ICU獲得性衰弱模型大鼠細(xì)胞因子和骨骼肌病理結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化及意義

高 宇,譚旭宏,胡永勝

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550001;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 貴陽(yáng) 550001)

ICU獲得性衰弱(ICU acquired weakness,ICU-AW)是一種以神經(jīng)肌肉功能障礙為主,主要表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性肌無(wú)力,常累及四肢及呼吸肌,且除危重癥外沒(méi)有其他合理的病因解釋的臨床綜合征,是危重癥病人常見(jiàn)的并發(fā)癥［1］。近年來(lái),隨著危重癥診療技術(shù)的發(fā)展,例如氣管插管、機(jī)械通氣的廣泛應(yīng)用以及充分的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜外加上廣譜抗生素甚至激素的使用,雖然增加了危重患者的生存機(jī)會(huì),但隨之而來(lái)也要面臨著ICU-AW的發(fā)病率逐漸升高［2-3］。調(diào)查顯示,約80%的ICU-AW患者會(huì)發(fā)生膈肌功能障礙,這可能與感染導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放,進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體自由基生成,導(dǎo)致肌肉耐力和力量降低有關(guān)［4-6］。研究表明,在全身炎癥反應(yīng)中,相較于其他骨骼肌,膈肌損傷發(fā)生更早［7］。細(xì)胞因子作為神經(jīng)、肌肉炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及肌肉蛋白代謝的主要參與者,其不僅參與炎癥反應(yīng),造成神經(jīng)損傷,也會(huì)影響肌肉蛋白質(zhì)代謝。目前關(guān)于ICU-AW骨骼肌損傷及細(xì)胞因子相關(guān)研究報(bào)道較少,故本次實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)盲腸穿刺結(jié)扎法(CLP)構(gòu)建大鼠ICU-AW模型,在觀察ICU-AW模型大鼠骨骼肌損傷特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討骨骼肌損傷與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián),為ICU-AW的診療方向及炎癥機(jī)制提供更多新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 54只SPF級(jí)SD雄性大鼠,6周齡,體重180～220 g,購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2019-0010］。飼養(yǎng)條件：溫度20～26 ℃,濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠IL-1β、IL-6、IL-22(ELISA)測(cè)定試劑盒(MM-0046R1、MM-0190R1、MM-0670R1,江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司);蘇木素染液(G1004,Servicebio);蘇木素返藍(lán)液(G1040,Servicebio);伊紅染色液(G1001,Servicebio);Masson三色染色液(G1006,Servicebio)。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(WD-2012B,北京六一);電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082B,上海-恒科學(xué)儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(TGL-16.5M,上海盧湘儀離心機(jī)有限公司);組織脫水機(jī)(KD-TS3S1,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);石蠟包埋機(jī)(HistoCore Arcadia,Leica);切片機(jī)(HistoCore BIOCUT,Leica);攤片機(jī)(Leica HI1210,Leica);電熱恒溫干燥箱(HGZF-101-1,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);顯微鏡(BX43,OLYMPUS)。

1.3 ICU-AW大鼠模型建立及分組 采用大鼠剪耳編號(hào)法,先將18只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組,每組6只,并記錄各組大鼠體重,于造模后第6天全部處死后留取血清、膈肌及腓腸肌標(biāo)本。隨后將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組,每組18只,并記錄各組大鼠體重,于造模后第1、3、6天,各組任意挑選6只大鼠,處死后取材。模型組通過(guò)CLP造模［8］,術(shù)前禁食12 h,予腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉滿意后,開(kāi)腹暴露盲腸,用4-0絲線在盲腸中段結(jié)扎,并于盲腸末端用18G針頭對(duì)穿盲腸,擠出少量腸內(nèi)容物后,回納盲腸逐層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組僅開(kāi)腹拉出盲腸回納腹腔后逐層縫合。對(duì)照組常規(guī)飼料正常喂養(yǎng),不做處理。實(shí)驗(yàn)倫理審批編號(hào)為2022060201。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 一般情況 于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后觀察并記錄各組大鼠的外觀表現(xiàn),包括精神行為狀態(tài)、毛發(fā)光澤度及疏密情況、進(jìn)食水情況、外界反應(yīng)等。

1.4.2 體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重 于造模后各時(shí)間點(diǎn)稱(chēng)取各組大鼠體重后處死,留取膈肌及雙側(cè)腓腸肌,分別稱(chēng)重,將一部分膈肌及左后肢腓腸肌置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續(xù)ELISA檢測(cè)。剩余膈肌及右后肢腓腸肌放入10%中性福爾馬林溶液中待HE染色和Masson染色,并記錄各組大鼠體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重的變化。

1.4.3 ELISA檢測(cè) 將待測(cè)大鼠血清、膈肌及腓腸肌組織勻漿離心后所得上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算血清、膈肌及腓腸肌組織中IL-1β、IL-6及IL-22的水平。

1.4.4 大鼠膈肌、腓腸肌組織HE染色和Masson染色 將待測(cè)大鼠膈肌、腓腸肌組織用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)清洗后,濾紙吸干,各取2 cm組織放置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h,依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟水化、HE染色,封片后顯微鏡下觀察拍照,并使用圖像分析軟件ImageJ對(duì)膈肌及腓腸肌纖維平均橫截面積(cross-sectional area,CSA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將組織石蠟切片依次進(jìn)行常規(guī)梯度脫蠟至水,重鉻酸鉀染色,鐵蘇木素染色,麗春紅酸性品紅染色,磷鉬酸染色,苯胺藍(lán)染色,常規(guī)封片后顯微鏡下觀察拍照,并使用圖像分析軟件ImageJ對(duì)膈肌及腓腸肌組織中膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。CVF=同一視野中的膠原面積/所測(cè)視野總面積×100%。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)CLP建立ICU-AW模型 通過(guò)CLP建立ICU-AW大鼠動(dòng)物模型,對(duì)照組與假手術(shù)組比較,在各項(xiàng)指標(biāo)上均無(wú)顯著差異(P>0.05);模型組大鼠體重、膈肌及腓腸肌濕重、膈肌濕重/體重及腓腸肌濕重/體重相較于對(duì)照組和假手術(shù)組均減低(P<0.05),而IL-1β、IL-6及IL-22的水平均增加(P<0.05,圖1)。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的骨骼肌組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常,組織中的膠原纖維含量較少;模型組膈肌及腓腸肌的肌纖維排列紊亂、間隙增寬,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),組織中的膠原纖維大量堆積;模型組肌纖維橫截面積相較于對(duì)照組和假手術(shù)組均減低(P<0.05),而組織中膠原容積分?jǐn)?shù)增加(P<0.05,圖2)。

A1：各組大鼠體重比較;A2：各組大鼠膈肌及腓腸肌濕重比較;A3：各組大鼠膈肌濕重/體重及腓腸肌濕重/體重比較;B1：各組大鼠IL-1β水平比較;B2：各組大鼠IL-6水平比較;B3：各組大鼠IL-22水平比較;*：與同組對(duì)照組比較,P<0.05。 圖1 各組大鼠體重、膈肌濕重、腓腸肌濕重、膈肌濕重/體重及腓腸肌濕重/體重和細(xì)胞因子水平比較

A：HE染色;B：Masson染色;標(biāo)尺=50 μm;*：與同組對(duì)照組比較, P<0.05。圖2 各組大鼠膈肌及腓腸肌病理變化和纖維橫截面積及膠原容積分?jǐn)?shù)比較

2.2 大鼠體重及膈肌、腓腸肌濕重 與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比,模型組大鼠體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重在各時(shí)間點(diǎn)均減低(P<0.01)。假手術(shù)組體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重在6 d中持續(xù)增加(P<0.05);模型組體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重在6 d中持續(xù)減低(P<0.05,圖3)。

*：與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較,P<0.01;a：與假手術(shù)組第1天比較, P<0.05;b：與假手術(shù)組第3天比較,P<0.05;c：與模型組第1天比較,P<0.05;d：與模型組第3天比較,P<0.05。圖3 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重比較

2.3 ELISA檢測(cè) 與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清、膈肌及腓腸肌組織中IL-1β、IL-6及IL-22的水平在各時(shí)間點(diǎn)均增加(P<0.01)。假手術(shù)組所有細(xì)胞因子在各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組血清、膈肌組織中IL-1β在第1天達(dá)到高峰(圖4A1、A2);腓腸肌組織中IL-1β在6 d中持續(xù)升高(圖4A3);模型組血清中IL-6在第3天達(dá)到高峰,第6天有所降低(圖4B1);模型組膈肌組織中IL-6在第1天達(dá)到高峰(圖4B2);模型組腓腸肌組織中IL-6在6 d中持續(xù)升高(圖4B3);模型組血清、膈肌組織中IL-22在第1天達(dá)到高峰(圖4C1、C2);模型組腓腸肌組織中IL-22在6 d中持續(xù)升高(圖4C3)。

*：與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較,P<0.01;c：與模型組第1天比較, P<0.05;d：與模型組第3天比較, P<0.05。圖4 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清、膈肌及腓腸肌組織中IL-1β、IL-6、IL-22的水平比較

A1、A2：假手術(shù)組;B1、B2：模型組;標(biāo)尺=50 μm;HE染色。圖5 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)膈肌和腓腸肌病理變化

2.4 膈肌及腓腸肌病理變化 如圖5所示,假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)膈肌及腓腸肌的纖維橫切面呈多邊形,排列均較為整齊,大小粗細(xì)均等,無(wú)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形位于邊緣。模型組大鼠膈肌及腓腸肌的肌纖維橫切面呈不規(guī)則多邊形,肌纖維排列紊亂、大小不均、間隙增寬,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且以彌散性炎性細(xì)胞增多為主,部分肌纖維腫脹,間質(zhì)充血、水腫,術(shù)后第6天模型組病理情況較第1天和第3天逐漸嚴(yán)重化。與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比,模型組大鼠膈肌及腓腸肌纖維橫截面積在各時(shí)間點(diǎn)均減低(P<0.01);假手術(shù)組膈肌和腓腸肌纖維橫截面積在6 d中持續(xù)增加,而模型組膈肌和腓腸肌纖維橫截面積在6 d中持續(xù)減低(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

如圖7所示,假手術(shù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)膈肌、腓腸肌組織中的膠原纖維含量較少,排列整齊。模型組大鼠膈肌、腓腸肌組織中的膠原纖維大量堆積,排列紊亂,部分肌纖維腫脹。與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組相比,模型組大鼠膈肌及腓腸肌中膠原容積分?jǐn)?shù)在各時(shí)間點(diǎn)均增加(P<0.01);假手術(shù)組膈肌及腓腸肌中膠原容積分?jǐn)?shù)在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P>0.05);模型組膈肌和腓腸肌中膠原容積分?jǐn)?shù)在6天中持續(xù)增加(P<0.05,圖8)。

A1、A2：假手術(shù)組;B1、B2：模型組;標(biāo)尺=50 μm;Masson染色。圖7 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)膈肌和腓腸肌病理變化

*：與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較,P<0.01;c：與模型組第1天比較,P<0.05; d：與模型組第3天比較,P<0.05。圖8 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)膈肌和腓腸肌膠原容積分?jǐn)?shù)比較

3 討論

目前ICU-AW常用的造模方法主要有糖皮質(zhì)激素-去神經(jīng)支配模型、膿毒癥模型、廢用性模型、高水平糖皮質(zhì)激素模型、模擬ICU模型及兔燒傷模型等［9］。為了研究ICU-AW的骨骼肌內(nèi)在炎癥情況,本研究采用了CLP構(gòu)建ICU-AW模型,結(jié)果顯示,ICU-AW模型大鼠出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、體毛干枯、進(jìn)食水量減少、少動(dòng)扎堆、腹瀉等表現(xiàn),癥狀隨著時(shí)間推移逐漸加重,體重及骨骼肌濕重明顯減低,體內(nèi)炎性細(xì)胞因子顯著增加,膈肌及腓腸肌病理切片可見(jiàn)肌纖維排列紊亂、間隙增寬、骨骼肌纖維萎縮、膠原纖維增多。這與唐章等［10］構(gòu)建的ICU-AW大鼠模型結(jié)果相符。本文通過(guò)CLP成功構(gòu)建了ICU-AW模型大鼠,為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。

炎性細(xì)胞因子可加重全身炎癥反應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)代謝失衡和骨骼肌線粒體損傷,進(jìn)而造成肌肉萎縮、肌肉氧化代謝能力減退和骨骼肌細(xì)胞凋亡［11-12］。IL-1β、IL-6、IL-22作為主要的炎性因子,不光由免疫細(xì)胞分泌,骨骼肌細(xì)胞也是其重要的分泌場(chǎng)所［13］。IL-1β作為細(xì)胞因子IL-1家族中的成員,由活化的巨噬細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成,基礎(chǔ)狀態(tài)下IL-1β在骨骼肌纖維中呈低水平表達(dá),而在劇烈運(yùn)動(dòng)后和炎性肌病中表達(dá)升高［14］。Friedrich等［15］研究發(fā)現(xiàn),IL-1β具有減少大鼠腓腸肌重量和降低蛋白含量的作用,而其受體拮抗劑能夠?qū)辜∪馕s。李昊等［16］研究發(fā)現(xiàn),肌萎縮側(cè)索硬化模型小鼠骨骼肌和脊髓內(nèi)IL-1β高水平表達(dá),提示炎性反應(yīng)可能與肌肉的去神經(jīng)化和萎縮有關(guān)。IL-6是經(jīng)典的炎癥因子,具有多種生物學(xué)功能,在健康人體內(nèi)處于極低水平,一般不超過(guò)7 pg/mL,但在感染早期2 h內(nèi)可達(dá)到峰值,高水平升高時(shí)可造成神經(jīng)細(xì)胞損傷［17］。過(guò)量的IL-6會(huì)刺激中性粒細(xì)胞,產(chǎn)生過(guò)量的彈性蛋白酶及活性氧,并進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成損害［18］。Zanders等［19］研究發(fā)現(xiàn),IL-6通過(guò)調(diào)控gp130/JAK2/STAT3信號(hào)通路可引起C2C12成肌細(xì)胞萎縮,參與膿毒癥介導(dǎo)肌肉萎縮的發(fā)生。尹愛(ài)凝等［20］研究發(fā)現(xiàn),欖香烯能夠通過(guò)降低IL-6水平,調(diào)控泛素-蛋白酶體途徑,緩解惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮的發(fā)生。IL-22屬于IL-10家族中的成員,主要由適應(yīng)性及固有免疫細(xì)胞分泌,在抗微生物防御、保護(hù)及修復(fù)組織損傷、急性期反應(yīng)等方面起關(guān)鍵作用,但高水平表達(dá)的IL-22在多種炎癥性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等條件下會(huì)誘導(dǎo)其他促炎因子的表達(dá),引起組織損傷和慢性炎癥等致病性效應(yīng)［21-22］。IL-22所具有的促炎、抗炎雙重特性,在不同的疾病中表現(xiàn)出的作用也不盡相同。劉爽等［23］研究也發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血Th22和IL-22水平明顯提高,外周血Th22與PCT、APACHE Ⅱ評(píng)分呈正相關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇上述指標(biāo)來(lái)研究ICU-AW模型大鼠細(xì)胞因子與骨骼肌損傷的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的全身中毒癥狀;模型組大鼠體重、膈肌濕重、膈肌濕重/體重、腓腸肌濕重及腓腸肌濕重/體重相較于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組均減低(P<0.01),并隨著病程進(jìn)展,呈進(jìn)行性下降;模型組大鼠骨骼肌存在肌纖維排列紊亂、間隙增寬、間質(zhì)充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增多等病理表現(xiàn);骨骼肌纖維橫截面積低于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P<0.01),并持續(xù)減低;骨骼肌中膠原容積分?jǐn)?shù)高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組(P<0.01),并持續(xù)增加;這表明模型組大鼠存在骨骼肌萎縮及膠原纖維增加等病理表現(xiàn),這與既往對(duì)于ICU-AW模型大鼠骨骼肌病理研究結(jié)果相一致［24］。另外,模型組大鼠血清、膈肌及腓腸肌組織中IL-1β、IL-6及IL-22的水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組(P<0.01),且呈動(dòng)態(tài)變化,說(shuō)明ICU-AW模型大鼠不僅存在全身炎癥反應(yīng),且膈肌及腓腸肌組織中也存在局部炎癥反應(yīng)。

綜上所述,通過(guò)CLP建立的ICU-AW模型大鼠存在著全身中毒表現(xiàn)的外觀特征,血清及骨骼肌組織中炎性細(xì)胞因子也呈高水平表達(dá),骨骼肌組織切片中出現(xiàn)了明顯的肌肉萎縮、膠原纖維增多及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化,并隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)加重,表明了ICU-AW中表現(xiàn)出的骨骼肌損傷與炎癥反應(yīng)之間存在著密切聯(lián)系,其機(jī)制可能與肌肉細(xì)胞中炎性因子的過(guò)度表達(dá)有關(guān),但其更深的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。