熒光納米材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用進(jìn)展

關(guān)樺楠，王丹丹，孫冰玉，吳永存，張 悅

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150028）

熒光納米粒子是指可發(fā)出熒光的半導(dǎo)體納米微晶體或?qū)晒鈭F(tuán)通過(guò)各種方式引入有機(jī)或無(wú)機(jī)納米粒子中，并讓納米粒子承擔(dān)有機(jī)小分子熒光染料的檢測(cè)、標(biāo)記等功能[1]。熒光納米材料由熒光納米粒子組成，由于部分熒光納米材料具有熒光特性和模擬酶活性，成為近年來(lái)科學(xué)工作者廣泛研究的對(duì)象。

熒光納米粒子作為模擬酶材料不僅克服了天然酶制備繁瑣、苛刻條件下變性率高、純化和保存過(guò)程成本高等眾多缺陷[2]，還具有低毒性、易制備、高穩(wěn)定性以及良好的生物相容性等優(yōu)勢(shì)，因此成為近年來(lái)模擬酶領(lǐng)域中最具潛力的納米材料。此外，由于熒光納米材料獨(dú)特的熒光特性，部分熒光納米材料在作為模擬酶催化物質(zhì)的同時(shí)發(fā)生熒光強(qiáng)度的改變，從而達(dá)到物質(zhì)檢測(cè)的目的，所以熒光納米材料在生化分析領(lǐng)域中顯示出巨大的潛力。

本文綜述了熒光納米材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用進(jìn)展，旨在為更好地研究開(kāi)發(fā)及利用新型熒光納米模擬酶材料，為新型熒光納米模擬酶的性能優(yōu)化及拓寬應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 熒光碳納米材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用

熒光納米模擬酶材料中的碳基質(zhì)納米材料如氧化石墨烯[3]、碳納米管[4]、碳量子點(diǎn)[5]和石墨烯量子點(diǎn)[6]等具有過(guò)氧化物酶或超氧化物歧化酶活性。它們具有低細(xì)胞毒性、優(yōu)異的生物相容性、高表面積、高底物特異性、高光穩(wěn)定性和獨(dú)特的激發(fā)依賴熒光性質(zhì)[7-10]。因此，熒光碳納米材料通常以模擬酶或生物傳感器的方式廣泛應(yīng)用于食品[11]、生物[12]、醫(yī)藥[13]、環(huán)境[14]等方面。

1.1 H2O2的檢測(cè)

過(guò)氧化氫（H2O2）作為一種活性物質(zhì)，是生命系統(tǒng)中的重要代謝產(chǎn)物。它被認(rèn)為是氧化應(yīng)激和生理活性的信號(hào)分子和生物標(biāo)志物[15]。人體內(nèi)的眾多代謝產(chǎn)物都可以通過(guò)相應(yīng)的酶催化反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物H2O2。因此，開(kāi)發(fā)有效的H2O2檢測(cè)方法具有重要的價(jià)值和意義。

REN等[16]將可再生海洋廢棄物生物質(zhì)滸苔利用簡(jiǎn)單煅燒的方法綠色合成了具有類氧化酶、類過(guò)氧化物酶性質(zhì)和熒光性質(zhì)的分級(jí)多孔碳（EPC）。基于其氧化酶模擬活性，開(kāi)發(fā)了H2O2熒光生物傳感器，由于熒光指示劑巰基乙酸（thioglycolicacid,TA）在羥基存在的條件下轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光的HTA，所以向EPC-TA體系中加入H2O2，整個(gè)體系熒光強(qiáng)度隨著H2O2濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，不僅驗(yàn)證了EPC的過(guò)氧化物酶活性，還實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的檢測(cè)。該研究首次報(bào)道熒光碳納米材料表現(xiàn)出優(yōu)異的雙重模擬酶活性，為熒光生物傳感應(yīng)用開(kāi)辟了一個(gè)新的道路，為海洋食品樣品中H2O2的檢測(cè)、納米醫(yī)學(xué)、工業(yè)催化和環(huán)境工程等領(lǐng)域開(kāi)辟了新的途徑。

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是碳納米材料之一，由于其特殊的光學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，在生物分子檢測(cè)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的分析性能。SIDDIQUI等[17]通過(guò)GO摻雜硫原子使GO表面改性，相鄰的碳原子被激活，并在GO的晶格網(wǎng)絡(luò)中引起活性邊緣和結(jié)構(gòu)缺陷，然后增強(qiáng)催化活性和化學(xué)特性。硫摻雜氧化石墨烯（sulfur doped graphene oxide，SGO）由于其良好的吸附和催化能力，可與羅丹明B染料（Rhd-B）和H2O2相互作用。加入H2O2后，羥基自由基的產(chǎn)生淬滅了電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物Rhd-B+SGO的熒光。SGO的表面形態(tài)和化學(xué)性質(zhì)都有助于該方法的猝滅效率和靈敏度。因此利用SGO的高結(jié)合親和力和淬滅能力，提出了一種高度靈敏和選擇性的H2O2檢測(cè)方法。SGO的低成本、易合成和穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)，將促進(jìn)和激發(fā)SGO催化劑在表面科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中更加廣闊的應(yīng)用前景。

1.2 膽固醇的檢測(cè)

膽固醇（cholest-5-en-3β-ol）及其酯衍生物是所有動(dòng)物細(xì)胞膜中必需的結(jié)構(gòu)成分之一，是類固醇激素、膽汁酸和維生素D形成的主要前體[18]。高膽固醇血癥是心臟驟停、冠心病和其他心血管疾病的主要原因[19]。所以，對(duì)膽固醇的檢測(cè)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

HASSANZADEH等[20]將葡糖糖粉末以熱裂解的方法簡(jiǎn)單快速地制備了石墨烯量子點(diǎn)（GQDs），通過(guò)熱處理二硫化鉬納米片獲得二硫化鉬量子點(diǎn)（MoS2QDs），基于MoS2QDs和GQDs的協(xié)同過(guò)氧化物酶活性，引入了一種簡(jiǎn)單并具有選擇性的熒光探針的方法檢測(cè)膽固醇；膽固醇在發(fā)生酶促氧化后會(huì)產(chǎn)生H2O2，將MoS2QDs和GQDs以3:2的比例混合，向其中加入堿性羅丹明B和膽固醇氧化后得到的H2O2，在1.5～460 nmol·L-1范圍內(nèi)，體系熒光強(qiáng)度隨H2O2濃度的增加而增強(qiáng)，并且呈線性關(guān)系，基于該方法用于膽固醇的間接測(cè)定，成功地分析了人血清樣品中游離膽固醇和總膽固醇的含量。

ARYAL等[21]將碳納米管（CNT）、熱還原氧化石墨（TRGO）和CNT-TRGO用對(duì)磺酸鹽[4]芳烴（SC4）進(jìn)行官能化，然后在羅丹明6G（R6G）存在下研究膽固醇的熒光檢測(cè)；所有復(fù)合材料（SC4-碳納米管、SC4-TRGO和SC4-碳納米管-TRGO）都顯示出在沒(méi)有膽固醇的情況下R6G熒光強(qiáng)度的有效猝滅，但是熒光強(qiáng)度隨著膽固醇的加入而顯著增加，原因可能是熒光分子R6G占據(jù)SC4主體分子的吸附位點(diǎn)空穴，使R6G的特征熒光將由于電荷和能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)而被猝滅；在膽固醇存在的情況下，SC4宿主位點(diǎn)將被膽固醇占據(jù)，然后R6G從SC4宿主腔中釋放出來(lái)，因此恢復(fù)R6G的熒光強(qiáng)度。這項(xiàng)工作為水溶性芳烴衍生物在其他生物分子如色氨酸、酪氨酸和組氨酸的熒光檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用指明了方向。

2 熒光金屬納米材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用

金屬納米團(tuán)簇由于其易于合成、低成本、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注[22]。與廣泛研究的貴金屬納米團(tuán)簇（如銀納米團(tuán)簇和金納米團(tuán)簇）相比，銅納米團(tuán)簇等顯示出獨(dú)特的光致發(fā)光特性、低毒性和便于表面功能化的特點(diǎn)，并且由于相對(duì)豐富和廉價(jià)的制備前體而更加便宜[23]。本文主要介紹熒光金屬納米材料作為模擬酶用于物質(zhì)檢測(cè)和酶活性驗(yàn)證。

2.1 H2O2的檢測(cè)

金納米團(tuán)簇因其易于合成、生物相容性、有限的光漂白和明亮的熒光特性而受到廣泛研究。JAIN等[24]利用合成的牛血清白蛋白-抗體修飾的金納米團(tuán)簇固有熒光檢測(cè)人肝細(xì)胞（WRL-68）中的H2O2，結(jié)果表明，牛血清白蛋白納米粒呈現(xiàn)鮮紅色熒光，牛血清白蛋白納米粒催化過(guò)氧化氫降解為水和分子氧，類似于過(guò)氧化氫酶，因此H2O2的暴露導(dǎo)致納米團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度顯著降低，基于此檢測(cè)H2O2。此外，這些納米團(tuán)簇是高度生物相容的，并且在人類肝細(xì)胞中被主動(dòng)內(nèi)化。盡管已開(kāi)發(fā)的牛血清白蛋白納米粒在細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)異的H2O2傳感能力，但還需要更多的研究來(lái)實(shí)現(xiàn)它們的快速攝取、在細(xì)胞質(zhì)中的長(zhǎng)時(shí)間停留以及對(duì)單個(gè)自由基暴露的反應(yīng)。

FENG等[25]的研究利用四氧化三鐵磁性納米顆粒（Fe3O4MNPs）自身的類過(guò)氧化物酶性質(zhì)，建立了以苯甲酸（BA）為指標(biāo)的過(guò)氧化氫熒光測(cè)定方法。以共沉淀法制備的Fe3O4MNPs為過(guò)氧化物模擬酶，弱熒光BA可被Fe3O4MNPs所氧化，形成強(qiáng)熒光的羥基苯甲酸，產(chǎn)物羥基苯甲酸的熒光強(qiáng)度（Ex294nm，Em411nm）與過(guò)氧化氫的濃度成正比。在優(yōu)化的條件下，該系統(tǒng)線性范圍為0.5～12.5 μmol/L，檢出限為0.122 μmol/L，樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.86%（n=6）；實(shí)際樣品檢測(cè)中，一次性筷子中H2O2的平均含量為（2.321±0.32） mg/kg。以Fe3O4MNPs為模擬酶的熒光檢測(cè)法具有良好的重復(fù)性、精密度和回收率，可用于各種樣品中痕量H2O2的檢測(cè)。因此該H2O2測(cè)定方法在食品[26]和農(nóng)業(yè)[27]中具有很大的價(jià)值。

2.2 葡萄糖的檢測(cè)

血糖水平通常作為糖尿病的臨床指標(biāo)[28]。檢測(cè)血液中以及食品中的葡萄糖存在諸多方法如熒光分析法[29]、比色法[30-31]和電化學(xué)法[32]等。在這些方法中，熒光分析法因其操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、成本低而備受關(guān)注。

現(xiàn)如今，由于很難控制反應(yīng)物中金屬鹽前驅(qū)體的還原和成核過(guò)程，大多數(shù)金屬納米材料的合成都需要非常嚴(yán)格的條件，NIE等[33]通過(guò)一種簡(jiǎn)單的方法直接在水溶液中一步合成了PdCuAu納米粒子（PdCuAu NPs），合成的PdCuAu NPs具有優(yōu)異的溫度傳感器性質(zhì)和過(guò)氧化物模擬酶的催化性能。由于其獨(dú)特的熒光性質(zhì)，其熒光強(qiáng)度與溫度變化（4～95 ℃）具有良好的線性關(guān)系及靈敏度，可用于生物環(huán)境的熱成像?；谄溥^(guò)氧化物酶樣性質(zhì)，可利用比色法檢測(cè)H2O2和葡萄糖。該方法簡(jiǎn)單、快速，為H2O2和葡萄糖的檢測(cè)開(kāi)辟了新的道路，同時(shí)，這種基于PdCuAu NPs的傳感器在生物化學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

銀納米粒子（AgNPs）作為典型的金屬納米粒子，具有特征性的表面等離子體共振和高消光系數(shù)，銀納米粒子的結(jié)構(gòu)可以被H2O2破壞，PCN-224作為一種基于卟啉的金屬框架，由于其較大的開(kāi)放通道、良好的生物相容性、優(yōu)異的生理穩(wěn)定性和潛在的催化活性中心而被DU等[34]選擇作為銀納米粒子的載體，通過(guò)酶催化反應(yīng)高特異性和靈敏度檢測(cè)H2O2。AgNPs既可以淬滅PCN-224的熒光，又充當(dāng)H2O2識(shí)別劑。由于葡萄糖氧化過(guò)程中產(chǎn)生H2O2，AgNPs模擬過(guò)氧化物酶與H2O2反應(yīng)，可以有效地蝕刻成銀離子并從PCN-224中釋放出來(lái)，從而恢復(fù)PCN-224的熒光。此傳感平臺(tái)被進(jìn)一步擴(kuò)展到監(jiān)測(cè)人血清樣本中的葡萄糖，表明其在診斷目的方面具有良好的潛力。

2.3 堿性磷酸酶的檢測(cè)

堿性磷酸酶（ALP）是蛋白質(zhì)、核酸和其他小分子磷酸鹽代謝的關(guān)鍵水解酶，廣泛分布于哺乳動(dòng)物體液和組織中，堿性磷酸酶在不同的生物過(guò)程中起著重要的作用。然而，堿性磷酸酶的異常水平通常與引發(fā)多種疾病，如肝功能障礙、骨病、癌癥和糖尿病[35]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、高靈敏度的ALP檢測(cè)方法。

NI等[36]利用牛血清白蛋白結(jié)合的金納米團(tuán)簇（BSA-AuNCs），基于其過(guò)氧化物酶活性和熒光特性，建立了一種比色和熒光雙通道檢測(cè)ALP活性的方法。BSA-AuNCs能夠催化H2O2將無(wú)色TMB氧化為藍(lán)色的ox-TMB，同時(shí)導(dǎo)致BSA-AuNCs的熒光猝滅?？箟难崾怯葾LP催化L-抗壞血酸-2-磷酸水解得到的，能抑制TMB的氧化，從而誘導(dǎo)ox-TMB的脫色和BSA-AuNCs的熒光恢復(fù)（如圖1）。比色法和熒光法的檢測(cè)限分別可達(dá)0.26和0.16 mUmL-1。此外，該方法已成功應(yīng)用于人血清樣品中ALP的檢測(cè)。該方法不僅為簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)ALP活性提供了新思路，而且拓寬了BSA-AuNCs在生物分析中的應(yīng)用。

2.4 膽固醇的檢測(cè)

GUAN等[37]通過(guò)自組裝的方式制備金納米粒子，該金納米粒子可以通過(guò)H2O2催化氧化ABTS產(chǎn)生綠色產(chǎn)物，結(jié)合膽固醇氧化酶與膽固醇反應(yīng)生成H2O2的原理實(shí)現(xiàn)膽固醇的檢測(cè)。結(jié)果表明，合成的金納米粒子對(duì)膽固醇具有良好的選擇性和抗干擾性，并成功應(yīng)用于雞蛋樣品中膽固醇的檢測(cè)。

3 多功能納米復(fù)合材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用

3.1 H2O2的檢測(cè)

PRATSINIS等[38]制備了具有獨(dú)特的熒光性質(zhì)和過(guò)氧化物酶活性的Eu3+摻雜的氧化鈰納米粒子在研究其模擬過(guò)氧化氫酶的抗氧化活性時(shí)，表現(xiàn)為水溶液中H2O2的催化分解，H2O2中的活性氧與氧化鈰納米顆粒表面的活性位點(diǎn)發(fā)生強(qiáng)相互作用，使納米顆粒發(fā)生顯著的熒光淬滅，從而測(cè)定了H2O2的濃度，該檢測(cè)體系的靈敏度低至0.15 μmol/L。基于多功能納米復(fù)合材料可進(jìn)行復(fù)雜的體外試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病生物標(biāo)志物的高靈敏度檢測(cè)。此方法為H2O2的檢測(cè)提供了新的思路。

MATHIVANAN等[39]合成了具有熒光性質(zhì)的雙發(fā)射氮/鋅摻雜碳點(diǎn)（N/Zn-CDs）對(duì)H2O2進(jìn)行檢測(cè)，在不同濃度范圍的H2O2存在下，測(cè)量了合成的N/Zn-CDs的熒光響應(yīng)，結(jié)果表明，當(dāng)H2O2濃度增加時(shí)，N/Zn-CDs發(fā)生顯著的熒光淬滅，熒光信號(hào)的強(qiáng)度逐漸降低，并在H2O2不同濃度范圍（1～3 μmol/L）顯示良好的線性關(guān)系，H2O2的檢出限為0.27 μmol/L。雙發(fā)射復(fù)合碳點(diǎn)作為模擬酶和熒光探針傳感系統(tǒng)，為實(shí)際樣品中H2O2的檢測(cè)提供了新的平臺(tái)。

3.2 葡萄糖的檢測(cè)

近年來(lái)，人們探索出許多方法來(lái)高精度地測(cè)定葡萄糖濃度，其中，比色和熒光法因其簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、便于攜帶和可顏色識(shí)別而引起了極大的關(guān)注。另一方面，許多研究是基于單信號(hào)測(cè)定（比色測(cè)定或熒光測(cè)定），單個(gè)信號(hào)測(cè)定可能會(huì)受到外部條件的影響，因此，需要一種雙信號(hào)檢測(cè)葡萄糖的方法。

YEN等[40]開(kāi)發(fā)了基于比色和熒光法的雙傳感器，將合成的具有類過(guò)氧化物酶活性的氮摻雜碳點(diǎn)金屬氧化物雜化物（MFNCDs），用于定量測(cè)定H2O2和葡萄糖的濃度，基于比色法的H2O2和葡萄糖的檢測(cè)限分別低至84 nmol/L和0.41 μmol/L。相比之下，在H2O2的存在下，通過(guò)內(nèi)過(guò)濾效應(yīng)（IFE）和系統(tǒng)中各元件之間的電子轉(zhuǎn)移，MFNCDs/TMB在405 nm處的熒光被淬滅。利用上述特性，開(kāi)發(fā)了基于比色和熒光方法的雙傳感器，用于定量測(cè)定H2O2和葡萄糖的濃度?；跓晒夥椒ǖ腍2O2和葡萄糖的檢測(cè)限分別低至97 nmol/L和0.85 μmol/L。此外，這種雙傳感器可用于檢測(cè)真實(shí)血清中的葡萄糖，結(jié)果非常準(zhǔn)確，該雙傳感體系檢測(cè)方法克服了傳統(tǒng)單因素檢測(cè)物質(zhì)對(duì)環(huán)境條件要求高的缺陷，并且還具有較高的靈敏度及選擇性是生物傳感器應(yīng)用的良好選擇。

3.3 尿酸的檢測(cè)

尿酸（Uric acid，UA）是人體內(nèi)必不可少的生物分子，也是嘌呤的最終代謝產(chǎn)物[41]。到目前為止，已經(jīng)建立了幾種檢測(cè)尿酸的分析技術(shù)，包括電化學(xué)檢測(cè)[42]、熒光光譜法[43]、毛細(xì)管電泳[44]、高效液相色譜法[45]、比色法[46]。已經(jīng)證明，血清中尿酸濃度過(guò)高與許多代謝紊亂密切相關(guān)。極低濃度的尿酸會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激或多發(fā)性硬化等癥狀。因此，尿酸的定量檢測(cè)顯得尤為必要。

XIAO等[47]使用唯一的前體3-APBA·H2O作為氮、碳和硼源通過(guò)水熱法合成B,N-CDs，基于銀納米簇和CDs獨(dú)特的熒光性質(zhì)，將B,N-CDs和ZnFe2O4磁性微球結(jié)合構(gòu)建了比色和熒光比率的雙重讀出傳感器，該傳感器以ZnFe2O4磁性微球?yàn)檫^(guò)氧化物酶模擬物，在H2O2存在下催化氧化鄰苯二胺（OPD），生成典型的黃色物質(zhì)（oxOPD），oxOPD可以通過(guò)內(nèi)濾光效應(yīng)顯著淬滅B,N-CDs在430 nm處的熒光，并在556 nm處產(chǎn)生新的熒光發(fā)射峰（如圖2）。因此，熒光強(qiáng)度比（I556/I430）可用于定量分析H2O2和H2O2相關(guān)代謝物即葡萄糖和尿酸的濃度?；谌芤侯伾兓部捎糜诖_定H2O2、葡萄糖和UA水平?；诒壬珯z測(cè)的H2O2、葡萄糖和UA的檢測(cè)限分別為0.09、0.9和0.9 μmol/L，使用比率熒光檢測(cè)的檢測(cè)限分別為0.1、8和1 μmol/L。此外，該策略還可以檢測(cè)人血清中的葡萄糖和尿酸。該方法在H2O2及相關(guān)代謝物檢測(cè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.4 有機(jī)化合物的檢測(cè)

鄰苯二胺（OPD）是一種重要的化學(xué)中間體，也是許多雜環(huán)化合物的前體。此外，OPD的工業(yè)用途非常廣泛，特別是制造農(nóng)藥、感光資源、聚合物、染料等[48]。在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大量OPD可能會(huì)影響消化系統(tǒng)和呼吸功能，有時(shí)還可能容易致癌。OPD的快速準(zhǔn)確測(cè)定是生物分析、食品安全和環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域的重要任務(wù)之一。

MATHIVANAN等[39]首次用甘氨酸、氯化膽堿和尿素合成了氮/氯摻雜碳點(diǎn)（N/Cl-CDs）；同時(shí)，以乙二胺四乙酸二鈉鋅鹽和抗壞血酸為前驅(qū)體，合成了氮/鋅摻雜碳點(diǎn)（N/Zn-CDs）；合成的CDs被用作模擬酶和熒光探針，該雙碳點(diǎn)體系用于識(shí)別OPD和H2O2；N/Cl-CDs由于其過(guò)氧化物酶活性，在H2O2存在下氧化無(wú)色的OPD生成黃色的2，3-二氨基吩嗪（DAP）。隨后，生成的DAP猝滅了N/Zn-CDs的熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)OPD以及H2O2的檢測(cè)（如圖3）。該雙碳點(diǎn)體系展示出碳點(diǎn)功能的多樣性，為碳點(diǎn)的后續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

對(duì)苯二酚是一種苯的兩個(gè)對(duì)位氫被羥基取代形成的有機(jī)化合物，分子式為C6H6O2，為白色結(jié)晶，又叫氫醌（H2Q），是一種劇毒有機(jī)化合物，主要應(yīng)用于各種染料的制備以及許多大規(guī)模的工業(yè)和生物方面[49]。目前，已經(jīng)報(bào)道了許多測(cè)定H2Q的方法，如熒光法[50]、電化學(xué)方法[51]和高效液相色譜[52]。

WANG等[53]利用水熱法合成了氮/氯摻雜碳點(diǎn)（N/Cl-CDs）和氮/鋅摻雜碳點(diǎn)（N/Cu-CDs）；合成的CDs被用作模擬酶和熒光探針，該雙碳點(diǎn)體系用于識(shí)別痕量H2Q。N/Cl-CDs由于其過(guò)氧化物酶活性，在H2O2存在下氧化灰色的H2Q生成棕色對(duì)苯醌（BQ）；隨后，生成的BQ猝滅了N/Cu-CDs的熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2Q的檢測(cè)（如圖4）。

圖 2 H2O2、葡萄糖和尿酸的比色和熒光比率檢測(cè)示意圖[47]Fig.2 Schematic illustration of colorimetric and ratiometric fluorescent detection of H2O2, glucose, and UA[47]

圖 3 雙碳點(diǎn)制備及鄰苯二胺（OPD）和過(guò)氧化氫（H2O2）測(cè)定過(guò)程示意圖[39]Fig.3 Schematic illustration of the preparation of double carbon dots and determination process of o-phenylenediamine （OPD） and hydrogen peroxide （H2O2）[39]

圖 4 碳點(diǎn)合成的示意圖及雙碳點(diǎn)體系中H2Q測(cè)定的機(jī)理[53]Fig.4 Schematic representation of carbon dots synthesis and the determination mechanism of H2Q in a double carbon dots system[53]

3.5 超痕量K+的檢測(cè)

納米復(fù)合材料作為模擬酶的應(yīng)用范圍極其廣泛，不僅可以應(yīng)用于常量物質(zhì)的檢測(cè)，還可應(yīng)用于超痕量物質(zhì)的檢測(cè)。LI等[54]以玉米淀粉、乙二胺和氯金酸為原料，通過(guò)微波輻射快速制備了高催化活性且高穩(wěn)定性的氮、金共摻雜碳點(diǎn)（CDN/Au），CDN/Au在TMB-H2O2指示劑反應(yīng)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的催化作用，生成了氧化產(chǎn)物ox-TMB，并發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)。將納米酶反應(yīng)與鉀離子適體-血紅素的脫氧核酶反應(yīng)相結(jié)合，建立了一種雙酶催化熒光/吸收雙模式方法來(lái)檢測(cè)超痕量K+。此方法具有良好的選擇性和靈敏度，并且這一新方法也被用于其他形成G-四鏈體和血紅素的脫氧核酶的適體反應(yīng)

4 金屬有機(jī)框架作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用

金屬有機(jī)框架（MOFs）是一種結(jié)構(gòu)可調(diào)、具有模擬酶性質(zhì)的功能性熒光納米材料。目前研究最多的是用于對(duì)對(duì)膽堿及乙酰膽堿的檢測(cè)。

膽堿作為一種維生素B，是人類的必需營(yíng)養(yǎng)素，并參與肌肉運(yùn)動(dòng)、大腦發(fā)育和新陳代謝[55]。此外，它是乙酰膽堿（ACh）的前體，乙酰膽堿是外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要神經(jīng)遞質(zhì)[56]。膽堿和乙酰膽堿的異常水平能夠引發(fā)多種神經(jīng)疾病，包括精神分裂癥、進(jìn)行性癡呆、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病[57]。因此，靈敏和選擇性地檢測(cè)生物樣品中膽堿和乙酰膽堿的水平對(duì)于臨床分析和相關(guān)疾病的早期診斷至關(guān)重要。

GUO等[58]合成了一種具有模擬過(guò)氧化物酶和熒光發(fā)射雙重功能的MIL-101（Fe），構(gòu)建了基于MIL-101（Fe）納米酶的膽堿和乙酰膽堿無(wú)標(biāo)記熒光傳感器；這種熒光傳感策略包括乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解為膽堿的反應(yīng)，膽堿又被膽堿氧化酶氧化生成H2O2，生成的H2O2在MIL-101（Fe）納米酶的催化下分解為高活性羥基，從而MIL-101（Fe）納米酶的非熒光有機(jī)配體對(duì)苯二甲酸被羥基氧化形成高熒光的2-羥基對(duì)苯二甲酸；根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，通過(guò)多級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)膽堿和乙酰膽堿的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)限分別為20.0 和8.9 nmol/L；此外，通過(guò)檢測(cè)牛奶中的膽堿和人血漿中的乙酰膽堿，成功地驗(yàn)證了所開(kāi)發(fā)的基于雙功能MIL-101（Fe）的傳感策略的實(shí)用性。該方法不僅對(duì)膽堿和乙酰膽堿具有較高的靈敏度和選擇性，而且簡(jiǎn)化了傳感系統(tǒng)，降低了檢測(cè)成本，避免了熒光試劑帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為復(fù)雜生物樣品的分析開(kāi)辟了一條綠色通道。

VALEKAR等[59]合成了一種具有過(guò)氧化物酶活性和熒光特性雙重功能的N，N，N’，N’-四甲基-1，4-丁二胺（TMBDA）官能化MIL-100（Fe） （TMBDAMIL-100（Fe）），用于熒光定量檢測(cè)Cho和ACh，通過(guò)乙酰膽堿的連續(xù)催化氧化產(chǎn)生H2O2，激活胺官能化的TMBDA-MIL-100（Fe），將選定的底物AUR轉(zhuǎn)化為高熒光產(chǎn)物（oxAUR）（如圖5）；基于TMBDAMIL-100（Fe）優(yōu)異的過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)膽堿和乙酰膽堿，檢出限分別為0.027和0.036 μmol/L。此外，通過(guò)分別檢測(cè)牛奶和血清加標(biāo)樣品中的膽堿和乙酰膽堿，成功證明了該方法的實(shí)用性。

圖 5 用于檢測(cè)乙酰膽堿和膽堿的熒光方法示意圖[59]Fig.5 Schematic representation of the proposed fluorescence method for the detection of acetylcholine and choline[59]

5 結(jié)語(yǔ)與展望

近年來(lái)，隨著熒光分析技術(shù)的發(fā)展，納米熒光材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。本文總結(jié)了現(xiàn)階段基于熒光納米材料作為模擬酶在生化分析中應(yīng)用的研究進(jìn)展。基于熒光納米材料的模擬酶活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)維生素、葡萄糖、活性分子、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)以及酶活性的檢測(cè)，并且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如免疫分析、腫瘤診斷以及癌細(xì)胞的檢驗(yàn)和靶向治療中均表現(xiàn)出較好的檢測(cè)效果。但是熒光納米材料作為模擬酶材料的應(yīng)用和發(fā)展仍有很多問(wèn)題需要解決，例如，缺少一種通用而有效的方法，合成的熒光納米材料僅局限于一種或很少幾種待測(cè)物的檢測(cè)，容易造成材料浪費(fèi)、檢測(cè)成本加大、檢測(cè)效率低等問(wèn)題。此外，目前基于熒光納米材料的熒光傳感較多情況下采用單一熒光強(qiáng)度作為響應(yīng)信號(hào)，容易受到儀器誤差、溶劑等實(shí)驗(yàn)因素的影響。與單一信號(hào)的熒光傳感器不同，比率型熒光傳感器可以在很大程度上減少上述干擾，通過(guò)兩種熒光強(qiáng)度的自校準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)更高的分析準(zhǔn)確度，并且比率型熒光法多伴隨肉眼可見(jiàn)的顏色變化，可用于快速的可視化識(shí)別檢測(cè)。熒光納米材料在未來(lái)的發(fā)展中應(yīng)著重于開(kāi)發(fā)可視化便攜式檢測(cè)技術(shù)，并且實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)不同離子進(jìn)行檢測(cè)。因此，未來(lái)基于熒光納米材料作為模擬酶在生化分析中的應(yīng)用研究仍具有廣闊的研究空間。