食源性致病菌溯源分型技術(shù)研究進(jìn)展

劉 耀，魏元苗，李 玲，易倫朝，趙維薇，商 穎, ，曹建新,

（1.昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南昆明 650500；2.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671003）

食源性致病菌的溯源分型是食品安全防控和現(xiàn)代公共衛(wèi)生傳染病監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的重要組成部分[1]。因其引發(fā)的食品安全問(wèn)題頻發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)美國(guó)每年約4800萬(wàn)人感染食源性疾病，我國(guó)急性腸胃病每年約發(fā)生7.48億例[2]。細(xì)菌感染的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)步驟，首先是病原體（細(xì)菌）向宿主的傳播，然后是宿主上的定殖、粘附、侵襲、宿主存活和組織損傷[3]。細(xì)菌感染生物體后，會(huì)對(duì)機(jī)體造成很大損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。尤其抗生素的大量使用導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，極大地降低了有效治療細(xì)菌感染的可能性[4]。

細(xì)菌分型可將食源性致病菌精確區(qū)分，同一種內(nèi)不同型別菌種之間生物學(xué)特性具有一定差異，這就導(dǎo)致其防治措施不同。通過(guò)對(duì)事件中食源性致病菌相似性的研究，可以確定引起感染的細(xì)菌菌株種類和來(lái)源，從而制定正確的治療及預(yù)防方案，以防止疾病的爆發(fā)[5]。最早的細(xì)菌溯源分型方法包括血清分型、噬菌體分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型（Pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR（Repetitive-element PCR，Rep-PCR）等，隨著分子生物學(xué)及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，食源性致病菌分型溯源技術(shù)獲得了很大進(jìn)展。我國(guó)于2013年建立了全國(guó)食源性疾病分子追蹤網(wǎng)絡(luò)（TraNet），TraNet最初基于脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)對(duì)食源性病原體進(jìn)行分子亞型分析[2]。2019年，基于全基因組測(cè)序技術(shù)的食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(luò)建成并投入使用，該網(wǎng)絡(luò)提供了多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）和核心基因組多位點(diǎn)序列分型（Core-genome MLST，cgMLST）的標(biāo)準(zhǔn)化方法。此外諸如單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphism，SNP）以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）等在細(xì)菌鑒定分型領(lǐng)域都已得到了廣泛應(yīng)用。然而各種溯源分型方法原理具有一定差異，這就導(dǎo)致其應(yīng)用環(huán)境不盡相同，因此本文從常用分型方法的原理入手，對(duì)不同分型方法的分型能力以及適用范圍進(jìn)行比較分析，以期為食源性致病菌溯源分型方法的選擇提供依據(jù)。

1 基于生理生化反應(yīng)的分型方法

1.1 傳統(tǒng)血清分型

血清分型作為最早發(fā)展的細(xì)菌分型方法，自20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)抗原血清型以來(lái)，該方法已經(jīng)成為最廣泛的菌株分型方法[6]。以致病性大腸桿菌為例，可分為腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveEscherichia coli，EIEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）、腸致病性大腸桿菌（EnteropathogenicEscherichia coli，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC），如表1所示，不同血清型其致病因子、易感人群也有所差異。傳統(tǒng)的血清分型通過(guò)將抗原與特異性抗體血清作用[7]，根據(jù)其血清凝集情況對(duì)照已有的血清表進(jìn)行判別[8]，但少數(shù)細(xì)菌在血清凝集實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)發(fā)生自凝現(xiàn)象[9]，無(wú)法采用傳統(tǒng)血清學(xué)方法進(jìn)行分類，因此該方法不適用于細(xì)菌的所有血清學(xué)分類[10-11]。而菌株在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，其抗原會(huì)發(fā)生突變現(xiàn)象，傳統(tǒng)血清學(xué)分型就會(huì)把原本親緣關(guān)系較近的菌株分為不同類型，不利于菌株的溯源分析。同時(shí)傳統(tǒng)的血清學(xué)方法操作繁瑣、耗時(shí)、費(fèi)力且分辨力低，一般需要2～12 d才能完成[10,12]。雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多全自動(dòng)快速檢測(cè)儀器（如法國(guó)梅里埃公司的全自動(dòng)免疫熒光酶標(biāo)儀VIDAS）可在較大程度上替代人工，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，但細(xì)菌的富集是整個(gè)過(guò)程最為耗時(shí)的部分，由于檢測(cè)靈敏度限制，使得該部分無(wú)法省略，這就導(dǎo)致整體檢測(cè)效率依舊較低[13]。然而由于血清分型所產(chǎn)生的結(jié)果直觀、準(zhǔn)確并且有利于食源性疾病的治療，因此目前仍然被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用[14]。

表1 致病性大腸桿菌常見(jiàn)血清型及其流行病學(xué)特點(diǎn)[15]Table 1 Common serotypes and epidemiological characteristics of Enterohemorrhagic Escherichia coli[15]

1.2 噬菌體分型

噬菌體是一種在自然界中廣泛存在的病毒，可在細(xì)菌內(nèi)感染并復(fù)制，最終使宿主菌裂解死亡。根據(jù)細(xì)菌裂解能力分為溫和性噬菌體（也叫溶源性噬菌體）和烈性噬菌體[16]。溫和性噬菌體僅感染細(xì)菌，將自身基因組整合到宿主染色體中成為原噬菌體，自身并不會(huì)發(fā)生裂解反應(yīng)，而是隨著宿主細(xì)菌一起復(fù)制[17]。原噬菌體的基因代表了宿主細(xì)菌基因組中的大多數(shù)輔助基因[18]，可作為宿主細(xì)菌基因序列的高分辨標(biāo)記[19]，根據(jù)原噬菌體基因的特異性序列對(duì)宿主菌在分子生物學(xué)方面進(jìn)行篩選分型[20]。細(xì)菌噬菌體分型通常是根據(jù)烈性噬菌體對(duì)細(xì)菌的特異性裂解進(jìn)行的，目前已有許多食源性致病菌的噬菌體分型方案。何曉青等[21]建立了一種針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的噬菌體分型方法，確定了引起醫(yī)院內(nèi)感染爆發(fā)和食物中毒的主要噬菌體型。此外，噬菌體對(duì)于細(xì)菌的高度特異性機(jī)制也可作為分型依據(jù)。Sumrall等[22]基于李斯特菌噬菌體集合的重組親和蛋白（細(xì)胞壁結(jié)合域和受體結(jié)合蛋白）提出了一種新的李斯特菌分型方法，該方法能夠準(zhǔn)確識(shí)別李斯特菌的血清型，并且相比血清分型具有更高的分辨率。噬菌體分型作為一種成本低廉、操作簡(jiǎn)單、特異性高的分型技術(shù)，常被用于與其它分型方法的聯(lián)合使用。然而使用該方法的前提是具有一套用于分型所用的噬菌體，目前尚未有統(tǒng)一的噬菌體分型方案，因此各實(shí)驗(yàn)室之間很難進(jìn)行數(shù)據(jù)的比對(duì)交流，這也從一方面導(dǎo)致了該方法的應(yīng)用受限。

2 基于酶切片段的分型方法

2.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed field gel electrophoresis,PFGE）是Schwartz和Cantor于1984年發(fā)明的一種可分離大片段DNA分子的新型電泳技術(shù)[23]。通過(guò)一個(gè)或多個(gè)酶切位點(diǎn)少的限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌基因組DNA酶切，此類基于酶切片段的方法分型原理類似，因?yàn)椴煌笮〉腄NA片段在電場(chǎng)下的遷移率不同，片段越小遷移速率越快，以此將DNA片段分離開(kāi)，根據(jù)凝膠圖譜判斷其菌種類型[24]。通過(guò)聚類分析軟件，如：GelCompar、Molecular Analyst Fingerprinting、BioImage、Phoretix和BioNumerics，可進(jìn)一步分析不同亞種菌株之間的親緣關(guān)系，對(duì)其進(jìn)行溯源分析[25-26]，其分型溯源原理見(jiàn)圖1所示。PFGE已被廣泛用于各類食源性致病菌的溯源分型，并且分型效果良好。Frazao等[27]將4種包括PFGE在內(nèi)的分子分型方法對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行分型能力比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)PFGE對(duì)于空腸彎曲菌具有很好的適用性。PFGE具有一套標(biāo)準(zhǔn)化的流程，是一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確的細(xì)菌分型方法，被認(rèn)為是細(xì)菌性疾病爆發(fā)時(shí)菌株分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但該方法較為耗時(shí)，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員工作素養(yǎng)要求較高，不適用于具有大量分離株的流行病學(xué)調(diào)查[28]。此外電泳條帶受外界條件的影響較大，結(jié)果不利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的比較分析[29]。

圖 1 PFGE溯源原理圖Fig.1 Schematic diagram of PFGE

圖 2 IRS-PCR溯源原理圖[47]Fig.2 Schematic diagram of IRS-PCR[47]

2.2 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE）可以對(duì)未分離出單一菌株的細(xì)菌群落直接鑒定分型[30]，省去了傳統(tǒng)培養(yǎng)分離的繁瑣步驟。DGGE通過(guò)對(duì)不同DNA片段的解鏈溫度不同進(jìn)行分離。不同菌種16S rDNA區(qū)域的堿基組成具有一定差異[31]，當(dāng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）產(chǎn)物在含有線性變性梯度變性劑（尿素和甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，雙鏈DNA片段達(dá)到其變性濃度時(shí)，便開(kāi)始部分解鏈，電泳遷移速度隨著解鏈程度的增大而減小，從而將大小相同但序列組成不同的DNA片段分離開(kāi)，理論上其區(qū)分精度可精確到單個(gè)堿基，但在實(shí)際應(yīng)用中受變性劑以及外界條件的影響，區(qū)分精度會(huì)有所下降。并且在對(duì)基因片段PCR擴(kuò)增后，具有多個(gè)拷貝的基因僅顯示一個(gè)條帶，這也會(huì)導(dǎo)致物種鑒定的分辨率降低[32]。但與此同時(shí)，相同的擴(kuò)增區(qū)域使得DGGE的分析標(biāo)準(zhǔn)化，提高了DGGE數(shù)據(jù)的可傳播能力，在涉及大量樣本的長(zhǎng)時(shí)間分析中，這一點(diǎn)尤為重要[33]。該方法被廣泛應(yīng)用于微生物的群落多樣性分析，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DGGE在細(xì)菌種內(nèi)同樣具有很好的分型效果[34]，多被用于食品加工環(huán)節(jié)中微生物污染及生物多樣性的防控。Ndiaye等[35]對(duì)某種飲料生產(chǎn)加工過(guò)程中的微生物污染監(jiān)控發(fā)現(xiàn)，DGGE可以清晰的反應(yīng)出不同環(huán)節(jié)微生物群落（多為細(xì)菌）的變化。Baffoni等[36]使用DGGE對(duì)肉雞腸道微生物進(jìn)行監(jiān)控，確定了肉雞中空腸彎曲菌防治的最佳給藥時(shí)間，提出了保障禽肉安全性的有效策略。

2.3 細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR

細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR（Repetitive element PCR, Rep-PCR）技術(shù)1991年首次被James等[37]報(bào)道用于細(xì)菌分型，是一種依據(jù)細(xì)菌基因組間廣泛分布的短的重復(fù)序列進(jìn)行分型的方法。這些基因間的重復(fù)序列主要有重復(fù)基因外回文序列（Repetitive extragenic palindromic, REP）、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC）以及BOX插入因子等，根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)而對(duì)細(xì)菌內(nèi)的重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增，針對(duì)不同菌，序列的選擇對(duì)于Rep-PCR的分型能力也有影響。Bilung等[38]對(duì)ERIC-PCR和BOX-PCR在李斯特菌鑒別中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示BOXPCR比ERIC-PCR具有更大的區(qū)分能力。而Hashemi等[39]在研究包括REP-PCR、BOX-PCR以及ERICPCR等4種方法對(duì)于沙門(mén)氏菌的分型能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，REP-PCR的分辨力更高，并且使用兩種以上方法聯(lián)合檢測(cè)，能區(qū)分所有74株沙門(mén)氏菌。Cherif等[40]使用BOX-PCR分析蠟樣芽孢桿菌種群遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與PFGE相比，BOX-PCR不僅快捷而且具有良好實(shí)驗(yàn)室重復(fù)性。目前Rep-PCR已被廣泛應(yīng)用于副溶血性弧菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌以及其它一些具有超強(qiáng)毒力菌種的分型研究[41-43]。并且已經(jīng)開(kāi)發(fā)了商業(yè)化的DIVERSILAB微生物分型系統(tǒng)，用戶可以創(chuàng)建自己的Rep-PCR數(shù)據(jù)庫(kù)，適用于特定時(shí)間少量菌株的爆發(fā)調(diào)查，整個(gè)流程可在幾小時(shí)內(nèi)完成[44]。

2.4 低頻限制性切割位點(diǎn)PCR

低頻限制性切割位點(diǎn)PCR（Infrequent restriction site PCR, IRS-PCR）是Mazurek等[45]于1996年報(bào)道的一種細(xì)菌分型技術(shù)。其溯源原理如圖2所示，主要通過(guò)兩種頻率不同的限制性內(nèi)切酶（RE1和RE2）對(duì)細(xì)菌DNA進(jìn)行酶切，產(chǎn)生大小不同的非互補(bǔ)DNA片段，在連接酶（ad1和ad2）的作用下在DNA片段兩端各加一段連接體，以帶有連接體的DNA雙鏈為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。常用的高頻率限制性內(nèi)切酶有HhaI、TaqI等，低頻率限制性內(nèi)切酶有XbaI、SmaI等，酶切后的DNA粘性末端與連接體互補(bǔ)。反應(yīng)前構(gòu)建五條寡核苷酸鏈（AH1、AH2、AX1、AX2、PX），連接體由兩條寡核苷酸鏈退火形成。例如經(jīng)HhaI酶切端的連接體由AH1-AH2退火形成，AH1與PX互補(bǔ)同時(shí)作為模板DNA擴(kuò)增的引物，在PX的3'端加一個(gè)額外的堿基合成PX-A、PX-T、PX-C、PX-G，以此防止引物二聚體的出現(xiàn)[46]，根據(jù)XbaI相鄰位點(diǎn)的下一個(gè)堿基選擇對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。IRS-PCR的主要優(yōu)勢(shì)在于在保持相同實(shí)驗(yàn)條件（酶、引物、接頭和擴(kuò)增條件）的情況下，可以應(yīng)用于多種細(xì)菌微生物，并且僅需少量DNA樣本[47]。此外IRS-PCR還具有良好的可重復(fù)性。Garaizar等[48]應(yīng)用IRS-PCR與PFGE對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌進(jìn)行分型對(duì)比，發(fā)現(xiàn)IRS-PCR技術(shù)的可重復(fù)性達(dá)到了100%，但分辨率較低。Su等[49]得到的研究結(jié)果與其相似，當(dāng)將兩種分型方法結(jié)合在一起時(shí)，可以獲得更好的分型效果。盡管IRS-PCR分辨率略低，但其操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少，可作為食源性致病菌大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的方法之一。

2.5 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）與IRS-PCR原理類似（如圖3所示），都是通過(guò)兩種不同頻率的限制性內(nèi)切酶對(duì)待測(cè)樣本DNA進(jìn)行酶切，隨后在酶切片段兩端加上人工接頭，構(gòu)成PCR反應(yīng)中的模板DNA，在特異性引物的作用下對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。然而與IRS-PCR方法不同的是，AFLP接頭由核心序列與酶特異性識(shí)別序列組成，接頭與限制性內(nèi)切酶酶切過(guò)程中產(chǎn)生的5′或3′端同源，因?yàn)榻宇^序列中的堿基發(fā)生改變，使得當(dāng)接頭與DNA片段連接后，酶切位點(diǎn)不會(huì)恢復(fù)原有雙鏈[50]。引物根據(jù)核心序列、酶特異性序列和選擇性延伸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并且在3′端增加選擇性核苷酸，使得在嚴(yán)格的退火條件下，選擇性引物只擴(kuò)增酶切位點(diǎn)以外的互補(bǔ)核苷酸片段，從而降低了混合物的復(fù)雜性[51]。

AFLP最早被用于植物學(xué)方面的研究，經(jīng)過(guò)發(fā)展，目前已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)領(lǐng)域[52]。AFLP是一種經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單并且結(jié)果可靠的方法，對(duì)于實(shí)驗(yàn)儀器的要求較低，適用于中小型實(shí)驗(yàn)室。其改良方法對(duì)于特定菌株（例如彎曲桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌）的分型效果很好[53-54]。Alter等[55]使用AFLP實(shí)現(xiàn)了對(duì)火雞屠宰過(guò)程中空腸彎曲菌的有效監(jiān)測(cè)。AFLP的缺點(diǎn)是對(duì)于DNA的純度、酶的選擇以及接頭的設(shè)計(jì)要求較高，并且有時(shí)無(wú)法直觀地通過(guò)電泳圖對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定，需要通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)一步分析。另外AFLP對(duì)于菌株的分辨力與其它分子分型方法相比較低，但能滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)于菌種的一般分型要求[56-57]。

圖 3 AFLP溯源原理圖[47]Fig.3 Schematic diagram of AFLP[47]

圖 4 MALDI-TOF-MS分型流程圖[78]Fig.4 Typing flow chart of MALDI-TOF-MS[78]

2.6 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）是一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的特定限制性位點(diǎn)切割，獲得分型所需要的不同長(zhǎng)度的DNA片段，與PCR反應(yīng)結(jié)合可對(duì)食源性致病菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確分型。該方法關(guān)鍵點(diǎn)在于限制性內(nèi)切酶的選擇，不同內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)不同，其鑒定效果也會(huì)有所影響[58]。這也是該方法所存在的弊端，對(duì)引物的正確選擇、設(shè)計(jì)以及酶的要求較高[59]，同時(shí)對(duì)于相同種類的細(xì)菌目前還沒(méi)有統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)方案，因此結(jié)果不利于不同實(shí)驗(yàn)室之間的比較。但該方法具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性的分析[60]。Tabar等[61]使用RFLP分型技術(shù)比較從不同宿主（火雞和肉雞）中分離出的空腸彎曲桿菌的遺傳多樣性和差異，結(jié)果清晰地顯示，在RFLP分型模式下，空腸彎曲菌的分布隨宿主物種的不同而不同，使用該方法可以幫助我們有效的尋找空腸彎曲菌局部爆發(fā)感染源的線索。此外RFLP-PCR還具有準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。Conesa等[62]確定了RFLP對(duì)于金黃色葡萄球菌分型的適用性，并且發(fā)現(xiàn)不同引物對(duì)于RFLP-PCR分型效果具有一定影響。

3 基于測(cè)序技術(shù)的分型方法

3.1 多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是由多位點(diǎn)酶電泳技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一種基于DNA序列分析的分型技術(shù)。通過(guò)對(duì)細(xì)菌管家基因（一般為5～7個(gè)）的特定核苷酸片段進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的等位基因序列進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)菌株的序列型（Sequence type，ST）。進(jìn)行eBURST（Enhanced analysis based on related sequence types）分析可對(duì)菌株間的親緣關(guān)系進(jìn)行清晰解讀。

MLST主要優(yōu)點(diǎn)在于其出色的重復(fù)性以及數(shù)據(jù)的可傳播性，可以在全球范圍內(nèi)進(jìn)行比較分析，對(duì)于食源性疾病的溯源分析具有重大意義，已被廣泛應(yīng)用于食源性疾病的爆發(fā)調(diào)查。Tchatchouang等[63]使用MLST方法對(duì)2017年南非爆發(fā)的李斯特菌病進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，確定了流行菌株的主要ST型，并對(duì)爆發(fā)源頭成功追蹤。Li等[64]在北京爆發(fā)的一起急性胃腸炎事件中，使用MLST與PFGE確定了爆發(fā)源自一組高度克隆的大腸桿菌。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序時(shí)間與成本不斷降低，MLST技術(shù)越來(lái)越多地被應(yīng)用。但該方法仍然存在一些弊端，例如對(duì)不同菌株之間的分辨率較低[65]，適合長(zhǎng)期的大范圍的流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)于疾病爆發(fā)初期，MLST并不適用[66]。另外，由于該方法是根據(jù)管家基因的特定核苷酸序列進(jìn)行分析，隨著菌株的遺傳進(jìn)化，堿基會(huì)發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致不同菌株之間的分辨率下降[67]。

3.2 核心基因組多位點(diǎn)序列分型

核心基因組多位點(diǎn)序列分型（Core-genome MLST，cgMLST）是在MLST基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種細(xì)菌分型技術(shù)，保留了傳統(tǒng)MLST方法的直觀特性，同時(shí)又具有更高的分辨力。cgMLST通過(guò)分析細(xì)菌全基因組序列中的所有核心基因位點(diǎn)，比較不同細(xì)菌基因組間各等位基因的差異，以基因?yàn)閱卧M(jìn)行分型[68]。這就使得在分析過(guò)程中，更不容易受到基因組中堿基的缺失和其它突變的影響，通過(guò)對(duì)耐藥基因分析，可進(jìn)一步預(yù)測(cè)目的菌株的耐藥情況，為臨床決策提供依據(jù)[69]。當(dāng)用戶準(zhǔn)備對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定分型時(shí)，首先需要對(duì)其DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，這就導(dǎo)致其費(fèi)用相比于MLST要略高，但隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，該方法具有很好的應(yīng)用前景。因?yàn)槠渚哂幸惶鬃陨愍?dú)特的標(biāo)準(zhǔn)命名方法，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)交換，在食源性致病菌的流行病學(xué)分析上應(yīng)用廣泛。

Hsu等[70]開(kāi)發(fā)了一種包含1343個(gè)基因的空腸彎曲菌cgMLST分型方案，結(jié)果與傳統(tǒng)的MLST有很強(qiáng)的相關(guān)性，對(duì)其中的耐藥基因分析，不僅提供了更高的分辨率，同時(shí)還揭示了不同宿主之間的抗生素耐藥趨勢(shì)，對(duì)空腸彎曲菌的預(yù)防具有重要意義。Cody等[71]建立的cgMLST分型方案，除了可以對(duì)不同菌株進(jìn)行快速有效的鑒定外，還能識(shí)別出同一來(lái)源親緣關(guān)系接近的菌株。目前在世界范圍內(nèi)對(duì)沙門(mén)氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌都已建立了cgMLST分型方案，相信隨著技術(shù)的發(fā)展，該方法有望成為細(xì)菌流行病學(xué)研究的主流分析方案。

3.3 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性（Single-nucleotide polymorphism，SNP）在基因組中分布廣泛，根據(jù)其所在區(qū)域的不同分為兩類：一類分布在基因編碼區(qū)（Coding region），也叫cSNP，位于該區(qū)域的SNP可能導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變；另一類則是分布在基因的非編碼區(qū)。SNP是指基因組中單個(gè)堿基發(fā)生突變，所導(dǎo)致的基因位點(diǎn)多樣性。理論上這種突變可以是堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、缺失或插入，但在實(shí)際情況中發(fā)生的只有堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，因此一般將SNP作為二等位基因多態(tài)。雖然SNP在單個(gè)基因位點(diǎn)的多樣性較少，但由于其在基因組中的廣泛存在，通過(guò)對(duì)細(xì)菌全基因組序列中的SNP進(jìn)行分析，可以對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，并且分辨率很高[72]。與所有流行病學(xué)分析一樣，要實(shí)現(xiàn)基于全基因組測(cè)序方法的全部潛力，需要理解并處理與數(shù)據(jù)生成和分析的基本步驟有關(guān)的問(wèn)題[73]。在實(shí)際應(yīng)用中，并不需要對(duì)細(xì)菌基因組的全部SNP分析，一般選取部分特殊位點(diǎn)進(jìn)行分析即可對(duì)待測(cè)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確分型，適用于不同地理來(lái)源的菌株的遺傳多樣性及進(jìn)化關(guān)系分析[74]。

作為全基因組序列分型的一種，SNP分型方法具有很高的分辨率。Guo等[75]使用SNP方法對(duì)經(jīng)過(guò)MLST鑒定為同一ST型的不同菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，32個(gè)菌株又形成了五個(gè)簇和五個(gè)單個(gè)分離株。Kuroda等[76]建立了一種基于80個(gè)SNP位點(diǎn)分型方法，可對(duì)蠟樣芽孢桿菌群中的炭疽芽孢桿菌進(jìn)行有效分型，其中4個(gè)之前使用多位點(diǎn)酶電泳方法無(wú)法區(qū)分的分離株，顯示出了明顯差異。使用SNP與分離時(shí)間和地理位置相結(jié)合的方法可對(duì)食源性致病菌更好的分型，因?yàn)樗哂械目勺匪菪裕蟠筇岣吡藢?duì)食源性病原體監(jiān)視的成功率，這一點(diǎn)對(duì)于公共衛(wèi)生的保護(hù)十分重要。Liu等[74]根據(jù)不同地區(qū)菌株的SNP信息建立了一種大腸桿菌溯源分型方法，可用于調(diào)查食品中大腸桿菌的地理來(lái)源，揭示了菌株之間的親緣關(guān)系。

4 基于細(xì)菌代謝產(chǎn)物的分型方法

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）通過(guò)比較細(xì)菌本身特有蛋白質(zhì)及其分子量的大小進(jìn)行鑒定，在微生物鑒定方面被認(rèn)為是一項(xiàng)具有革新微生物鑒定能力的技術(shù)[77]。其分型原理如圖4所示。盡管細(xì)菌核糖體蛋白的氨基酸序列是高度保守的，但即使在亞種水平也會(huì)發(fā)生微量變化，在電場(chǎng)作用下不同質(zhì)量的離子形成可用于細(xì)菌分類和鑒定的特定指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知參考圖譜進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)菌株的快速鑒定[78]。常用的數(shù)據(jù)庫(kù)有MALDI Biotyper、SARAMIS以及VITEK MS等。目前MALDI-TOF-MS已被用于許多細(xì)菌病原體的分型，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌、單增李斯特菌、流感嗜血桿菌等[79]。此外MALDI-TOF-MS對(duì)于耐藥性細(xì)菌的鑒定也有很好的敏感性。Steensels等[80]使用MALDITOF-MS與PFGE對(duì)從醫(yī)院分離出的15株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法具有很好的一致性（93%）。但MALDI-TOF-MS沒(méi)有通用的培養(yǎng)條件和樣品制備方案，數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考細(xì)菌圖譜受這些條件的影響而改變，這就導(dǎo)致其可重復(fù)性略顯不足，不適用于對(duì)食源性致病菌的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)[81]。另外，數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容的豐度是影響分型結(jié)果的重要因素。Bizzini等[82]在分析MALDI-TOF-MS與常規(guī)鑒定結(jié)果不一致的原因中發(fā)現(xiàn)，大部分錯(cuò)誤鑒定是由于對(duì)應(yīng)菌種的參考圖譜過(guò)少導(dǎo)致。

對(duì)于某種方法分型溯源能力的判斷一般從該方法的分辨率、可重復(fù)性、耗時(shí)長(zhǎng)短等幾方面評(píng)估，上述幾種方法的分型能力比較及適用范圍見(jiàn)表2。

表2 不同分型方法的技術(shù)特點(diǎn)Table 2 Technical characteristics of different typing methods

5 總結(jié)與展望

本文對(duì)幾種常用食源性致病菌溯源分型方法進(jìn)行比較分析。基于生理生化反應(yīng)的表型分型結(jié)果直觀準(zhǔn)確，并且血清分型結(jié)果與食源性疾病關(guān)系密切，血清型的確定有利于臨床疾病的治療，雖然此類方法操作繁瑣并且分辨率較低，但目前開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)儀器已經(jīng)在一定程度上彌補(bǔ)了這方面的不足，隨著儀器分析靈敏度的提高，分型效率會(huì)大大增強(qiáng)。以酶切片段為依據(jù)的分子分型方法具有快速、準(zhǔn)確及較高分辨率的特點(diǎn)，在食源性致病菌流行病學(xué)分析方面應(yīng)用廣泛，但此類技術(shù)結(jié)果受人員操作及實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響較大，并且部分分型方法沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的分型方案，使得各實(shí)驗(yàn)室之間很難進(jìn)行交流分析，而解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵要對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)（酶的選擇、時(shí)間控制、引物的篩選、電泳條件等）進(jìn)行優(yōu)化分析，尋找最佳方案。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及生物信息學(xué)知識(shí)的普及，基于全基因組序列的分型方法表現(xiàn)出的高分辨力及數(shù)據(jù)的可傳播能力，在食源性致病菌溯源分析及流行病學(xué)監(jiān)控方面有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。但與此同時(shí)，全基因組數(shù)據(jù)的分析與處理成為了溯源分型的關(guān)鍵，其中包括原始數(shù)據(jù)的處理、全基因組信息的挖掘、數(shù)據(jù)庫(kù)的完善等，這就要求具有完備的生物信息學(xué)相關(guān)軟件及標(biāo)準(zhǔn)的分析流程。而隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，MALDITOF-MS作為一種新興的分型方法可配合其它分型方法實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的快速診斷。食源性致病菌的監(jiān)控包括預(yù)防、爆發(fā)和流行病學(xué)分析三個(gè)階段，每個(gè)階段對(duì)于分型方法的要求不同，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件及應(yīng)用情況選擇最佳分型方案，從而對(duì)食源性致病菌進(jìn)行更加合理有效的監(jiān)管。目前食源性疾病的爆發(fā)已經(jīng)呈全球化趨勢(shì)，未來(lái)食源性致病菌的溯源分析一定會(huì)趨于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，在具有合適分型依據(jù)的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)流程的可標(biāo)準(zhǔn)化以及數(shù)據(jù)的可視化程度和可傳播性對(duì)于溯源分型技術(shù)極其重要。