黃蜀葵花總黃酮提取工藝優(yōu)化及其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用

王 敏，徐國(guó)輝，趙一靈，王剛強(qiáng)，朱湘玥，黃贛輝,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.江西省撫州市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，江西撫州 344000；3.四川樂(lè)山天馬晨達(dá)農(nóng)業(yè)有限公司，四川樂(lè)山 614500）

黃蜀葵花（Abelmoschus Manihot（L.） Medic.）為錦葵科秋葵屬草本植物黃蜀葵的花朵，原產(chǎn)地為我國(guó)南方的山谷草叢、田邊或灌木叢旁，現(xiàn)除西北以及東北等地外，全國(guó)大部分地區(qū)均有分布[1]。現(xiàn)代研究表明，以金絲桃苷為代表的黃酮類物質(zhì)是黃蜀葵花的主要功能成分[2]，具有抗癌、抗疲勞、利尿等功效[3-5]。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是人體內(nèi)催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸的關(guān)鍵酶[6]。人體內(nèi)嘌呤含量過(guò)高會(huì)代謝產(chǎn)生大量尿酸，進(jìn)而引發(fā)高尿酸血癥，長(zhǎng)期高尿酸血癥還可誘發(fā)高血壓、糖尿病、腎衰竭等疾病[7]。與一線西藥相比，天然黃酮作為XOD抑制劑，更加安全、廉價(jià)。因此，提取黃蜀葵花中黃酮類物質(zhì)作為保健食品或藥品的原料具有較好的應(yīng)用前景[8]。

目前，黃蜀葵花總黃酮的提取方法主要有乙醇回流法、超聲波提取法、超臨界提取等。如王鵬等[9]采用乙醇回流提取黃蜀葵花中金絲桃苷；宋健剛等[10]采用超聲波法輔助提取黑果腺肋花楸果中金絲桃苷；劉可福[11]研究了超臨界提取法提取銀杏葉中的有效成分。但這些方法或存在能耗大，或存在提取效率不高等問(wèn)題[12-14]。十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種加入少量就能顯著降低液體表面張力的物質(zhì)，可增加大分子有機(jī)物質(zhì)的溶解滲出能力，具有良好的增溶效果。國(guó)內(nèi)外已有部分科技工作者利用SDS的增溶作用，進(jìn)行黃酮成分的提取研究[15-16]。如李嬌等[17]研究了SDS強(qiáng)化柴胡皂苷的提取工藝；張馨心等[18]采用SDS強(qiáng)化超聲波提取龍牙傯木中的齊墩果酸。但超聲SDS輔助醇提取黃蜀葵花總黃酮鮮有報(bào)道。此外，黃蜀葵花提取液通常被用來(lái)研究其抗氧化、抗癌、抗疲勞等性能，目前還缺乏對(duì)其抑制XOD活性的研究。

因此，本文采用超聲SDS輔助提取沐川縣黃蜀葵花中的總黃酮，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，得出最佳提取條件；采用XOD體外抑制模型，測(cè)定提取液對(duì)XOD的抑制作用，為黃蜀葵花開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃蜀葵花干制品 四川樂(lè)山天馬山晨達(dá)農(nóng)業(yè)有限公司提供，60 ℃烘干后粉碎過(guò)40目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（AR） 上海源葉生物技術(shù)有限公司；亞硝酸鈉（AR） 上海同試化工有限公司；無(wú)水乙醇（AR）上海振興化工一廠；氫氧化鈉（AR） 西隴化工股份有限公司；十二烷基硫酸鈉 上海譜振生物科技有限公司；九水合硝酸鋁（AR） 鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

FW-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；KQ-2200DP超聲波清洗器 昆山市超聲清洗儀器有限公司；722N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取工藝 黃蜀葵花→粉碎、過(guò)篩（40目）→SDS協(xié)同超聲波強(qiáng)化提取→抽濾→減壓濃縮→離心（4000 r /min）→上清液定容→測(cè)定吸光度→計(jì)算總黃酮含量

操作要點(diǎn)：將粉碎好的粉末分級(jí)過(guò)篩以保證粉末大小的均一性，直至得到40目的黃蜀葵花粉末。準(zhǔn)確稱取2.50 g該粉末于錐形瓶中，并加入70%乙醇溶液和適量SDS，經(jīng)攪拌均勻后進(jìn)行超聲提取。抽濾時(shí)，應(yīng)盡量使待過(guò)濾物質(zhì)處于布氏漏斗中央，防止其未經(jīng)過(guò)濾，直接通過(guò)漏斗和濾紙之間的縫隙流下。將抽濾所得濃縮液用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，再用移液槍吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中測(cè)定總黃酮含量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以總黃酮含量為指標(biāo)，依次改變料液比、超聲波功率、十二烷基硫酸鈉（SDS）濃度、提取溫度和提取時(shí)間。確定黃蜀葵花總黃酮提取的最適范圍，計(jì)算總黃酮含量[12,19]。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

1.2.2.1 不同料液比對(duì)總黃酮含量的影響 設(shè)置料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮。將提取液抽濾、減壓濃縮、離心（4000 r/min）后，用60%乙醇定容到50 mL容量瓶中。用移液槍吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2.2 不同超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響 設(shè)置超聲波功率240、280、320、360、400 W，料液比1:40 g/mL，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2.3 不同SDS濃度對(duì)總黃酮含量的影響 設(shè)置SDS濃度為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/mL，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2.4 不同提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響 設(shè)置提取溫度30、40、50、60、70 ℃，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取時(shí)間50 min提取黃蜀葵花中總黃酮，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.2.5 不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響 設(shè)置提取時(shí)間30、40、50、60、70 min，料液比1:40 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度為0.04 g/mL，提取溫度50 ℃提取黃蜀葵花中總黃酮，計(jì)算總黃酮含量。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化黃蜀葵花總黃酮的提取工藝 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min，選取料液比、超聲波功率、SDS濃度3個(gè)因素為自變量（分別用A、B、C表示），以黃蜀葵花總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行分析，根據(jù)中心組合（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，因素與水平編碼表見(jiàn)表1[20-25]。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level design

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12 mg，60%乙醇溶解后定容于50 mL容量瓶，搖勻備用。用移液槍精確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 mL容量瓶中，加水至5 mL，分別加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻靜置6 min；加入1.0 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻靜置6 min；加入10.0 mL 10% NaOH溶液；最后用60%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min，510 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定[26]。以吸光度（A）作為縱坐標(biāo)，蘆丁的質(zhì)量濃度（C，mg/mL）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=2.4693C-0.0071，R2=0.99932。

1.2.5 總黃酮含量的測(cè)定和計(jì)算 用移液槍吸取5 mL不同條件下所得的樣液于25 mL容量瓶中，參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和公式（1），即可得到總黃酮含量[16]。

式中：V—提取液的體積，mL；C—總黃酮測(cè)定樣品溶液濃度，mg/mL；X—總黃酮提取液稀釋的總倍數(shù)；M—每次提取加入的樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 總黃酮對(duì)XOD的抑制作用 參照Yan等[8]的方法，并作適當(dāng)修改。將稀釋后的不同濃度梯度的黃蜀葵花提取液與黃嘌呤（2 mmol/L）和XOD（50 μL，0.5 U/mL）進(jìn)行混合。孵育10 min后加入NaOH（100 μL，1.0 mol/L）終止反應(yīng)。利用紫外分光光度計(jì)在295 nm處測(cè)定吸光值。抑制率為計(jì)算公式（2）:

式中：A1—空白體系；A2—樣品組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案、建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行多元回歸分析，選擇最佳提取工藝參數(shù)，并使用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)總黃酮含量影響 料液比對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量的影響見(jiàn)圖1，考察料液比范圍為1:20～1:60 g/mL，結(jié)果表明，料液比對(duì)黃酮含量的影響較顯著（P＜0.05）。當(dāng)料液比低于1:50 g/mL時(shí)，隨著料液比的增大，總黃酮含量不斷增加。這是因?yàn)榱弦罕仍黾邮沟萌芤号c黃蜀葵花接觸面積增大，黃酮類物質(zhì)溶解更加充分[27]。而當(dāng)料液比大于1:50 g/mL時(shí)，隨著料液比的增大，總黃酮含量反而下降。這是因?yàn)榱弦罕冗^(guò)高時(shí)溶液中微粒樣品受到超聲波的熱效應(yīng)和空化作用會(huì)減弱[28]。因此，料液比選擇1:50 g/mL為宜。

圖 1 料液比對(duì)總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the content of total flavonoids

圖 2 超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids

2.1.2 超聲波功率對(duì)總黃酮含量的影響 超聲波功率對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量的影響見(jiàn)圖2，考察超聲波功率范圍為240～400 W，結(jié)果表明，超聲波功率對(duì)總黃酮含量有影響，且不同小寫(xiě)字母間表示影響極顯著（P＜0.01）。隨著超聲波功率的增大，總黃酮含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲波功率為320 W時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大，因此選擇最佳的提取功率為320 W?？傸S酮含量隨超聲波功率增加先升高后降低，原因可能是由于超聲波功率增加，超聲所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)作用導(dǎo)致植物組織細(xì)胞破碎越來(lái)越完全，故總黃酮含量隨著超聲波功率的增加而升高，但是，超聲波功率過(guò)大時(shí)，因熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，破壞了黃蜀葵花總黃酮的結(jié)構(gòu)，造成含量下降[14]。

2.1.3 SDS濃度對(duì)總黃酮含量的影響 SDS濃度對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量的影響見(jiàn)圖3，考察SDS濃度范圍為0.02～0.06 g/mL，結(jié)果表明，SDS濃度對(duì)黃酮含量有影響，且不同小寫(xiě)字母間表示影響極顯著（P＜0.01）。當(dāng)SDS濃度小于0.05 g/mL，總黃酮含量隨SDS濃度增大而增加，其原因可能是SDS濃度太小未達(dá)到臨界膠束濃度[12]，造成提取不完全。當(dāng)SDS濃度大于0.05 g/mL時(shí)，總黃酮含量隨SDS濃度增大反而減小，原因可能是過(guò)量的SDS產(chǎn)生較粗大的乳液泡沫，對(duì)提取及過(guò)濾操作產(chǎn)生了反作用[29]。因此SDS濃度選取0.05 g/mL為宜。

圖 3 SDS濃度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of SDS concentration on the content of total flavonoids

2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響 提取溫度對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量的影響見(jiàn)圖4，在30～70 ℃的升溫考察過(guò)程中，提取溫度為40 ℃時(shí)黃酮含量變化較大，大于40 ℃時(shí)曲線總體比較平緩，說(shuō)明提取溫度對(duì)黃酮含量的影響不明顯。當(dāng)提取溫度低于50 ℃時(shí)，隨溫度升高總黃酮含量增加較快，這可能是因?yàn)楦邷厥谷軇┱扯冉档?，分子運(yùn)動(dòng)加快，從而加快黃酮類物質(zhì)的溶出[15]。在提取溫度50～60 ℃時(shí)，隨溫度升高總黃酮含量緩慢增加，當(dāng)提取溫度高于60 ℃時(shí)，隨溫度升高總黃酮含量反而有下降的趨勢(shì)，原因可能是溫度過(guò)高使得黃酮類化合物氧化，破壞了黃酮類化合物結(jié)構(gòu)[16]。因此選擇60 ℃為最適溫度。

圖 4 提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the content of total flavonoids

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響 提取時(shí)間對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量的影響見(jiàn)圖5，考察時(shí)間為30～70 min，提取時(shí)間為40 min時(shí)黃酮含量變化較大，大于40 min時(shí)曲線總體比較平緩，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響不顯著。當(dāng)提取時(shí)間小于60 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加總黃酮含量不斷增大。當(dāng)提取時(shí)間大于60 min時(shí)，總黃酮含量略有下降。原因可能是，過(guò)長(zhǎng)的超聲波時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分黃蜀葵花黃酮發(fā)生氧化作用，因損耗致使總黃酮含量略有下降[15]。因此，選擇60 min作為最佳提取時(shí)間。

圖 5 提取時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the content of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃蜀葵花總黃酮的提取條件

2.2.1 模型組合設(shè)計(jì)及方差分析 響應(yīng)面的試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。采用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮含量（Y）對(duì)各項(xiàng)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=4.58-0.087A+0.048B-0.12C+0.026AB+0.15AC+0.22BC-0.33A2-0.21B2-0.35C2。方程的模型顯著性P＜0.05，說(shuō)明模型具有意義；失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)差異不顯著，試驗(yàn)無(wú)失擬因素存在。模型調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.8935，決定系數(shù)R2=0.9534，響應(yīng)值的變化有95.34%來(lái)源于所選因素，模型與試驗(yàn)擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小。因此，該模型對(duì)黃蜀葵花總黃酮的提取工藝是有意義的。由方差分析F值可知，對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量影響因素的主次順序?yàn)镾DS濃度（C）＞料液比（A）＞超聲波功率（B）。其中C、AC對(duì)總黃酮含量的影響顯著（P＜0.05），BC、A2、B2、C2對(duì)總黃酮含量的影響極顯著（P＜0.01），A、B、AB對(duì)總黃酮含量的影響不顯著（P＞0.05）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of response surface test

2.2.2 交互作用分析 料液比和超聲功率響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6（A）和圖6（B）。由圖6（A）和圖6（B）可知，料液比曲面比超聲功率曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變料液比對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量影響較超聲功率大；料液比和超聲功率等高線接近于圓形，表明兩因素的交互作用不顯著[30]。料液比和SDS濃度響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6（C）和圖6（D）。由圖6（C）和圖6（D）圖可知，SDS濃度曲面比料液比曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變SDS濃度對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量影響較料液比大；料液比和SDS濃度等高線圖于橢圓，且橢圓與兩軸之間略有角度，表明兩因素的交互作用顯著[30]。超聲功率和SDS濃度響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6（E）和圖6（F）。由圖6（E）和圖6（F）可知，SDS濃度曲面比超聲功率曲面坡度陡峭，即固定其他因素不變，改變SDS濃度對(duì)黃蜀葵花總黃酮含量影響較超聲功率大；超聲功率和SDS濃度等高線圖趨于橢圓，且橢圓與兩軸之間夾角較大，表明兩因素的交互作用極顯著[30]。以上結(jié)果與回歸方程及方差分析結(jié)果一致。

圖 6 各因素對(duì)黃蜀葵花總黃酮的響應(yīng)面三維圖和等高線圖Fig.6 Response surface plots showing influences of variables on the total flavonoid yield of Abelmoschus manihot

2.2.3 提取工藝條件的驗(yàn)證 采用響應(yīng)曲面分析可得黃蜀葵花總黃酮最優(yōu)提取條件：料液比1:48.16 g/mL，超聲波功率319.51 W，SDS濃度0.05 g/mL，預(yù)測(cè)值為4.60 mg/g。將提取條件調(diào)整為：料液比1:48 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度0.05 g/mL。根據(jù)調(diào)整后的提取條件，進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出總黃酮含量為4.63 mg/g。

2.3 總黃酮對(duì)XOD的抑制作用

黃蜀葵花總黃酮提取液在稀釋一定倍數(shù)后，與相同濃度下的SDS對(duì)照，所得提取液對(duì)XOD的抑制效果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)抑制劑濃度為0.38～1.92 mg/mL時(shí)，總黃酮提取液對(duì)XOD的抑制作用明顯大于僅含SDS的空白溶液，且隨著抑制劑濃度的增加，總黃酮的抑制能力逐漸趨于平緩，最大抑制率可達(dá)98.35%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)出，黃蜀葵花中的黃酮類物質(zhì)具有良好的抑制XOD活性的作用。

圖 7 不同抑制劑濃度對(duì)XOD的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of different inhibitors concentration on XOD

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以SDS協(xié)同超聲波提取黃蜀葵花總黃酮，在單因素基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。確定黃蜀葵花總黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1:48 g/mL，超聲波功率320 W，SDS濃度0.05 g/mL。在此條件下對(duì)黃蜀葵花中總黃酮進(jìn)行提取，含量為4.63 mg/g。SDS是一種陰離子表面活性劑，能使溶液的表面張力顯著降低，對(duì)物料具有界面吸附和分散作用，可以增強(qiáng)溶劑對(duì)物料的潤(rùn)濕性和滲透性，加之超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，從而增加了黃酮的溶出、提高了提取率、降低了提取時(shí)間，該方法操作簡(jiǎn)單可行，為黃蜀葵花總黃酮提取提供了一定的參考價(jià)值。此外，應(yīng)用XOD體外抑制模型，總黃酮提取液對(duì)XOD的抑制率高達(dá)98.35%，由此可推測(cè)黃蜀葵花總黃酮具有良好的抑制XOD活性的作用，這為后期研究具體有效成分作為緩解高尿酸血癥的膳食來(lái)源提供了理論基礎(chǔ)。