ)理論，指出0 時(shí)間點(diǎn)的降解率（逃逸率）是用動(dòng)態(tài)降解方程外推計(jì)算出來(lái)的，即a值，實(shí)測(cè)0 時(shí)間點(diǎn)降解率的作用只是與計(jì)算值進(jìn)行比較。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，玉米、豆粕的DM 和CP 及小麥秸的DM 和黑麥干草CP 的 0 時(shí)間點(diǎn)逃逸率與a 值無(wú)差異，并且與方式2 的a 值更接近。至于小麥秸CP、黑麥干草DM 在0 時(shí)間點(diǎn)的逃逸率與a 值差異顯著，可能是與飼料的溶解性、黏性等性質(zhì)有關(guān)。Yang 等研究表明，盡管飼料可溶部分的降解速率高于不可溶部分，但是它們的差異沒(méi)有想象中那么大。也可能是因?yàn)榱鑫改猃埓ㄗ畛跏怯脕?lái)測(cè)定精飼料蛋白質(zhì)在瘤胃中降解率，并不一定適用于所有飼料。Mcdonald認(rèn)為，dp=a+b（1–e）可能不適用于描述某些飼料的實(shí)時(shí)瘤胃降解率，某些蛋白飼料（如亞麻籽粕）的慢速降解部分可能存在一定的降解延滯期，需要對(duì)模型進(jìn)行一定調(diào)整。

4 結(jié)論

基于本試驗(yàn)的結(jié)果，建議在使用瘤胃尼龍袋法測(cè)定飼料中DM 和CP 的瘤胃降解特性時(shí)，不使用0 時(shí)間點(diǎn)，可以將0 時(shí)間點(diǎn)的降解率與其計(jì)算的a 值進(jìn)行比較，評(píng)估試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。