淺漬豇豆復(fù)合功能發(fā)酵劑制備關(guān)鍵技術(shù)

王 英，張 會，范琳琳，施亞萍，傅 青，王 帆，劉小莉,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；3.南京脆而爽蔬菜食品有限公司，江蘇南京 211225）

豇豆因其營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性強、產(chǎn)量高等特性，成為我國南北方廣泛栽培的大眾化蔬菜之一。但是嫩莢采收后容易產(chǎn)生腐爛變質(zhì)，因此要提高其商業(yè)價值必須采取相應(yīng)的保鮮或加工手段。其中腌制是長期貯藏蔬菜的主要加工方法之一。接種發(fā)酵具有發(fā)酵時間短、易控制等優(yōu)點而逐漸代替自然發(fā)酵。目前發(fā)酵劑主要有單一菌種和復(fù)合菌種兩種形式，其中復(fù)合菌制劑是將兩種或兩種以上的菌株混合制成，具有更加全面的發(fā)酵效果[1]。Sun等[2]利用復(fù)合菌制劑發(fā)酵香腸，結(jié)果顯示復(fù)合菌制劑能夠充分利用原料，提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值、改善產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。李思寧等[3]利用傳統(tǒng)發(fā)酵劑與動物雙歧桿菌、植物乳桿菌共培養(yǎng)對發(fā)酵乳抗氧化特性的影響的結(jié)果顯示，益生菌共培養(yǎng)可以提高發(fā)酵乳的抗氧化能力，這種作用主要源于益生菌的蛋白水解特性。曹余等[4]利用庫德里阿茲威畢赤酵母、單孢酵母、植物乳桿菌、短乳桿菌、布氏乳桿菌等7株混合發(fā)酵搓菜，混合發(fā)酵菜種的醇類、酮類、酯類、酸類等風(fēng)味物質(zhì)的種類數(shù)和相對含量都多于自然發(fā)酵。武旭[5]利用納豆芽孢桿菌與乳酸菌復(fù)合發(fā)酵全豆豆乳的結(jié)果也顯示，復(fù)合菌劑能夠提高全豆豆乳中的粗蛋白、粗脂肪和一些風(fēng)味物質(zhì)的含量；鄭靜芳[6]利用來源于自凈能力強魚塘中菌制備復(fù)合發(fā)酵劑，復(fù)合菌制劑能有效地改善養(yǎng)殖水體質(zhì)量。以上研究表明，復(fù)合發(fā)酵劑能夠在一定程度上提高發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。

對豇豆的營養(yǎng)功能研究顯示，豇豆富含粗纖維、碳水化合物、維生素等，且蛋白質(zhì)含量高[7]。豇豆具有延緩衰老、促進大腸蠕動、促進胰島素分泌等功效[8-9]。豇豆嫩莢采收后容易產(chǎn)生腐爛變質(zhì)，會降低其商業(yè)價值。利用復(fù)合功能發(fā)酵劑，通過淺漬化發(fā)酵加工豇豆獲得低鹽化的功能化發(fā)酵產(chǎn)品的研究目前還未見報道。本文以來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的8株乳酸菌為資源，通過菌株間生物相容性、生物功能活性影響及發(fā)酵豇豆的特性研究，制備淺漬豇豆的復(fù)合功能發(fā)酵劑，以降低發(fā)酵豇豆的亞硝酸鹽含量，同時提升發(fā)酵豇豆產(chǎn)品的益生功能。研究結(jié)果將為豇豆淺漬發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠復(fù)合功能發(fā)酵劑和應(yīng)用技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮采摘嫩豇豆 購于孝陵衛(wèi)菜場；泡菜鹽、花椒、姜片、干紅辣椒、冰糖 購于當(dāng)?shù)靥K果超市；氯化鈣、檸檬酸、異抗壞血酸 國產(chǎn)食品級；MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司，按照說明配制固體和液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min；8株乳酸菌 詳細信息見表1，均保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC25923）、Salmonella（ATCC 51812）大腸桿菌、Escherichia coli（ATCC25922） 南京市食品質(zhì)量監(jiān)督與檢測院。

表1 菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析Table 1 Phylogenetic analysis of 16S rDNA of strains

UV-P5紫外分光光度計 上海美普達科技有限公司；雷磁ZD-2型自動點位滴定儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TOMY SX500自動滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YS6060色差計 深圳市三恩時科技有限公司；TMWS-TOUCH質(zhì)構(gòu)分析儀 美國FTC。

1.2 實驗方法

1.2.1 豇豆淺漬發(fā)酵 從-80 ℃取出甘油管保藏的8個菌種，分別劃線接種至MRS培養(yǎng)基平板上，28～30 ℃條件下培養(yǎng)72 h，挑取單菌落接種至MRS液體試管中，28～30 ℃條件下培養(yǎng)，以5%的接種量接種到MRS液體三角瓶中，28～30 ℃條件下培養(yǎng)18～20 h，離心（4 ℃，5000 r/min，5 min）收集菌體，用無菌生理鹽水洗菌體2次后并重懸，調(diào)整菌體密度為5.02×108CFU/mL，作為豇豆發(fā)酵的發(fā)酵劑。

淺漬發(fā)酵液制備：在1 L水加入50 g泡菜鹽、5 g花椒，15 g姜片，10 g 干紅辣椒和冰糖30 g，煮沸后保溫10 min，降至室溫備用。降溫后的淺漬液中加入0.15%的氯化鈣作為保脆劑，加入0.05%的檸檬酸和0.03%的異抗壞血酸作為護色劑。

淺漬發(fā)酵：豇豆挑選洗凈晾曬至表面無水后，加入到淺漬發(fā)酵液中，25～28 ℃發(fā)酵，每天測定pH，當(dāng)pH達到3.5左右時[10]，結(jié)束發(fā)酵并記錄發(fā)酵時間，并對發(fā)酵豇豆品質(zhì)和感官進行評定。

1.2.2 淺漬豇豆品質(zhì)測定 硬度和咀嚼性測定[11]：利用TMWS-TOUCH質(zhì)構(gòu)分析儀對淺漬豇豆進行硬度和咀嚼性測試。選取250 N的力量感應(yīng)單元，直徑為8 mm的圓柱型探頭，硬度測試條件設(shè)置：測前速率1 mm·s-1，測試速率0.5 mm·s-1，測后速率1 mm·s-1，壓縮量50%。測試結(jié)果選取測試的硬度最大力Fmax和咀嚼性為參數(shù)進行分析。

色度測定[12]：取100 g淺漬豇豆，加入100 g蒸餾水，用打漿機打漿。在反射模式下，采用3nh色差儀分別測定淺漬豇豆的L*、a*、b*值。對每種樣品取8次樣，取平均值。L*表示光澤亮度，值越大，亮度越高；a*值表示紅綠色程度，“+”代表紅色，“-”代表綠色；b*值表示黃藍色程度，“+”代表黃色，“-”代表藍色；淺漬豇豆色澤程度用飽和度（C）來表示，根據(jù)公式C=（a*2+b*2）1/2計算飽和度（C）。

1.2.3 感官評價 選擇對淺漬豇豆味道有一定識別能力的食品專業(yè)16名研究生為感官評定小組成員。對參加評定的成員進行訓(xùn)練，明確評分標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇10人為感官評定員（男女比例為1:1）。每個樣品品嘗后，用37 ℃溫水漱口后再品嘗下一個樣本。每一個樣本進行三次重復(fù)評定。感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 淺漬豇豆感官評分表Table 2 Mark of organoleptic evaluation rating of low-salt curing cowpeas

1.2.4 乳酸菌間生長相容性的考察 將活化好的乳酸菌按照總接種量為3%（v/v），比例為1:1分別接種至MRS液體試管中，以接種量為3%單獨接種為對照，30 ℃靜止培養(yǎng)36 h，采用梯度稀釋平板計數(shù)的方法測定菌體生長情況，結(jié)果以lg （CFU/mL）表示。比較單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的菌體密度，研究菌株間的生長相容性。

1.2.5 共培養(yǎng)對菌株功能的影響

1.2.5.1 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus plantarumSD-7降解亞硝酸鹽功能的影響 將Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarumFM-LP-9和Lactobacillus alimentariusFM-MM4 3株乳酸菌按照接種量比例為3:1:1、3:1:2、3:2:1、3:2:2 和1:1:1進行復(fù)配，接種于含200 mg/L NaNO2，pH7.0的50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液中NaNO2的含量。以單獨接種Lactobacillus plantarumSD-7為對照，總接種量為5%，每個處理三次重復(fù)。

亞硝酸鹽含量測定：利用鹽酸萘乙二胺法測定泡菜的亞硝酸鹽含量，具體操作方法參照GB/T 5009.33.2003中的格里斯比色法對亞硝酸鹽進行測定。以亞硝酸鹽含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=0.042x+0.009，決定系數(shù)R2=0.999。

1.2.5.2 共培養(yǎng)對Lactobacillus plantarumFM-LP-9菌株抗氧化能力的影響 將Lactobacillus plantarumFM-LP-9、Lactobacillus plantarumSD-7和Lactobacillus alimentariusFM-MM4 3株乳酸菌按照接種量比例為3:1:1、3:1:2、3:2:1、3:2:2 和1:1:1進行復(fù)配，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，將不同混合接種的培養(yǎng)好的菌體離心（8000 r/min 3min），用生理鹽水洗滌2次后再用生理鹽水重懸，調(diào)整菌液密度OD600值為均2.00±0.02。測定上述處理好菌體的DPPH自由基、ABTS+自由基清除率和還原力。以單獨接種為對照，總接種量為5%，每個處理三次重復(fù)。

a. DPPH自由基清除率的檢測。參考文獻[13]方法并略作修改。取2 mL待測乳酸菌的生理鹽水懸浮液，加入2 mL DPPH·溶液（用無水乙醇溶解配制DPPH，終濃度為0.4 mmol/L），混合均勻后，室溫下遮光反應(yīng)30 min后在轉(zhuǎn)速8000 r/min下離心10 min，取上清，測定樣品在波長517 nm處的吸光度。對照組樣品以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。DPPH自由基清除率（%）=[1-樣品吸光值/對照吸光值]×100。

b. ABTS+自由基清除率的檢測。參考文獻[13]方法并略作修改。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混勻，于4 ℃放置16 h制備ABTS+·溶液。用無水乙醇將ABTS+·溶液稀釋直至其波長在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。取2 mL菌懸液，加入2 mL ABTS+·溶液，搖勻后于室溫下放置10 min，測量波長734 nm處的吸光值，計算樣品的自由基清除率。ABTS+自由基清除率（%）=[1-樣品吸光值/對照吸光值]×100。

c.還原活性的測定。參照文獻[14]方法并略有修改。取0.5 mL菌懸浮液，加入1.5 mL PBS溶液（0.2 mol/L，pH6.6）中混勻后加入1.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴保溫20 min，冰水中迅速冷卻至室溫，加入1.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，8000 r/min離心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL生理鹽水，同時加入1 mL 0.1% FeCl3溶液，充分混勻，靜置孵育10 min后在波長700 nm處測定反應(yīng)體系的吸光值。其結(jié)果采用L-半胱氨酸作標(biāo)準(zhǔn)物來表述乳酸菌的還原力。分別配制不同濃度（0～400 μmol/L）的L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述步驟進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測定結(jié)果，L-半胱氨酸鹽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，Y=0.0012x-0.0026，R2=0.996。

1.2.5.3 共培養(yǎng)對Lactobacillus alimentariusFM-MM4抑菌功能的影響 將Lactobacillus alimentariusFMMM4、Lactobacillus plantarumFM-LP-9和Lactobacillus plantarumSD-73株乳酸菌按照接種量比例為3:1:1、3:1:2、3:2:1、3:2:2和1:1:1進行復(fù)配，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測定菌體的抑菌情況。以單獨接種為對照，總接種量為5%，每個處理三次重復(fù)。

參考Liu等[15]的瓊脂孔擴散法（Well-diffusion Agar Assay）方法：將含1%致病菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌）懸液（108CFU/mL）傾倒入滅菌的平皿中，待其凝固后，用滅菌的打孔器在平皿內(nèi)打孔，孔徑為5 mm，每個平皿打4個孔。供試乳酸菌培養(yǎng)液5000 ×g，4 ℃ 離心10 min得上清，每孔中加入100 μL的上述上清液，同時以MRS培養(yǎng)基作為陰性對照，4 ℃擴散2～4 h后，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。用游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈的大小，每個樣品做3個平行。

1.2.6 復(fù)合接種比例對淺漬發(fā)酵豇豆品質(zhì)的影響將具有不同功能特性的乳酸菌Lactobacillus plantarumFM-LP-9、Lactobacillus plantarumSD-7和Lactobacillu salimentariusFM-MM4三者混合接種，三株乳酸菌按照接種量比例為3:1:1、3:1:2、3:2:1、3:2:2 和1:1:1，總接種量為5%，25～28 ℃發(fā)酵，每天測定pH，當(dāng)pH達到3.5左右時，結(jié)束發(fā)酵并記錄發(fā)酵時間，測定淺漬豇豆的色澤、硬度、咀嚼性，并對發(fā)酵豇豆進行感官評分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用SPSS 13.0和One-Way（ANOVA）進行統(tǒng)計和顯著性分析。采用LSD多重性比較分析顯著性，顯著水平P＜0.05，以不同字母表示。用Excel 2016處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵豇豆的特性

研究表明不同菌株其發(fā)酵特性及其對發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)影響不同，劉宗敏等用不同乳酸菌發(fā)酵蘿卜干，發(fā)現(xiàn)不同菌株發(fā)酵能力不同，其產(chǎn)品的總酸、揮發(fā)酸、游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量都不同[16]。楊麗娜等用9種乳酸菌進行發(fā)酵蔬菜研究顯示，不同發(fā)酵菜及湯汁中的氨基酸、總酸、總糖等多種成分及感官評價不同[17]。本研究中對傳統(tǒng)發(fā)酵食品來源的8株乳酸菌發(fā)酵豇豆的特性進行了研究，結(jié)果見表3，從表中可以看出，不同菌株發(fā)酵能力不同，6株菌可以在120 h內(nèi)pH達到3.5左右，其他2株菌需要發(fā)酵144 h pH才能達到3.5。不同菌株對發(fā)酵豇豆的色澤的影響也不同，Lactobacillus plantarumSD-7和Lactobacillus plantarumFM-LP-9發(fā)酵的豇豆色澤飽和值最高，Lactobacillus plantarumFM-LP-4和Lactobacillus plantarum12-2發(fā)酵豇豆的色澤飽和值最低。不同菌株對發(fā)酵豇豆的硬度影響結(jié)果顯示，Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarumFM- LP-9、Lactobacillus plantarum1-1、Lactobacillus paracaseiFM-LP-4和Lactobacillus alimentariusFM-MM4發(fā)酵豇豆的硬度顯著高于其他幾株菌發(fā)酵豇豆的硬度（P＜0.05）。感官評分顯示，Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarum9SH、Lactobacillus plantarumFM-LP-9、Lactobacillus paracaseiFM-LP-4和Lactobacillus alimentariusFM-MM4顯著高于其他幾株的發(fā)酵豇豆感官評分值（P＜0.05）。綜合發(fā)酵時間、色澤、硬度、感官評分結(jié)果及復(fù)合功能發(fā)酵研究目的，選擇Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarumFM-LP-9和Lactobacillus alimentariusFMMM4進行后續(xù)的復(fù)合發(fā)酵劑的復(fù)配研究。

表3 8株菌在淺漬發(fā)酵豇豆中的發(fā)酵特性Table 3 Fermentation characteristics of eight strains in low-salt curing cowpea

2.2 共培養(yǎng)對菌株間生長的影響

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是通過多種微生物共同協(xié)同發(fā)酵，主要包括乳酸菌、酵母和醋酸菌。研究表明，在初期，多種微生物共存，由于體系的改變及微生物之間的協(xié)同及拮抗作用，隨著發(fā)酵進程微生物群體組成發(fā)生改變[18]。共培養(yǎng)（Co-culture）是指在無菌條件下，將一些不同的特別指定的微生物在厭氧或好養(yǎng)條件下的混合培養(yǎng)[19]。研究還表明，由于共培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)存在更為豐富的酶系統(tǒng)和生物誘導(dǎo)效應(yīng)利用了中間代謝物，從而有利于生物量的快速增長[20]，Kumari等[21]將佛羅里達平菇Pleurotusflorida和立枯絲核菌Rhizoctoniasolani混合培養(yǎng)，與單獨培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)生物產(chǎn)量更高。Li等[22]報道，在牛乳中，Lactobacillus plantarum和Bifidobacterium animalis存在明顯的共生關(guān)系，且能夠改善發(fā)酵乳的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。本研究通過對比Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarumFM-LP-9和Lactobacillus alimentariusFM- MM4 3株菌單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)的菌體密度，來解析共培養(yǎng)對菌體生長的影響，結(jié)果見表4，從表4中可以看出，共培養(yǎng)菌體密度lg值和單獨培養(yǎng)菌體密度相l(xiāng)g值比較，lg值都有升高，升高倍數(shù)在0.02～0.1之間，雖然從lg值看，升高倍數(shù)不大，但是從菌體密度lg值對應(yīng)科學(xué)計數(shù)結(jié)果（數(shù)據(jù)為列出）來看，單獨培養(yǎng)時Lactobacillus alimentariusFM-MM4的lg值為8.51，科學(xué)計數(shù)結(jié)果為3.21×108，當(dāng)和Lactobacillus plantarumSD-7混合培養(yǎng)時，混合體系中的lg值為9.37，科學(xué)計數(shù)結(jié)果為2.35×109，混合體系的菌體密度提高6.32倍；Lactobacillus plantarumSD-7單獨培養(yǎng)時，lg值為9.16，科學(xué)計數(shù)結(jié)果為1.45×109，該菌株與其他菌株混合培養(yǎng)體系最低lg值為9.33，科學(xué)計數(shù)結(jié)果為2.14×109，菌體密度升高0.48倍。以上結(jié)果表明3株菌之間共同培養(yǎng)不存在拮抗作用，且表現(xiàn)出協(xié)同增效的結(jié)果。

表4 3株乳酸菌間生長相容性Table 4 Growth compatibility among three strains of lactic acid bacteria

2.3 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus plantarum SD-7降解亞硝酸鹽功能的影響

目前對微生物功能的研究多集中于純培養(yǎng)菌株，事實上微生物共培養(yǎng)存在著巨大的研究潛力。研究表明，在共培養(yǎng)體系中，共培養(yǎng)微生物之間有著較為復(fù)雜的生態(tài)學(xué)關(guān)系，主要涉及協(xié)同代謝、相互拮抗、互利共生、細菌素、信號分子之間的相互作用等，不同種屬的微生物能夠產(chǎn)生截然不同的作用，而這些作用在一定程度上都影響著共培養(yǎng)體系中物質(zhì)的產(chǎn)量和新物質(zhì)的產(chǎn)生[23-26]。另外，通過改變細胞間交流、物種代謝作用以及空間結(jié)構(gòu)等方式進行調(diào)控微生物間的相互作用，從而實現(xiàn)對合成群落的改造[27]。Chen等[28]在大米培養(yǎng)基上共培養(yǎng)土曲霉Aspergillus terreus與枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis或蠟質(zhì)芽抱桿菌Bacillus cereus，與單一的土曲霉培養(yǎng)相比，其產(chǎn)生的天然產(chǎn)物積累增加了34倍。本研究通過對比Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus plantarumFM-LP-9和Lactobacillus alimentariusFM-MM4間不同比例混合的共培養(yǎng)體系和Lactobacillus plantarumSD-7單獨培養(yǎng)對亞硝酸鹽降解能力，來解析共培養(yǎng)對Lactobacillus plantarumSD-7亞硝酸鹽降解能力的影響，結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，不同比例混合的共培養(yǎng)體系的降解亞硝酸鹽的能力不同，接種比例為3:2:2和1:1:1的共培養(yǎng)體系中的亞硝酸鹽降解能力無顯著差異，但顯著高于1:0:0（Lactobacillus plantarumSD-7單獨培養(yǎng)）、3:1:1、3:1:2和3:2:1組（P＜0.05），本結(jié)果表明，共培養(yǎng)體系中的3株間以合適的比例共存能夠促進體系降解亞硝酸鹽的能力。

2.4 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus plantarum FM-LP-9抗氧化能力的影響

將不同種類微生物在液體培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)也被稱為混合發(fā)酵。研究表明通過混合發(fā)酵，可以增加天然產(chǎn)物庫，有助于發(fā)現(xiàn)新的次級代謝產(chǎn)物，而且還有助于激活已知的微生物生產(chǎn)力[29]。Oh等[30]將海洋真菌Emericellasp和Salinispora arenicola共培養(yǎng)，縮酚酸肽的產(chǎn)量增加了100倍。本研究通過對比Lactobacillus plantarumFM- LP-9、Lactobacillus plantarumSD-7、Lactobacillus alimentariusFM-MM4不同比例混合的共培養(yǎng)體系和Lactobacillus plantarumFM-LP-9單獨培養(yǎng)（1:0:0）對DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及還原力的比較，來解析共培養(yǎng)對Lactobacillus plantarumFM-LP-9菌株抗氧化能力的影響，結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，不同比例混合的共培養(yǎng)體系的中菌體的抗氧化能力不同，單獨培養(yǎng)、3:1:1、3:1:2和3:2:1共培養(yǎng)體系中菌體的DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及還原力沒有顯著差異（P＞0.05），接種比例為1:1:1的共培養(yǎng)體系中菌體的DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及還原力顯著提高（P＜0.05）。因此本研究結(jié)果表明，在合適的接種比例條件下，混合發(fā)酵能夠促進Lactobacillus plantarumFM- LP-9的抗氧化能力。

圖 1 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus plantarum SD-7降解亞硝酸鹽功能的影響Fig.1 Effect of co-culture on nitrite degradation capacity of Lactobacillus plantarum SD-7

圖 2 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus plantarum FM-LP-9抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of co-culture on antioxidant capacity of Lactobacillus plantarum FM-LP-9

2.5 共培養(yǎng)對菌株Lactobacillus alimentarius FM-MM4抑菌能力的影響

本研究通過對比Lactobacillus alimentariusFMMM4、Lactobacillus plantarumSD-7和Lactobacillus plantarumFM-LP-9不同比例混合的共培養(yǎng)體系和Lactobacillus alimentariusFM- MM4單獨培養(yǎng)對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌能力，來解析共培養(yǎng)對Lactobacillus alimentariusFMMM4抑菌功能的影響，結(jié)果見表5。從表5中可以看出，不同比例混合的共培養(yǎng)體系的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌抑制能力不同，與單獨培養(yǎng)（1:0:0）相比，混合接種比例為3:2:1、3:2:2和1:1:1的共培養(yǎng)體系中菌液對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌能力顯著提高（P＜0.05），比例為3:1:2的共培養(yǎng)體系中菌液對沙門氏菌的抑菌能力顯著提高（P＜0.05）；比例為3:2:1和1:1:1的共培養(yǎng)體系中菌液對大腸桿菌的抑菌能力顯著提高（P＜0.05），因此，在合適的接種比例條件下，混合培養(yǎng)能夠促進Lactobacillus alimentariusFM-MM4的抗菌能力。Mellefont等[31]對單增李斯特菌與大腸埃希式菌、熒光假單胞菌、乳酸桿菌分別進行共培養(yǎng)的研究也顯示出混合體系中的協(xié)同增長的作用差異與混合培養(yǎng)濃度比例有一定關(guān)系，當(dāng)混合濃度相當(dāng)時，協(xié)同作用最顯著。

表5 共培養(yǎng)對Lactobacillus alimentarius FM-MM4抑菌功能活性的影響Table 5 Effect of co-culture on bacteriostasis activity of Lactobacillus alimentarius FM-MM4

2.6 共發(fā)酵對豇豆泡菜品質(zhì)的影響

利用共培養(yǎng)技術(shù)可以改造傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，使發(fā)酵周期縮短且產(chǎn)品質(zhì)量提高，Yan等[32]利用腸膜明串珠菌和戊糖乳桿菌共培養(yǎng)生產(chǎn)泡菜，在降低泡菜中腐敗菌數(shù)目的同時還可以改善泡菜的風(fēng)味。本研究通過對比自然發(fā)酵組（CK）和接種不同比例復(fù)合發(fā)酵劑的豇豆色澤飽和度、硬度、咀嚼性及感官評分來分析復(fù)合發(fā)酵劑對淺漬豇豆品質(zhì)的影響，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，不同接種比例條件下發(fā)酵的豇豆品質(zhì)表現(xiàn)不同，與自然淺漬豇豆CK相比，接種發(fā)酵的色澤飽和度值、發(fā)酵豇豆的硬度、產(chǎn)品的咀嚼性及感官評分顯著提高（P＜0.05）。在不同接種比例中，接種比例為3:2:1、3:2:2和1:1:1的淺漬豇豆的總體品質(zhì)表現(xiàn)較優(yōu)。綜合測定的4個指標(biāo)，接種比例為3:2:2和1:1:1的共發(fā)酵的豇豆品質(zhì)最好。

表6 混合發(fā)酵對淺漬豇豆品質(zhì)的影響Table 6 Effect of mixed-fermentation on quality of low-salt curing cowpea

3 結(jié)論

將具有不同功能的微生物進行復(fù)配制備復(fù)合功能發(fā)酵劑是食品發(fā)酵加工的一個熱點，而組成復(fù)合發(fā)酵劑的微生物之間必須具有良好的相容性。本研究對具有不同功能的乳酸菌間的生長相容性研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽降解菌Lactobacillus plantarumSD-7、抗氧化功能Lactobacillus plantarumFM-LP-9和抑菌功能Lactobacillus alimentariusFM-MM4之間具有良好的生長相容性，混合培養(yǎng)菌體密度可以提高0.49～6.31倍。共培養(yǎng)對菌株功能的影響的結(jié)果表明，Lactobacillus plantarumSD-7、抗氧化功能Lactobacillus plantarumFM-LP-9和抑菌功能Lactobacillus alimentariusFM-MM4之間共培養(yǎng)接種比例為1:1:1時，混合培養(yǎng)菌體的DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、還原力和抑菌能力都顯著提高（P＜0.05）。與自然發(fā)酵相比，接種發(fā)酵的豇豆品質(zhì)明顯提高，且在當(dāng)Lactobacillus plantarumFM-LP-9、Lactobacillus plantarumSD-7和Lactobacillus alimentariusFM-MM4 3株菌接種比例為1:1:1時，豇豆的色澤飽和度、硬度、咀嚼性和感官評分表現(xiàn)出最大值。綜合研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三株菌間以1:1:1復(fù)合制備功能發(fā)酵劑，功能特性及淺漬豇豆的品質(zhì)都表現(xiàn)最優(yōu)。研究成果將為淺漬發(fā)酵豇豆的品質(zhì)、縮短淺漬發(fā)酵周期和工業(yè)化生產(chǎn)提供復(fù)合功能發(fā)酵劑，同時為豇豆接種淺漬發(fā)酵工業(yè)化提供理論依據(jù)和應(yīng)用指導(dǎo)。