不同血型狼山雞免疫性能和TLR4 信號(hào)通路基因表達(dá)的比較分析

劉向萍，朱 靜，王洪志，顧華兵，竇新紅

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚(yáng)州 225125）

我國(guó)地方雞遺傳資源素以高抗性著名，但由于品種眾多，且不同品種、品系之間存在遺傳結(jié)構(gòu)差異，使得地方雞種抗性評(píng)價(jià)十分困難?？剐栽u(píng)價(jià)指標(biāo)的通用性、可靠性和抗性的分子遺傳機(jī)制均存在瓶頸與困難。在地方雞種免疫性能評(píng)價(jià)指標(biāo)方面，先前研究主要從免疫器官、細(xì)胞和分子3 個(gè)層次圍繞特異性與非特異性免疫系統(tǒng)開(kāi)展，包括淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、CD4、CD8 標(biāo)記的T細(xì)胞數(shù)量以及CD4:CD8、IgG 和IgM、免疫器官指數(shù)（胸腺、脾臟、法氏囊等絕對(duì)重量與雞體重量比值）、血液指標(biāo)（每毫升血液里紅細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)，T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等總數(shù)）、細(xì)胞因子指標(biāo)（炎性因子、趨化因子、干擾素等）。不同品種的免疫性能可以根據(jù)單一的或其中幾個(gè)抗性指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在抗性分子遺傳機(jī)制方面，目前研究比較清晰的是針對(duì)細(xì)菌性疾病的Toll 樣受體4（TLR4）通路。TLR4 是識(shí)別細(xì)菌脂多糖（LPS）并被其激活的TLR 家族成員，LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。該通路包括2 種分支：TLR4-MyD88-NF-B1 與TLR4-TRIF-IRF3，分別產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子（IL1）和干擾素（IFN），從而啟動(dòng)炎癥和免疫反應(yīng)。

狼山雞是我國(guó)著名的肉蛋兼用型地方雞種，其體格健壯、抗逆性強(qiáng)、胴體肉品質(zhì)好，被列入《國(guó)家畜禽遺傳資源保護(hù)名錄（2021 年版）》。前期研究發(fā)現(xiàn)，狼山雞群體中存在不同血型，且初步研究發(fā)現(xiàn)不同血型個(gè)體之間的免疫性能也存在差異。鑒于血型與抗病力存在顯著關(guān)聯(lián)，本文圍繞不同血型狼山雞抗性比較，從血型鑒定、病原刺激與基因表達(dá)等方面探討狼山雞抗逆性強(qiáng)的表型特征與分子機(jī)制，并從TLR4 信號(hào)通路角度探討狼山雞不同血型的抗性遺傳機(jī)制差異，為我國(guó)地方雞種優(yōu)良特性的精確評(píng)價(jià)與開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與血型鑒定 200 只狼山雞半同胞家系群來(lái)自江蘇省如東狼山雞種雞場(chǎng)，要求無(wú)腸炎沙門菌種源抗體，分為對(duì)照組和腸炎沙門菌攻毒組（SE 組），其中對(duì)照組80 只，SE 組120 只，1 日齡嗉囊灌注0.5 mL含10CFU 的腸炎沙門菌的LB 肉湯培養(yǎng)基（來(lái)自江蘇省人獸共患病實(shí)驗(yàn)室），對(duì)照組嗉囊灌注0.5 mL 生理鹽水，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照國(guó)標(biāo)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 35892-2018）進(jìn)行，7 d 后采集雛雞脾臟組織、盲腸以及血液，按照周偉等方法從中篩選B21 和B13 血型狼山雞個(gè)體。血型鑒別引物見(jiàn)表1。

表1 狼山雞血型鑒別引物

1.2 DNA 和RNA 提取 采集7 日齡狼山雞心臟血液，常規(guī)酚-氯仿提取DNA；采集脾臟組織后迅速放入液氮，按照Ambion 公司RNAquous kit 說(shuō)明書(shū)提取RNA。

1.3 免疫指數(shù)檢測(cè)

1.3.1 盲腸載菌量 參照馬騰所述方法測(cè)定。盲腸內(nèi)容物刮出稱量后溶解于100 mL 生理鹽水中，隨后按照10 倍梯度稀釋5～6 次，將每個(gè)濃度的菌液進(jìn)行沙門志賀菌屬瓊脂（SS 瓊脂）涂布，37℃培養(yǎng)24 h，確定最佳的菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。同樣方法對(duì)處死雛雞進(jìn)行操作，隨后統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的菌落數(shù)和腸道內(nèi)容物重量，根據(jù)如下公式計(jì)算S.Enteritidis 的腸道載菌量。

1.3.2 IgY、IgM、IL1和IFN采用ELISA 法，按照美國(guó)RD 公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 H/L 值 采血時(shí)立即做血涂片，改良瑞氏染色法染色；鏡檢；按照Campo 等方法進(jìn)行異嗜性粒細(xì)胞（H）、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（L）分類計(jì)數(shù)。

1.3.4 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 采用MTT 法，每個(gè)樣本做3次重復(fù)測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，采用全自動(dòng)生化分析儀（卓越330 南京科華公司）檢測(cè)在570 nm 處的吸光值，結(jié)果用轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)比值表示。

1.3.5 TLR4 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平 根據(jù)GenBank相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物見(jiàn)表2。采用20 μL 體系，根據(jù)寶生物熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)（SYBRPremix Ex TaqII kit）進(jìn)行操作。儀器：羅氏LightCycler480II Real-time PCR 儀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表2 目的基因和內(nèi)參基因的熒光定量檢測(cè)引物

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 22.0 軟件Two-way ANOVA 程序?qū)γつc載菌量、免疫指標(biāo)和基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，不同基因表達(dá)量使用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析，并對(duì)相關(guān)系數(shù)的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼山雞血型鑒別 利用熒光標(biāo)記微衛(wèi)星分型技術(shù)，通過(guò)2 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)MHC-I、MHC-IV 篩選結(jié)果如下：B21（357/205,n=92）、B13（231/220,n=78）、其他血型（n=14）；表明狼山雞在MHC 基因座位上遺傳多樣性豐富。具體如下：對(duì)照組80 只（B21：42 只，B13：32 只；其他血型：6 只）；攻毒組：120 只（B21：50 只，B13：46 只，其他血型8 只，死淘16 只）。

2.2 不同血型雞盲腸沙門菌刺激后免疫性能比較 由表3 可知，作為主要的2 種血型B13 和B21 個(gè)體盲腸組織中，攻毒組中鑒定出了大量沙門菌，腸炎沙門菌載菌量均高于10CFU/g，處于攜菌或感染狀態(tài)。其中，B21血型個(gè)體的腸道載菌量顯著低于B13 個(gè)體；在對(duì)照組中，2 種血型個(gè)體盲腸組織中均未發(fā)現(xiàn)沙門菌。

表3 不同血型雞盲腸沙門菌載菌量

由表4 可見(jiàn)，在攻毒組B21 血型個(gè)體中，血清IgG、IgM 與細(xì)胞因子IFN含量顯著高于攻毒組B13血型個(gè)體和對(duì)照組個(gè)體，而炎性因子IL1含量顯著低于攻毒組B13 血型個(gè)體，但顯著高于對(duì)照組。這表明，感染腸炎沙門菌后機(jī)體免疫系統(tǒng)被有效激活，炎性因子與細(xì)胞因子均顯著上升。在對(duì)照組中，除IgM 外，B21血型個(gè)體的IgG、IFN、IL1與B13 血型個(gè)體均存在顯著差異，這可能與不同血型個(gè)體的遺傳差異有關(guān)。

表4 攻毒7 d 后不同血型雞免疫性能比較

在H/L 值和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率方面，在攻毒組B21血型個(gè)體中，H/L 比值顯著低于B13 血型個(gè)體，對(duì)照組則無(wú)顯著差異；攻毒組B21 血型個(gè)體中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（PHA 與腸炎沙門菌刺激后）顯著高于B13 血型個(gè)體，對(duì)照組中也有類似趨勢(shì)，表明B21 血型個(gè)體在抗應(yīng)激能力與免疫調(diào)節(jié)能力上均優(yōu)于B13 血型個(gè)體。

2.3 不同血型狼山雞個(gè)體TLR4 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平變化 由圖1 可見(jiàn)，在B21 血型中，TLR4-MyD88-NF-B1 信號(hào)通路中，除外，其余關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)水平顯著低于B13 血型個(gè)體，呈現(xiàn)出較弱的炎癥反應(yīng)，而TLR4-TRIF-IRF3 信號(hào)通路中，除外，其余關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)水平顯著高于B13 血型個(gè)體；表明B21 血型通過(guò)抑制促炎因子（IL1）表達(dá)與提高干擾素（IFN）表達(dá)協(xié)同方式呈現(xiàn)出更好的抵抗腸炎沙門菌感染的能力。

圖1 不同血型狼山雞個(gè)體TLR4 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平變化

2.4 TLR4 信號(hào)通路相關(guān)基因共表達(dá)系數(shù)分析 由表5 可見(jiàn)，2 種血型的狼山雞在腸炎沙門菌刺激后，TLR4-MyD88-NF-B1 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因：和，其mRNA 表達(dá)水平呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)，而TLR4-TRIF-IRF3 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因：，其mRNA 表達(dá)水平也表現(xiàn)為顯著正相關(guān)，進(jìn)一步表明我國(guó)地方雞種免疫反應(yīng)模式與國(guó)內(nèi)外其他雞種無(wú)明顯差異，僅僅表現(xiàn)在具體的抗性機(jī)制差異方面。

表5 TLR4 信號(hào)通路中基因間表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)和顯著水平

3 討論

3.1 血型與免疫性能的關(guān)聯(lián) 雞的血型類型復(fù)雜，有A-E、H-L、P、R、Hi、Th 等14 種，且大多血型與生產(chǎn)性狀、抗病性狀存在關(guān)聯(lián)，其中B 血型系統(tǒng)與產(chǎn)蛋率、受精率、孵化率、日增重、抗病力、組織適合性等密切關(guān)聯(lián)，可作為一些品種的分子標(biāo)記加以應(yīng)用。例如，美國(guó)海蘭蛋雞公司利用B 系統(tǒng)（選擇B21 且剔除B20）作為標(biāo)記篩選抗馬立克病的蛋雞新品系。主要組織相容性復(fù)合體（MHC）在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面起著重要作用，與多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，與馬立克氏?。∕D）抗性、SRBC 抗體滴度有關(guān)。Fulton 等利用位于MHC 座位的2 對(duì)微衛(wèi)星組合成功鑒別了雞B 系統(tǒng)中的41 種血型類型，建立了方便快捷的血型鑒定方法，為B 血型作為分子標(biāo)記進(jìn)一步應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)B21 血型個(gè)體中盲腸載菌量、炎性因子和免疫抗體以及相關(guān)基因表達(dá)水平與B13 血型個(gè)體存在顯著差異，進(jìn)一步表明B 血型確實(shí)與抗病力存在關(guān)聯(lián)，這與翟飛等、周偉等報(bào)道類似。綜合不同層次的抗性指標(biāo)分析，B21 血型狼山雞的抗性顯著高于B13 血型個(gè)體，可通過(guò)篩選B21 血型這一分子標(biāo)記培育狼山雞高抗病力新品系。

3.2 地方雞抗性指標(biāo)篩選 抗病力按其遺傳基礎(chǔ)分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指雞對(duì)某種特定疾病或病原體的抗性，而一般抗病力是非特異性的，由先天免疫和抗應(yīng)激（抗逆）能力構(gòu)成。針對(duì)我國(guó)地方雞的高抗病力描述更多的是指一般抗病力。由于一般抗病力遺傳復(fù)雜，加上外部影響因素眾多，造成地方雞抗性評(píng)價(jià)中難以找到合適的指標(biāo)。Collisson 等發(fā)現(xiàn)來(lái)自MHC 座位B2 單倍型雞的巨噬細(xì)胞比B19 雞更有效地激活T 淋巴細(xì)胞。Amarasinghe 等表明雞感染傳染性支氣管炎病毒（IBV）后，誘導(dǎo)產(chǎn)生了白細(xì)胞介素（IL）-1和巨噬細(xì)胞聚集為特征的先天免疫反應(yīng)。胡耀東、王杰等報(bào)道北京油雞中H/L 值存在差異，且與免疫性能關(guān)聯(lián)，并據(jù)此構(gòu)建了高低H/L 值的資源家系，用于地方雞種免疫性狀的基因定位研究。魏鳳仙發(fā)現(xiàn)濕度和氨暴露慢性應(yīng)激影響淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。本研究在明確單一刺激原基礎(chǔ)上，從表型、先天免疫（炎性因子：IL1、細(xì)胞因子：IFN與IgM）、抗應(yīng)激能力（H/L 值）、特異性免疫（IgY 與淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率）等方面系統(tǒng)評(píng)價(jià)不同血型抗病力差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B21 血型個(gè)體在這些方面都存在一定優(yōu)勢(shì)，由于不同血型的雞只飼養(yǎng)在同一環(huán)境中，表明不同血型的個(gè)體對(duì)疾病的抵抗力存在差異，但是否能表明B21 血型具有良好的抗病力，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

3.3 地方雞抗性遺傳機(jī)制分析 近年來(lái)，以我國(guó)地方雞種為主要血統(tǒng)來(lái)源的優(yōu)質(zhì)雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2019 年已超過(guò)白羽肉雞，但困擾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的疾病問(wèn)題一直未解決，尤其困擾產(chǎn)業(yè)多年的“兩白”（雞白痢與禽白血?。┲两裆形唇鉀Q，每年造成的損失近百億。究其根本原因，地方雞抗性遺傳機(jī)制尚未闡明。鑒于TLR4 在禽類中具有很高的保守性，本研究針對(duì)地方雞流行的腸炎沙門菌，從經(jīng)典的TLR4 信號(hào)通路角度探討狼山雞不同血型的抗性遺傳機(jī)制差異。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)地方雞種免疫反應(yīng)模式與國(guó)內(nèi)外其他雞種無(wú)明顯差異，TLR4 信號(hào)通路中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因之間的共表達(dá)系數(shù)較高，呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。地方雞種與國(guó)外雞種的抗病力差異可能體現(xiàn)在具體的抗性機(jī)制差異，這與Li 等、Li 等、Xie 等、宋詠梅等報(bào)道一致。MyD88 依賴和TRIF 依賴的途徑是競(jìng)爭(zhēng)性和互斥的。TLR4/MyD88 途徑始于位于質(zhì)膜上的（LPS/MD-2/TLR4）2 復(fù)合體，而TLR4/TRIF 轉(zhuǎn)導(dǎo)始于復(fù)合體內(nèi)化為內(nèi)體后，通過(guò)選擇性作用于下游信號(hào)分子。Shim 等發(fā)現(xiàn)，一些抗菌肽的抗炎作用是基于抑制LPS 刺激的細(xì)胞中的TLR4 內(nèi)吞作用，這也阻斷了TLR4 信號(hào)傳導(dǎo)的TRIF 依賴性分支。另外，研究還發(fā)現(xiàn)CD14 在促進(jìn)TLR4-MD2-LPS 復(fù)合物內(nèi)化到內(nèi)體中起關(guān)鍵作用。在MyD88 依賴性途徑中，TIRAP 銜接子被募集到構(gòu)成活化由內(nèi)外2 個(gè)異二聚體形成的TLR4 二聚體，并且結(jié)合通過(guò)其全內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生。TIRAP 是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，具有膜錨定所必需的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并形成同型二聚體。在狼山雞中，不同血型抗性機(jī)制存在差異，在B21 血型中，TLR4-MyD88-NF-B1 信號(hào)通路中，除外，其余關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)水平顯著低于B13 血型個(gè)體，而TLR4-TRIF-IRF3 信號(hào)通路中，除外，其余關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)水平顯著高于B13 血型個(gè)體，表明不同血型的炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)機(jī)制不同，B21 血型個(gè)體可能通過(guò)抑制促炎因子表達(dá)與提高干擾素表達(dá)協(xié)同方式呈現(xiàn)出更好的抵抗腸炎沙門菌感染。結(jié)合表型、先天免疫和特異免疫等指標(biāo)，地方雞確實(shí)存在獨(dú)特的抗性遺傳機(jī)制，這是由于長(zhǎng)期選擇導(dǎo)致遺傳進(jìn)化還是自發(fā)遺傳突變引起的還需要進(jìn)一步研究，且這種遺傳機(jī)制是否適用于其他品種的相同血型也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

狼山雞血型以B13 與B21 血型為主。B21 血型個(gè)體一般抗病力與抗應(yīng)激能力優(yōu)于B13 血型，且通過(guò)抑制促炎因子表達(dá)與提高干擾素表達(dá)水平協(xié)同方式抵抗腸炎沙門菌感染。