遼育白牛無(wú)角性狀的分子鑒定

尚嵩洋，王昱彤，楊術(shù)環(huán)，劉 全，張麗君，李 寧，杜學(xué)海，王大鵬，金雙勇，王 喆，張樹義*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110033）

遼育白牛是以夏洛萊牛為父本、遼寧本地黃牛為母本，經(jīng)40 余年的培育形成的特色肉牛品種，其全身被毛白色或草白色，具有體型大、增重快、肉質(zhì)好的特點(diǎn)。2010 年，遼育白牛獲得國(guó)家肉牛新品種認(rèn)定，是我國(guó)第3 個(gè)專門化肉牛品種。在品種育成初期，多數(shù)遼育白牛為有角牛，少數(shù)為無(wú)角牛（圖1）。在隨后的擴(kuò)繁和推廣過(guò)程中無(wú)角遼育白牛逐漸受到青睞，但其無(wú)角性狀的形成機(jī)制尚不清楚。

圖1 無(wú)角和有角遼育白牛

以往研究牛無(wú)角性狀是由1 號(hào)染色體發(fā)生的顯性突變所致。Medugorac 等對(duì)夏洛萊牛、安格斯牛等多個(gè)品種無(wú)角牛進(jìn)行了高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們的1 號(hào)染色體都存在1 個(gè)或2 個(gè)拷貝212 bp 的插入片段（P），該片段替換掉了原位置的10 bp 序列導(dǎo)致了無(wú)角性狀的出現(xiàn)。荷斯坦牛的無(wú)角性狀則是由1 號(hào)染色體上的5 個(gè)突變位點(diǎn)（P、P、P、P和P）連鎖控制，該連鎖突變?yōu)楹伤固古Ｌ赜?。Medugorac 等發(fā)現(xiàn)土雷諾蒙古利亞牛的無(wú)角性狀是由1 號(hào)染色體的一段219 bp 的重復(fù)插入序列造成的（P）。對(duì)無(wú)角云嶺牛和夏南牛的研究顯示它們的無(wú)角性狀都是由于P位點(diǎn)的突變所致。為探究遼育白牛無(wú)角性狀的成因，研究對(duì)遼育白牛的P和P位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，以期為遼育白牛無(wú)角新品系的選育工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共采集遼育白牛血液及精液樣品304份（沈陽(yáng)牧經(jīng)種牛繁育中心有限公司44 份、彰武長(zhǎng)青牧業(yè)96 份、黑山綠源肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)89 份、阜蒙福澤肉牛養(yǎng)殖有限公司43 份、喀左興泰肉牛養(yǎng)殖廠32 份），其中182 份為無(wú)角遼育白牛樣品，122 份為有角遼育白牛樣品；另采集無(wú)角夏洛來(lái)牛血液樣品4 份。精液樣品采用液氮保存，血液樣品-20℃保存。

1.2 試劑與儀器 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）；精子基因組DNA 提取試劑盒，購(gòu)自北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司（北京）；2×EasyTaq MasterMix 擴(kuò)增酶，購(gòu)自北京全式金生物。超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000）；PCR 擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，ProFlex PCR systems）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）；凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，ChampGel 5000plus）。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA 提取 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取樣本DNA，用1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)DNA 條帶是否清晰明亮，使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品OD 值和濃度。將合格樣品DNA 分裝保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng) 研究以遼育白牛和夏洛萊?；蚪MDNA 為模板，采用文獻(xiàn)的引物擴(kuò)增無(wú)角性狀位點(diǎn)P和P。P位點(diǎn)上游引物：5'-TCAAGAAG GCGGCACTATCT-3'，下游引物：5'-TGATAAACTGA CCCTCTGCCTATA-3'；P位點(diǎn)上游引物：5'-TGAAA CTTTTGGCAAGCATGA-3'，下游引物：5'-CTGTGTCT CCTCGTGAGTCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系15 μL，包括1 μL DNA 模板（20～100 ng/μL），7.5 μL 2×EasyTaq MasterMix擴(kuò)增酶，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），4.5 μL 滅菌去離子水。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，56℃（P）或59℃（P）退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72℃延伸10 min，4℃保存。實(shí)驗(yàn)使用擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳及測(cè)序 PCR 產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，使用1×50TAE 電泳緩沖液，電泳電壓100V，電泳40 min，在凝膠成像儀下拍照觀察電泳結(jié)果，判斷樣品分型。為驗(yàn)證瓊脂糖電泳的分型結(jié)果，本研究在有角遼育白牛P和P位點(diǎn)的PCR 產(chǎn)物中，每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)抽取30 份進(jìn)行測(cè)序；在無(wú)角遼育白牛P位點(diǎn)為雜合突變型的PCR 產(chǎn)物中隨機(jī)抽取30 份進(jìn)行測(cè)序；2 個(gè)位點(diǎn)其余分型樣品的PCR 產(chǎn)物則均進(jìn)行了測(cè)序。另外，采用文獻(xiàn)引物對(duì)8 頭P和P位點(diǎn)為純合無(wú)突變型的無(wú)角遼育白牛進(jìn)行了連鎖突變位點(diǎn)（P、P、P、P和P）的分子鑒定。P、P、P和P位點(diǎn)采用PCR 產(chǎn)物測(cè)序，P位點(diǎn)采用克隆測(cè)序。委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用MEGA v 6.0 軟件讀取測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

本研究應(yīng)用P和P位點(diǎn)對(duì)所采集的有角、無(wú)角遼育白牛和無(wú)角夏洛萊牛進(jìn)行分子鑒定。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷樣品分型，結(jié)果見(jiàn)表1。P和P位點(diǎn)不同分型電泳條帶如圖2 所示。在182 頭無(wú)角遼育白牛中，7 頭為P位點(diǎn)純合突變型，其頻率為3.85%；164 頭為P位點(diǎn)雜合突變型，其頻率為90.11%；3 頭為P位點(diǎn)雜合突變型，其頻率為1.65%；其余8 頭則未攜帶P和P位點(diǎn)突變，對(duì)這8 頭牛進(jìn)行了P、P、P、P和P位點(diǎn)的分子鑒定，結(jié)果顯示它們也未攜帶以上任意位點(diǎn)的突變。未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶P和P位點(diǎn)突變的無(wú)角遼育白牛。122 頭有角遼育白牛則均為P和P純合無(wú)突變型。4 頭無(wú)角夏洛萊牛則均為P位點(diǎn)雜合突變型。PCR 產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果與瓊脂糖電泳的分型結(jié)果一致。

圖2 遼育白牛P202ID 和P219ID 分型檢測(cè)結(jié)果

表1 遼育白牛P202ID 和P219ID 位點(diǎn)分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

我國(guó)畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型正處于關(guān)鍵時(shí)期，堅(jiān)持自主創(chuàng)新、培育適應(yīng)市場(chǎng)需求的地方品種、提高畜禽種業(yè)經(jīng)濟(jì)效益是我國(guó)現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展目標(biāo)。遼育白牛是歷經(jīng)40 余年自主培育的特色肉牛品種，其體型大、發(fā)育快、肉質(zhì)好，具有良好的市場(chǎng)基礎(chǔ)，高峰時(shí)期良種母牛數(shù)量曾達(dá)2 萬(wàn)頭以上。但是，目前遼育白牛的飼養(yǎng)規(guī)模受到西門塔爾牛的嚴(yán)重沖擊，良種母牛數(shù)量和養(yǎng)殖規(guī)模都在不斷下降，如何提高遼育白牛市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，擴(kuò)大飼養(yǎng)規(guī)模是遼育白牛繁育工作面臨的主要問(wèn)題。近年來(lái)，由于無(wú)角遼育白牛具有不易爭(zhēng)斗、節(jié)省飼養(yǎng)空間、飼養(yǎng)安全性好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到養(yǎng)殖戶歡迎。培育遼育白牛無(wú)角新品系有望提高其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力、擴(kuò)大飼養(yǎng)規(guī)模。

研究通過(guò)牛無(wú)角位點(diǎn)P和P對(duì)182 頭無(wú)角和122 頭有角遼育白牛進(jìn)行了分子鑒定，分型顯示在182 頭無(wú)角遼育白牛中，絕大多數(shù)（93.96%）都攜帶1個(gè)或2 個(gè)拷貝的P位點(diǎn)插入突變。另外檢測(cè)的4 頭無(wú)角夏洛萊牛同樣攜帶1 個(gè)拷貝的P位點(diǎn)插入突變，與Medugorac 等結(jié)果一致。結(jié)合遼育白牛的培育歷史，推測(cè)無(wú)角遼育白牛P位點(diǎn)的突變很可能源自夏洛萊牛。在3 頭無(wú)角遼育白牛中檢測(cè)到了P位點(diǎn)的插入突變。這一突變位點(diǎn)最早在土雷諾蒙古利亞牛中發(fā)現(xiàn)，在蜀宣花牛中也有檢測(cè)到，推測(cè)可能源自本地黃牛。研究表明，蒙古牛的無(wú)角性狀也是由P位點(diǎn)的突變所導(dǎo)致；另有8 頭無(wú)角遼育白牛則既未攜帶P和P位點(diǎn)突變，也未攜帶荷斯坦牛的無(wú)角連鎖突變。該結(jié)果可能存在其他未知基因或位點(diǎn)的突變導(dǎo)致這8 頭遼育白牛的無(wú)角性狀，其具體形成機(jī)制仍有待研究。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用P和P位點(diǎn)對(duì)182 頭無(wú)角遼育白牛進(jìn)行了分子鑒定，其中171 頭（93.96%）攜帶P位點(diǎn)插入突變，3 頭（1.65%）攜帶P位點(diǎn)插入突變，其余8 頭（4.4%）則既未攜帶P和P位點(diǎn)突變，也未攜帶荷斯坦牛的無(wú)角連鎖突變，其成因仍有待深入研究。本研究的鑒定結(jié)果可為遼育白牛無(wú)角新品系的育種工作提供技術(shù)支持。