杜仲葉提取物的生物學(xué)功能及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展

黃 林，周 斌，傅張琴，孫 宏

（1.浙江群大飼料科技股份有限公司，浙江海寧 314414；2.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測總站，浙江杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021）

抗生素類飼料添加劑的使用給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大便利，但其濫用所導(dǎo)致的畜禽免疫力降低和抗生素耐藥性等問題也日益突出，嚴(yán)重威脅人類健康。我國自2020 年7 月起全面禁止生產(chǎn)含有促生長類藥物添加劑（中藥類除外）的商品飼料（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第194 號），研發(fā)飼用抗生素替代品已成為畜牧業(yè)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。中草藥（植物）及其提取物的來源廣泛，安全性高，抗菌性強(qiáng)且具有多種生理活性，其作為飼用抗生素替代品具有良好的開發(fā)應(yīng)用價值。

杜仲（）是我國特有的名貴中藥材，其種植歷史久遠(yuǎn)，主要分布在我國河南、湖北、貴州、云南和貴州等中南部省份。杜仲葉提取物是從新鮮杜仲葉片中提取的生物活性成分，主要含有綠原酸、黃酮類化合物、酚（酸）類和萜類化合物等，具有抗菌消炎、抗氧化、提高動物免疫力等藥學(xué)功效。近年來的研究證實(shí)，杜仲葉提取物及其所含的綠原酸組分可作為飼用抗生素替代品使用，在提高畜禽免疫力和生產(chǎn)性能方面發(fā)揮重要作用。我國2013 年公布的《飼料添加劑品種目錄》正式將杜仲葉提取物列入飼料添加劑使用。本文就杜仲葉提取物的主要活性成分、生物學(xué)功能及其在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為杜仲葉提取物在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 杜仲葉提取物的活性成分

目前已鑒定的植物杜仲來源活性化合物成分超過180 種，其中杜仲葉中含有86 種，主要為木脂素類、環(huán)烯醚萜類、酚（酸）類、黃酮及多糖類化合物，其代表性化合物成分如表1 所示。

表1 杜仲葉及其提取物中的主要化學(xué)成分

杜仲葉提取物的提取工藝按照提取溶劑差異主要分為水提取和醇類（主要是甲醇和乙醇）提取兩大類。研究表明，杜仲葉提取物的活性成分在不同提取溶劑中溶解能力存在差異，杜仲多糖類化合物易溶于水溶性溶劑，黃酮和酚（酸）類等則更易溶于醇類溶劑，因而提取工藝影響了提取物中活性成分的含量。陳玉敏等報道，杜仲葉水溶液提取物中綠原酸組分的含量最高可達(dá)28.51%。杜仲葉總黃酮則采用60%濃度的甲醇提取效果最佳，總量可達(dá)到207.006 mg/g，總酚（酸）則應(yīng)采用60%濃度的乙醇溶液提取，最高含量為38.439 mg/g；而采用85%乙醇溶劑提取杜仲鮮葉可使提取物中的木脂素含量提高50 倍。此外，在采用乙醇提取時，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)——京尼平苷酸含量可達(dá)65.8 mg/g。但目前有關(guān)不同提取工藝影響杜仲葉提取物中活性成分差異的報道仍較少，且主要集中于對特定單一目標(biāo)活性化合物的研究。有研究表明，當(dāng)僅以環(huán)烯醚萜類中的京尼平苷酸和綠原酸為評價指標(biāo)時，采用醇溶液提取的總提取率為水溶液提取工藝的3 倍。

特定輔助提取工藝（如加入蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等酶類和超聲波輔助處理）可進(jìn)一步提高杜仲葉提取物中綠原酸、桃葉珊瑚苷和黃酮類等物質(zhì)含量，表明通過物理和化學(xué)手段擴(kuò)大植物組織結(jié)構(gòu)間隙，可提高活性成分的溶出量。但上述輔助手段過程較為復(fù)雜，如果提高活性成分的提取率所獲得的產(chǎn)值增加可覆蓋其生產(chǎn)成本，將更利于杜仲葉提取物的工業(yè)化生產(chǎn)。綜合而言，目前根據(jù)《飼料添加劑目錄（2013）》（農(nóng)業(yè)部公告第2045 號）的要求判斷飼用杜仲葉提取物的品質(zhì)，主要以綠原酸、黃酮類物質(zhì)和多糖類物質(zhì)的含量為指標(biāo)，且在杜仲葉提取物標(biāo)準(zhǔn)中明確限定了以綠原酸（干燥品計）含量高于4.5%作為質(zhì)量的控制要求。

2 杜仲葉提取物的生物學(xué)功能

2.1 抗菌作用 杜仲葉提取物具有廣譜抗菌功效，該作用首先與其所含的高濃度綠原酸有關(guān)。但目前綠原酸的抑菌機(jī)制尚不明確，可能與酚類物質(zhì)通過去極化等多種手段影響病原微生物的細(xì)胞膜通透性，最終殺滅病原菌的作用模式有關(guān)。另一方面，桃葉珊瑚苷等環(huán)烯醚萜類物質(zhì)也發(fā)揮了重要的抗菌作用。研究表明，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)是一類天然的植物抗生素，主要被植物分泌用于抵御外源病菌侵襲。其抑菌作用主要通過含有二醛結(jié)構(gòu)的苷元與細(xì)菌表面蛋白進(jìn)行共價偶聯(lián)，從而導(dǎo)致蛋白發(fā)生變性而發(fā)揮抑菌作用。Li 等深入比較了該類物質(zhì)對不同病原微生物的作用效果后發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，在體外的最小抑制濃度可達(dá)到0.031 3 mg/mL，表明其具有替代抗生素的潛力。

2.2 抗氧化作用 由高溫、高濕等惡劣養(yǎng)殖環(huán)境造成的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致動物細(xì)胞損傷，誘發(fā)動物機(jī)體多種疾病，進(jìn)而降低養(yǎng)殖生產(chǎn)效率的重要因素。杜仲葉提取物中含有大量的綠原酸等酚（酸）類物質(zhì)及黃酮類化合物，因而具有顯著的清除機(jī)體自由基和抗氧化功效。Yen報道，杜仲葉的水浸提物具有極高的抗氧化活性，能夠體外清除羥自由基和超氧陰離子自由基；且黃酮類物質(zhì)含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)。酚類化合物的抗氧化機(jī)制主要是基于其包含的特定化學(xué)基團(tuán)（如羥基等）對氧自由基的淬滅作用。在體內(nèi)，杜仲葉提取物及其所含的黃酮類化合物發(fā)揮抗氧化功效則基于多條代謝途徑：①通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)p38MAPK 信號通路和核因子E2相關(guān)因子2 通路來降低動物機(jī)體的氧化應(yīng)激水平；②通過直接降低動物機(jī)體中丙二醛含量來發(fā)揮抗氧化效果，從而保護(hù)細(xì)胞的正常代謝。

2.3 調(diào)節(jié)免疫力作用 杜仲葉提取物在動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用包含多個方面。首先，其可直接影響動物免疫器官的發(fā)育水平來提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，進(jìn)而提高動物整體的免疫力。其次，在特定動物（如仔豬）上，杜仲葉提取物調(diào)節(jié)免疫功能的作用則與其改善小腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的一類特殊免疫調(diào)節(jié)蛋白—Ghrelin 蛋白的能力有關(guān)。但上述兩方面作用的具體機(jī)制及與提取物中某個特定化合物的對應(yīng)關(guān)系仍未明確。目前，了解最為清楚的杜仲葉提取物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制主要是基于Toll 樣受體4 介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-B 信號通路。如Park 等報道，桃葉珊瑚苷可通過抑制體外小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 中NF-B 信號來抑制腫瘤壞死因子的mRNA 和蛋白質(zhì)合成。此外，杜仲多糖也可通過抑制Toll 樣受體4 介導(dǎo)的該信號通路來降低減輕炎癥反應(yīng)。綜上可見，杜仲葉提取物中的多種活性成分可通過NF-B 信號通路發(fā)揮抑制動物機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用。

2.4 調(diào)節(jié)糖、脂代謝作用 杜仲葉提取物的主要成分綠原酸和京尼平苷可顯著提高機(jī)體的膽汁分泌，從而促進(jìn)動物機(jī)體脂類物質(zhì)的代謝。劉青翠等進(jìn)一步推測，該種脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用可能與綠原酸降低了血清中膽固醇合成關(guān)鍵限速酶（3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶）活性，促進(jìn)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化有關(guān)。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物有降低血糖的功效：①杜仲葉提取物中的黃酮類物質(zhì)（如槲皮素和山奈酚）具有糖基化抑制作用；②競爭性抑制體外Caco-2 細(xì)胞內(nèi)蔗糖酶和麥芽糖酶等二糖酶的作用位點(diǎn)，降低葡萄糖的產(chǎn)生，半抑制濃度分別達(dá)到0.07 mg/mL 和0.53 mg/mL；③杜仲葉提取物中的兒茶素等化合物也可與腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合，影響葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收效率。因此，杜仲葉提取物可用于干預(yù)畜禽的過度肥胖等生產(chǎn)問題。

2.5 調(diào)節(jié)骨代謝作用 目前，針對杜仲葉提取物調(diào)節(jié)機(jī)體的骨代謝能力方面的研究較少，主要集中于對黃酮類物質(zhì)和桃葉珊瑚苷的作用機(jī)制研究。Wattel 等證實(shí)，黃酮類物質(zhì)中的槲皮素在成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控上發(fā)揮了核心作用，可顯著促進(jìn)動物的骨分化和生長。桃葉珊瑚苷調(diào)控骨代謝的機(jī)制則主要通過影響骨細(xì)胞和髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖分化來實(shí)現(xiàn)。研究表明，桃葉珊瑚苷可抑制MG63 細(xì)胞中骨分化相關(guān)蛋白OCN、OPN、Collagen I 和Osterix 的表達(dá)，同時促進(jìn)成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵蛋白BMP2 及其下游Smads 蛋白的磷酸化，實(shí)現(xiàn)對骨細(xì)胞分化的保護(hù)作用。相信隨著提取和分離技術(shù)的進(jìn)步，杜仲葉提取物中的其他單一活性組分在調(diào)節(jié)骨代謝方面的作用機(jī)制將得到進(jìn)一步解析。

3 杜仲葉提取物在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 杜仲葉提取物在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用 杜仲葉提取物在肉雞上已有廣泛應(yīng)用，對肉雞生產(chǎn)性能的提高作用明顯。作者前期在黃羽肉雞上的飼養(yǎng)研究表明，添加濃度為300 mg/kg 杜仲葉提取物（綠原酸≥5%、黃酮類≥8%、多糖≥20%）或搭配添加抗生素均可顯著改善肉雞的生長性能、抗氧化能力，并增強(qiáng)肉雞的免疫功能。同時，添加相同濃度（300 mg/kg）的同種杜仲葉提取物產(chǎn)品還可顯著提高黃羽肉雞的飼料消化率、改善肉雞十二指腸的腸道形態(tài)，提升包括胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶在內(nèi)的消化酶活性，表明其對肉雞消化功能和相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)利用也有幫助。杜仲葉提取物（綠原酸28.51%）在AA 肉雞上的最佳添加濃度為0.15%，在該水平下可顯著提高肉雞生長和免疫功能，提示杜仲葉提取物的最佳應(yīng)用濃度在不同肉雞上有差異。同時考慮到目前市場杜仲葉提取物的產(chǎn)品種類多，杜仲葉提取物中綠原酸等有效成分的差異可能也影響了其最佳使用濃度。

在肉雞日糧中添加杜仲葉提取物還可進(jìn)一步提升肉雞的雞肉品質(zhì)。Zhao 等報道，添加濃度為1 000 mg/kg 的醇溶液杜仲葉提取物（綠原酸820 mg/g）可顯著降低Ross 308 肉雞的雞肉滴水損失，顯著提高包括pH、肉色a 值在內(nèi)的肉品質(zhì)指標(biāo)，并改善雞肉中的風(fēng)味脂肪酸比例。在蛋雞方面，添加終濃度為300 mg/kg 的杜仲葉水溶提取物（綠原酸≥7%、黃酮類≥15%、多糖≥40%）效果最佳，可顯著降低產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞的死淘率和軟蛋率，提高雞蛋品質(zhì)，表明杜仲葉提取物對雞蛋品質(zhì)也有提高作用。目前，國內(nèi)外涉及單一杜仲葉提取物在鴨類養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果研究報道較少。杜仲葉提取物是否對鴨類的健康養(yǎng)殖有輔助作用需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 杜仲葉提取物在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用 杜仲鮮葉在我國用于生豬養(yǎng)殖早在明代就有記載，其提取物對斷奶仔豬的作用主要表現(xiàn)為提高仔豬的腸道免疫功能和抗氧化能力，從而保障仔豬的生長性能。陳鵬等報道，給斷奶仔豬飼喂?jié)舛葹?50 mg/kg 的杜仲葉提取物（綠原酸≥5%、黃酮類≥8%、多糖≥20%）顯著提高了其日增重和抵御氧化應(yīng)激的能力。徐明濤等采用濃度為250 mg/kg 的同類杜仲葉提取物產(chǎn)品飼喂杜×長×大斷奶仔豬后也發(fā)現(xiàn)，其可顯著提高小腸絨毛發(fā)育水平，提升小腸黏膜上皮細(xì)胞分泌蛋白的能力，最終提高斷奶仔豬的機(jī)體免疫力。對仔豬腸道健康的促進(jìn)作用可能與杜仲葉提取物中黃原酸等活性物質(zhì)保護(hù)腸道屏障的完整性有關(guān)。

另一方面，杜仲葉提取物在育肥豬上的效果主要表現(xiàn)為對豬只生長的促進(jìn)作用和脂肪代謝的影響。Zhou等研究表明，含有33.7%黃原酸的杜仲葉提取物可顯著提高育肥豬的平均日增重，同時降低耗料增重比。此外，由于前述杜仲葉提取物參與了脂肪和糖類在機(jī)體的代謝，因而育肥豬日糧中添加杜仲葉提取物對其豬肉品質(zhì)也有提升作用，特別是可顯著影響豬肉pH、纖維密度、顏色等指標(biāo)，同時顯著降低了纖維直徑。但目前有關(guān)利用杜仲葉提取物改善育肥豬豬肉品質(zhì)的研究仍較少，其針對所含有效成分所確定的添加比例還需進(jìn)一步研究。

3.3 杜仲葉提取物在反芻動物生產(chǎn)中的應(yīng)用 杜仲葉提取物在奶牛上的應(yīng)用主要表現(xiàn)為提高產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)。孔韜等報道，奶?；A(chǔ)日糧中添加濃度高于20 g/（d·頭）杜仲葉提取物（綠原酸≥3.5%、黃酮類≥8%、多糖≥20%）后可顯著提升平均日產(chǎn)奶量和牛奶中的乳蛋白率，進(jìn)而提高奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。在相同應(yīng)用濃度下，添加杜仲葉提取物也可顯著提高牛奶乳脂率，同時降低乳腺體細(xì)胞數(shù)。以上結(jié)果表明該濃度可能為奶牛較為合適的應(yīng)用濃度。與在單胃動物上的研究結(jié)果不同，當(dāng)杜仲葉提取物（綠原酸含量為4.85%）在泌乳奶牛上的添加量達(dá)到200 g/（d·頭）后對營養(yǎng)物質(zhì)的消化具有明顯的抑制作用，表明其存在安全使用濃度，且其負(fù)面影響的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。另一方面，Liu 等報道，湖羊日糧中添加最高濃度為10 g/kg 杜仲葉醇溶提取物（綠原酸821 g/kg）后，可顯著降低瘤胃中硝酸銨濃度，提高機(jī)體抗氧化水平。上述研究表明，杜仲葉提取物可能對瘤胃微生物的發(fā)酵模式也產(chǎn)生了影響。此外，杜仲葉提取物對肉羊肉品質(zhì)也具有明顯的改善作用，主要表現(xiàn)為羊肉的pH顯著提高，肉中丙二醛含量顯著降低。需要注意的是，目前多數(shù)杜仲葉提取物在養(yǎng)殖動物上的應(yīng)用評價研究缺乏對原料中活性成分的準(zhǔn)確定量檢測，從而可能間接導(dǎo)致了不同動物試驗(yàn)的結(jié)果差異，也不利于總結(jié)歸納出針對特定動物群體的最佳用量。因此，未來在進(jìn)行相關(guān)動物研究時，對原料中綠原酸等成分的定量檢測顯得十分必要。

4 小結(jié)和展望

當(dāng)前，杜仲葉提取物作為一種新型的多功能飼料添加劑使用逐漸受到重視，但多個有關(guān)其生物學(xué)活性的關(guān)鍵問題仍有待解決：①特定生物學(xué)功能，特別是杜仲葉提取物的免疫調(diào)節(jié)作用與提取物中單一活性化合物的對應(yīng)關(guān)系及其作用途徑；②多種功能活性成分在不同養(yǎng)殖動物上的作用效果的解析；③杜仲葉提取物制備工藝條件優(yōu)化，特別是不同工藝獲得的提取物中活性成分的差異研究與其體內(nèi)外功能效果的影響。因此，深入探討單一的活性化合物組分、合適的配伍組合與其生物學(xué)功能關(guān)系的研究仍將會是未來的重要方向。隨著研究的不斷完善，杜仲葉提取物作為一種多功能的飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用將會獲得越來越多的關(guān)注。