東弗里升細(xì)管凍精與洼地綿羊雜交改良研究

吳 昊，任艷玲，馬文奎，朱寬峰，王建軍，沈志強(qiáng)，徐 尚，周 強(qiáng)，富 強(qiáng)，富俊才，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；3.北京田園奧瑞生物科技有限公司，北京 100096；4.內(nèi)蒙古金草原生態(tài)科技集團(tuán)有限公司，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015115；5.察右前旗強(qiáng)禾生態(tài)種業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012200）

東弗里升是世界著名的奶綿羊品種，原產(chǎn)德國，具有極佳的生產(chǎn)性能，體型結(jié)構(gòu)良好，體軀寬長，優(yōu)秀個(gè)體泌乳量達(dá)1 200 kg 以上。我國現(xiàn)有綿羊品種基本以肉用和毛用品種為主，奶用綿羊存欄甚少。因此，培育乳肉兼用品種具有巨大的市場發(fā)展?jié)摿?。洼地綿羊是《山東省地方畜禽品種保護(hù)名錄》地方保護(hù)品種，羊肉鮮美，多胎，耐粗飼，哺乳能力強(qiáng)。陳其新等將東弗里升、杜泊羊與小尾寒羊進(jìn)行經(jīng)濟(jì)雜交對比試驗(yàn)，東寒F代的平均初生重和成活率優(yōu)于杜寒雜交后代。因此，將東弗里升與洼地綿羊進(jìn)行雜交，可以將東弗里升產(chǎn)奶性能和寬大體型結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)性能與洼地綿羊的多胎性狀和肉質(zhì)鮮美的生產(chǎn)性能相結(jié)合，繼而培育出具有多種優(yōu)秀性狀的新品種，滿足市場需求。精液冷凍和腹腔內(nèi)窺鏡輸精是進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)和提高優(yōu)秀種公羊利用效率的重要途徑。王一明等利用細(xì)管凍精腹腔內(nèi)窺鏡輸精技術(shù)進(jìn)行哈薩克羊的品種改良，效果良好。本研究制備東弗里升細(xì)管凍精，利用腹腔內(nèi)窺鏡技術(shù)對洼地綿羊進(jìn)行輸精，以期獲得具有多種優(yōu)秀性狀的新品種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2 只東弗里升種公羊選自內(nèi)蒙古察右前旗強(qiáng)禾生態(tài)種業(yè)有限公司種羊場，年齡為2～3 歲，膘情上等，體質(zhì)健壯；28 只洼地綿羊選自山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院羊場，所有母羊健康無病，膘情良好。所有羊按常規(guī)方式進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.2 藥品與試劑 孕馬血清促性腺激素（PMSG）購自寧波三生藥業(yè)有限公司；陰道栓（EAZI-BREED-CIDR）購自北京綠欣康農(nóng)牧科技有限公司；精液冷凍稀釋液及0.25 mL 細(xì)管購自上?？ㄌK生物科技有限公司；新鮮雞蛋、酒精、碘酒、新潔爾滅、土霉素等為國產(chǎn)。

1.3 主要儀器 實(shí)驗(yàn)儀器主要包括精液質(zhì)量分析系統(tǒng)[CASAS-QH-III 型（TSINGHUATONGFANG）]、電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋（JOANLAB，SYG）、冰箱（BCD-215DM，海爾）、光學(xué)顯微鏡（LV100ND，NiKon）、腹腔內(nèi)窺鏡系統(tǒng)（K3EC-2358，德國KARL）、程序冷凍儀與全自動細(xì)管灌裝封口機(jī)為北京田園奧瑞生物科技有限公司自主研發(fā)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 東弗里升凍精制備 使用假陰道法采集公羊精液，立即于37℃下進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢查。選擇活力在0.8 以上的精液，用精液冷凍稀釋液等比例稀釋至7 倍，每支0.25 mL凍精總精子數(shù)5.0×10個(gè)，即精子密度2.0×10個(gè)/mL。然后將稀釋好的精液放入4℃低溫操作柜中降溫平衡3～4 h 后灌裝封口。使用程序化冷凍儀進(jìn)行冷凍，冷凍曲線（4～-10℃，-5℃/min；-10～-100℃，-55℃/min；-100～-140℃，-20℃/min）。

1.4.2 精液品質(zhì)檢測 利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)[CASAS-QH-III 型（TSINGHUATONGFANG，北京，中國]進(jìn)行運(yùn)動指標(biāo)分析，運(yùn)動指標(biāo)包括活力、曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、精子頭側(cè)擺幅度（ALH）、快速直線運(yùn)動精子比例。

1.4.3 洼地綿羊同期發(fā)情處理 使用CIDR+PMSG 法對洼地綿羊進(jìn)行同期發(fā)情處理。在發(fā)情周期內(nèi)隨機(jī)選取1 d植入CIDR 栓（含0.3 g 孕酮），將其定為第0 天，第12 天撤去CIDR，注射280 IU 孕馬血清促性腺激素（PMSG），12 h 后用公羊試情，記錄發(fā)情時(shí)間。

1.4.4 腹腔內(nèi)窺鏡輸精 將細(xì)管凍精取出，于37℃水浴1 min 解凍，立即取出備用。將經(jīng)過同期發(fā)情處理且確認(rèn)發(fā)情的洼地綿羊進(jìn)行保定。采用腹部微創(chuàng)手術(shù)法進(jìn)行微創(chuàng)開孔，腹腔內(nèi)窺鏡觀察，單側(cè)卵巢卵泡1 個(gè)及以上則進(jìn)行輸精或直接進(jìn)行輸精。每只同期發(fā)情母羊輸解凍后細(xì)管凍精2 支，凍后精子活力0.5 左右，每側(cè)子宮角各輸精1 支。然后用少量磺胺處理創(chuàng)口后縫合1 針，注射黃體酮和土霉素。

1.4.5 東洼F代生長發(fā)育測定 東洼F代羔羊出生哺乳1 月后，進(jìn)行常規(guī)舍飼圈養(yǎng)。使用卷尺分別于出生、6、12 月齡和18 月齡測定后代體重?cái)?shù)據(jù)，并詳細(xì)記錄育肥期后代體重變化情況，計(jì)算耗料增重比。耗料增重比=消耗飼料總量/增重總量。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析 精液冷凍前后相關(guān)指標(biāo)檢測重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。>0.05 表示無顯著差異，<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 東弗里升綿羊鮮精理化特性分析 由表1 可知，2只東弗里升EF1（249）、EF2（239）精液的采精量、密度和顏色均無顯著差異。

表1 東弗里升鮮精質(zhì)量檢測

2.2 東弗里升綿羊冷凍前后活力及運(yùn)動能力分析 由表2 可知，EF1 個(gè)體的VCL、VAP、ALH 和快速運(yùn)動精子比例均低于鮮精組（<0.05）。EF2 個(gè)體的 VCL、ALH 和快速直線運(yùn)動精子比例均低于鮮精組（<0.05）。

表2 東弗里升綿羊精液運(yùn)動能力分析

2.3 東弗里升凍精與洼地綿羊腹腔內(nèi)窺鏡輸精 利用腹腔內(nèi)窺鏡技術(shù)對28 只洼地綿羊母羊進(jìn)行內(nèi)窺鏡輸精，結(jié)果顯示妊娠率為71.43%（20/28），產(chǎn)羔率為128.57%（36/28）。

表3 東弗里升凍精與洼地綿羊輸精雜交統(tǒng)計(jì)

2.4 腹腔內(nèi)窺鏡輸精產(chǎn)羔情況統(tǒng)計(jì) 如表4 所示，5 只母羊單產(chǎn)1 羔，8 只母羊單產(chǎn)2 羔，5 只母羊單產(chǎn)3 羔，2 只流產(chǎn)，窩產(chǎn)2～3 羔比例為72.22%（13/18）。隨窩產(chǎn)羔數(shù)增加，羔羊平均出生重降低。

表4 洼地綿羊單胎產(chǎn)數(shù)分布統(tǒng)計(jì)

2.5 東洼雜交F代生長發(fā)育及育肥效果分析 如表5 所示，東洼雜交F代同時(shí)期體重均高于洼地綿羊，18 月齡東洼雜交F代母羊高于洼地綿羊母羊（<0.05）。由表6 可知，東洼F代育肥期平均日增重、耗料增重比均高于洼地綿羊（>0.05）。

表5 東洼雜交羊與洼地綿羊不同月齡的體重

表6 東洼雜交羊與洼地綿羊育肥效果比較

3 討論

3.1 腹腔內(nèi)窺鏡輸精 綿羊同期發(fā)情處理常用陰道栓法，包括CIDR 栓和海綿栓等。陰道栓法具有使用安全、發(fā)情率高、無不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)中，為保證同期發(fā)情效果，使用CIDR 栓法進(jìn)行埋植，同時(shí)準(zhǔn)確保證了放栓、撤栓、輸精時(shí)間，因此保證了較高的發(fā)情率。綿羊凍精輸精的妊娠率目前無法超過50%，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔內(nèi)窺鏡輸精方式進(jìn)行輸精。腹腔內(nèi)窺鏡輸精技術(shù)減少了精子的運(yùn)動距離，能夠提高冷凍精液受胎率。張效生等對腹腔內(nèi)窺鏡輸精效果的影響因素進(jìn)行研究，篩選出最佳輸精時(shí)間為撤栓后48 h、最佳輸精部位為子宮角前、中段，最低有效輸精劑量為2×10個(gè)。在本研究中，腹腔內(nèi)窺鏡輸精借鑒了以上技術(shù)要點(diǎn)，輸精時(shí)間采取撤栓后48 h，輸精部分為子宮角前段。為保證妊娠效果，輸精劑量達(dá)到3×10個(gè)。石國慶等用腹腔內(nèi)窺鏡對活力僅0.2 的冷凍精液進(jìn)行子宮角深部輸精，情期受胎率達(dá)72.73%。張朝玉等對135 只薩?？搜蜷_展內(nèi)窺鏡輸精配種試驗(yàn)，一次輸精受胎率達(dá)到84%。本研究中洼地綿羊的妊娠率為71.43%，平均胎產(chǎn)羔1.8 只，取得較為理想的效果。

3.2 東洼雜交F代生長性能分析 家畜雜交改良可以把同一畜種內(nèi)不同品種之間優(yōu)勢生產(chǎn)性狀整合到一起，培育出具有多種優(yōu)秀生產(chǎn)性能的個(gè)體。張永東等將澳大利亞白羊、杜泊羊和小尾寒羊進(jìn)行雜交，后代繁殖性能好，生長率高。王志武應(yīng)用薩福克羊改良山西本地羊，雜交1 代的胴體重平均提高7.73 kg，羊單只利潤增加196.40 元，改良效果顯著。本研究將東弗里升綿羊與洼地綿羊進(jìn)行雜交，預(yù)期將東弗里升的產(chǎn)奶性能和洼地綿羊的多胎性能相結(jié)合，培育出乳肉兼用新品種，測定發(fā)現(xiàn)東洼雜交F代的同時(shí)期體重均高于洼地綿羊，其中18 月齡F代母羊顯著高于洼地綿羊母羊；育肥處理后，東洼F代育肥期的平均日增重、耗料增重比均高于洼地綿羊，但差異不顯著。李義海等將東弗里升與湖羊雜交，發(fā)現(xiàn)F代的體長、體高、胸圍測定結(jié)果顯著優(yōu)于湖羊。因此，東弗里升可以作為優(yōu)質(zhì)改良品種，提高綿羊的生長性能。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)管凍精腹腔內(nèi)窺鏡技術(shù)進(jìn)行東弗里升與洼地綿羊雜交，產(chǎn)羔率為128.57%（36/28），F(xiàn)代育肥期的平均日增重、耗料增重比與洼地綿羊相比有所提高。