飼喂干酪乳桿菌K17對加州鱸魚肌肉滋味的影響

王勁松，張昌桌，陳 燕，朱卓英，付惠玉，陳蘭明,

（1.荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門 448000；2.荊門市公共檢驗檢測中心，湖北荊門 448000；3.荊門市農業(yè)綜合執(zhí)法支隊，湖北荊門 448000；4.上海海洋大學食品學院，上海 201499）

隨著加州鱸魚養(yǎng)殖密度的增加，其肌肉品質隨之下降[1]。在加州鱸魚小分子滋味成分中，氨基酸、核苷酸等[2]是最主要的成分，各種滋味物質之間相互影響，共同形成了加州鱸魚的獨特滋味。為適應消費者和市場需求，改善養(yǎng)殖加州鱸魚肉質滋味，提高肌肉游離氨基酸、核苷酸含量，進一步改善加州鱸魚的營養(yǎng)品質具有重要意義[3]。

養(yǎng)殖的加州鱸魚肌肉的品質受飼料種類和攝入量的影響，肌肉品質主要由飼料的質量決定[4]。研究表明，改變飼料中蛋白源、脂肪源等營養(yǎng)成分或添加飼料添加劑對魚肌肉質構和肌肉中游離氨基酸、核苷酸、膠原蛋白等營養(yǎng)成分有一定的改善作用[5-8]。近年來，乳桿菌、芽孢桿菌等益生菌作為飼料添加劑在加州鱸魚養(yǎng)殖中備受關注，但其有關研究大多集中在提高魚類免疫力[9-12]、促進生長[9-12]以及對魚蝦類肌肉中基本營養(yǎng)素含量的調節(jié)[5-8]等方面。在飼料中添加芽孢桿菌、酪酸梭菌（Clostridium butyricum）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等益生菌對動物肌肉的咀嚼性、持水性和硬度等質構特性和營養(yǎng)成分（如脂肪酸含量組成）等方面有改善作用[13-14]，例如，曹洪忠等報道，通過飼料中添加β-葡聚糖和枯草芽孢桿菌喂養(yǎng)彭澤鯽70 d，明顯改善了它肉質的硬度、彈性、粘聚性、無膠性、咀嚼性和恢復力[15]。楊剛等也報道飼料中添加109CFU/kg的枯草芽孢桿菌喂養(yǎng)鯽魚70 d，顯著改善了鯽魚的抗氧化能力，提升了肉質的硬度、無膠性、咀嚼性和恢復力[15]。同時夏雨等研究證明飼料中添加3株植物乳桿菌和3株副干酪乳桿菌飼養(yǎng)凡納濱對蝦幼蝦28 d，3株植物乳桿菌顯著地改善了肌肉彈性和咀嚼性，3株副干酪乳桿菌能顯著改善肌肉的脂肪酸組成[5]。

飼料中添加抗氧化劑羥脯氨酸改善了大黃魚的肉質，提高了大黃魚的抗氧化酶活性，進而促進了膠原蛋白的合成，并且其肉質的硬度、彈性和咀嚼性與肌肉中總膠原蛋白有顯著正相關性[16]。Kalavathy等[17]研究發(fā)現，雞飼料中添加4種不同乳桿菌混合物能增加不飽和脂肪酸含量，減少膽固醇水平。肉質中增加的不飽和脂肪酸可能是因為飼料中添加的抗氧化劑保護的效果，因為這些抗氧化劑作為電子供體，為某些不飽和脂肪酸的還原提供了電子[18]?？梢婏暳现刑砑涌寡趸瘎┛梢愿纳迫赓|的質構和滋味。實驗室前期從傳統發(fā)酵食品朝鮮泡菜中篩選出一種體外抗氧化性較強的干酪乳桿菌K17[19]，將不同劑型干酪乳桿菌K17添加到加州鱸魚飼料中，發(fā)現干酪乳桿菌K17能增強加州鱸魚體內抗氧化性，調節(jié)加州鱸魚腸道菌群結構和代謝功能[20]，并能促進加州鱸魚快速生長且改善其肝臟健康和肉質[21]。目前還未有報道干酪乳桿菌對魚類滋味物質影響的研究。本實驗將具有較強抗氧化性的干酪乳桿菌K17添加到加州鱸魚飼料中喂養(yǎng)69 d后，分析其對加州鱸魚肌肉中呈味氨基酸及呈味核苷酸之間的影響，對它們的組成及含量進行分析，并計算其味道強度值（Taste active values, TAV）和味精當量（Equivalent umami concentrations, EUC），同時借助電子舌，探究飼喂干酪乳桿菌K17對滋味物質的影響，為益生菌在加州鱸魚養(yǎng)殖中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

加州鱸魚（100日齡） 湖州市胖子淡水魚繁殖基地；干酪乳桿菌K17 實驗室保存；飼料，浙江東裕生物科技有限公司；三氯乙酸、高氯酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、三氯叔丁醇、NaOH、KOH 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；肌苷酸（Inosinic acid，IMP）、腺苷酸（Adenosine monophosphate，AMP）和鳥苷酸（Guanylic acid，GMP）標注溶液（三者純度均不小于99%）、氨基酸混合標準溶液美國Sigma-Aldrich公司。

SB25-12DT超聲清洗儀 寧波新藝超聲設備有限公司；FJ200-SH數顯高速分散均質機 上海標本模型廠；PL2002梅特勒-托利多精密天平 METTLER TOLEDO，Zurich，瑞士；5424高速冷凍離心機Eppendorf，Hamburg，德國；L-8800氨基酸全自動分析儀 日本Hitachi公司；W2690/5高效液相色譜儀

美國Waters公司；ASTREE電子舌 法國Alpha MOS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗飼料制備 在本研究中，商業(yè)飼料被用作飼喂加州鱸魚的基礎飼料。根據先前描述的方法制備了六種實驗飼料（表1）[22]。從實驗室凍存管中接種干酪乳桿菌K17到5 mL無菌MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)18 h至對數生長中期，隨后，在4 ℃條件下3000×g離心10 min收集其細胞，用無菌氯化鈉（0.85%）將細胞沉淀洗滌兩次，并將其稀釋至

表1 本研究中飼喂加州鱸魚的六種試驗飼料Table 1 Six experimental diets for feeding M.salmoides in this study

1×109CFU/mL（使用菌落計數法測定）[23]。同時，將上清液用0.22 μm孔徑過濾器除去殘留的細菌細胞，得到的上清液用作FS組添加物。將1×109CFU/mL活細胞菌液在65 ℃下加熱30 min，得到熱滅活的干酪乳桿菌K17細胞，用作DB組添加物。然后將

1×109CFU/mL活細胞菌液添加10%脫脂奶粉[24]，作為MB添加物。將得到的30 mL干酪乳桿菌K17菌液在超凈工作臺中的無菌矩形托盤中分別均勻地噴涂到300 g基礎飼料中，用無菌采樣袋封裝后在4 ℃下儲存，并在7 d內使用完。每周使用菌落計數法檢查制備的飼料中的干酪乳桿菌K17濃度[23]。FS、MG和SG飼料制備方法與上述相同。

1.2.2 加州鱸魚的培養(yǎng)條件 參照Wang等[20]方法飼喂加州鱸魚。將購買的800條加州鱸魚在中國上海海洋大學水產動物遺傳育種中心上海市協同創(chuàng)新中心的三個室內水泥池（5.0 m×3.0 m×1.8 m）中暫養(yǎng)兩周，期間采用商業(yè)飼料進行飼養(yǎng)。隨后，將挑選出來大小均一的450尾加州鱸魚（平均（33.0±0.5）g）隨機分配至18個網箱，網箱大小為1.5 m×1.0 m×1.8 m，每個網箱分配25條。試驗設計了六個處理組（表1），每個處理組均進行了三次重復（籠）試驗。飼養(yǎng)期間，每天投喂2次（上午06:00～07:30和下午17:00～18:30），飼養(yǎng)試驗進行了69 d。每日飼喂量約為加州鱸魚平均體重的4%，并每周進行調整以確保魚在飼喂后1 h內吃完分配的飼料，每天記錄所消耗的飼料量。

1.2.3 樣品采集 在喂養(yǎng)實驗完成后，所有處理組的加州鱸魚被禁食12 h，記錄每個網箱中魚的數量及總重量。從每個網箱中隨機挑選3條中等大小的魚，用丁香酚麻醉至魚微微側翻。收集魚背側左邊的魚片樣本，分析其游離氨基酸和呈味核苷酸含量。

1.2.4 電子舌分析 參考周紛等[25]的方法測定電子舌數據。稱取剁碎的鱸魚背肉（2.00 g）于離心管中，加入25 mL去離子水在均質機中均質2 min以提取水溶性成分，室溫靜置15 min，4 ℃下以10000 r/min離心（10 min），過濾取上清液定容至100 mL。此后，吸取5 mL該溶液稀釋40倍，然后用于電子舌分析。在分析樣品之前，對電子舌的傳感器進行調節(jié)（0.01 mol/L鹽酸），校準（0.01 mol/L鹽酸）。在成功校準后，對每個時間點背肉樣品進行7次分析，主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）是取后3次的數據。

1.2.5 游離氨基酸測定 參考付娜等[26]方法測定游離氨基酸。稱取樣品2.0 g，加入質量分數為15%的三氯乙酸溶液15 mL，勻漿2 min后，靜置2 h，以10000 r/min離心（15 min），過濾后取5 mL上清液，調節(jié)（3 mol/L的NaOH溶液）pH至2.0，定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm膜，濾液上機檢測。操作均在4℃條件下進行。氨基酸自動分析儀條件：色譜柱（4.6 mm×150 mm，7μm）；柱溫 50 ℃；1 通道流速：0. 4 mL/min，2通道流速：0. 35 mL/min。流動相：檸檬酸鈉和檸檬酸的混合緩沖液（pH為3.2、3.3、4.0、4.9）以及茚三酮緩沖液（質量分數為 4%）。

1.2.6 呈味核苷酸測定 參考Chen等[27]方法測定核苷酸。稱取樣品5.0 g置于50 mL離心管中，加入10 mL質量分數為10%的HClO4，均質（2 min），以10000 r/min離心（15 min），過濾后取上清液。用5 mL質量分數為5%的HClO4洗滌沉淀，再次離心，合并上清液。調節(jié)上清液pH（pH=6.5），靜置（30 min）迅速定容至50 mL，搖勻，過0.45 μm膜待測。操作均在4 ℃條件下進行。高效液相色譜條件：ODS-SP C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），ODS-SP保護柱柱芯（4 mm×10 mm，5 μm）；流動相A為pH是6.5的0.05 mol/LKH2PO4和K2HPO4（1:1）溶液，流動相B為甲醇溶液，等梯度洗脫（流速1 mL/min）；柱溫28 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

1.2.7 味道強度值（TAV）和味精當量（EUC） 滋味物質的TAV是滋味物質的絕對濃度值除以它的味道閾值，計算公式如下：TAV=C/T。式中，TAV：味道強度值；C：滋味物質的絕對濃度值，mg/100 g；T：滋味物質的味道閾值，mg/100 g。參照Chen等[27]的方法計算EUC，通過計算鮮味氨基酸和呈味核苷酸的質量分數獲得。計算公式如下：EUC =Σaibi+1218（Σaibi）（Σajbj）。式中：EUC按樣品所含谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）質量分數計，%；ai為鮮味氨基酸（Asp、Glu）質量分數，%；bi為鮮味氨基酸相對于MSG的相對鮮度系數（Glu為1，Asp為0.077）；aj為呈味核苷酸（IMP、AMP）質量分數，%；bj呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數（IMP為1，AMP為0.18）；1218為協同作用系數。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0版軟件進行統計分析，使用單因素方差分析和Duncan新復極差法分析顯著性，結果以平均值±標準誤差表示，P＜0.05[28]。

2 結果與分析

2.1 電子舌分析

由圖1可知，利用電子舌傳感器響應值數據建立二維圖，進行主成分分析，PC1為63.411%，PC2為32.204%，累計為95.615%，說明PC1和PC2能夠反映樣品的整體信息。從圖1可看出，各處理組與對照組SG分布區(qū)域無重疊，說明處理組與對照組的味覺均有一定差異。6組樣品中FS組和MB組樣品分布區(qū)域有點重疊，說明兩者在味覺特征上較為相似，不能完全區(qū)分，而且兩者與對照組分布區(qū)域相隔最遠，說明兩者與對照組差異最明顯；DB組、MG組、LB組樣品分布區(qū)域較為接近，但未重疊，在一定程度下可以區(qū)分，說明三組之間味覺有一定差異。提取電子舌各傳感器響應值數據進行判別因子分析（Discriminant factor analysis，DFA）。DFA分析是在PCA基礎上，對滋味的響應信號數據優(yōu)化處理，更好地將不同副產物區(qū)分開，分析結果由圖2所示。六邊形的6個點為該組重復樣品，第一主成分和第二主成分的累計貢獻率達到90.651%，因此可以較全面地代表樣品原有信息。另外， LB組和MG組樣品與對照組SG組所在區(qū)域有所重疊，不易區(qū)分，說明LB組和MG組與對照組SG滋味差異較??；MB組、DB組、FS組樣品所在區(qū)域無重疊，易區(qū)分；FS組和MB組分布區(qū)域相近，但與對照組SG相距較遠，說明FS組和MB組滋味接近且與對照組SG滋味差異最為明顯，可能滋味物質的形成與飼料中添加的活菌數和菌落代謝物相關。

通過電子舌各個傳感器的響應值，建立不同樣品的滋味雷達圖（圖3）。從圖3中可知，6組樣品在苦味（BRS）、復合味1（GPS）、復合味2（SPS）、鮮味（UMS）的差異較明顯；酸味（SRS）上幾乎無差異，各滋味相對大小排列如下：鮮味（UMS）：MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG；甜味（SWS）：MG＞LB＞DB＞FS＞MB＞SG；苦味（BRS）：FS＞MG＞MB＞LB＞DB＞SG，SG組在除復合味2（SPS）外的其余6項味覺特征響應值都為最低，這與PCA分析結果類似，說明飼料中添加不同形式干酪乳桿菌K17，對加州鱸魚滋味有一定影響。

圖 1 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料的加州鱸魚肌肉電子舌PCA分析圖Fig.1 PCA analysis of electronic tongue of muscle of M. salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

圖 2 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料的加州鱸魚肌肉電子舌DFA分析圖Fig.2 DFA analysis of electronic tongue of muscle of M. salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

圖 3 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料的加州鱸魚肌肉滋味雷達圖Fig.3 Taste radar map of electronic tongue of muscle of M.salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

2.2 游離氨基酸含量測定

氨基酸可以增強食品的滋味特性，也可以間接參與滋味的形成[29-30]。不同的游離氨基酸之間以及氨基酸與IMP等其他成分之間存在相互協同作用[31]。由表2得知，6組加州鱸魚肌肉中檢測出16種游離氨基酸，Ala在各組均未檢出，各組游離氨基酸總量差異不顯著。從鮮味氨基酸水平來看，MB組鮮味氨基酸總量和Asp含量顯著高于SG組（P＜0.05），鮮味氨基酸總量的大小順序為：MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG，與電子舌預測的鮮味順序一致。從甜味氨基酸來看，Thr、Ser、Pro、Gly和SFA處理組和對照組差異不顯著。從苦味氨基酸來看，FS組Val、Ile、Leu、Phe和BRS含量顯著高于對照組SG（P＜0.05），苦味氨基酸總量的大小順序為：FS＞MG＞MB＞DB＞LB＞SG，與電子舌預測的苦味順序基本一致。

表2 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料對加州鱸魚肌肉游離氨基酸的影響Table 2 Effects of six different groups of Lactobacillus casei K17 feeds on free amino acids in muscle of M. salmoides

當TAV值大于1時，該物質TAV值與樣品的呈味成正比[32]。根據表3，只有Gly與His的TAV值大于1，各組Gly的TAV值都在3以上，各組的His的TAV值都在6以上。Gly為甜味氨基酸，對魚蝦等水產品的鮮味有重要貢獻[33-34]。Gly不僅能提供清香甜味，還能減少苦味，并能從食物中除去令人不快的口味[35]。含雜環(huán)基團的His被認為是肉香味形成的關鍵物質[36]?？梢?，從TAV來看，His和Gly是影響加州鱸魚肌肉滋味的重要氨基酸。

表3 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料對加州鱸魚肌肉游離氨基酸TAV的影響Table 3 Effects on TAV of free amino acids in muscle of M. salmoides in the six groups

由圖4得知，與對照組相比，各組的必需氨基酸總量與游離氨基酸總量都得到了提升，MG組的必需氨基酸總量為2.33 mg/100 g，增加量最大，且與SG組差異顯著（P＜0.05），可能是MG組飼料中添加的脫脂奶粉含有豐富的蛋白質，其在鱸魚體內被充分吸收后轉化成必需氨基酸。各處理組游離氨基酸總量雖有一定提升，但是與對照組無顯著差異，這與王四新等[37]對于北京黑豬飼喂干酪乳桿菌所測得游離氨基酸總量結果與對照組存在顯著（P＜0.05）差異不同，這可能是魚類與畜類的腸道菌群結構不同，益生菌對兩種不同的動物作用效果存在差異，此外，也有可能是益生菌種類不同，飼養(yǎng)環(huán)境存在差異的結果，有待于進一步研究。

圖 4 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料對加州鱸魚肌肉游離氨基酸總量和必需氨基酸總量的影響Fig.4 Effects on essential amino acid and free amino acids and in muscle of M. salmoides in the six groups

2.3 呈味核苷酸、TAV和EUC值測定

核苷酸及其關聯化合物是影響水產品滋味的另一類重要成分，其中，GMP、IMP和AMP是典型的呈鮮味的核苷酸[38]，效果優(yōu)于MSG，并且它們在呈鮮味方面存在協同效應[7]。呈味核苷酸含量見表4。由表3可知，MB組的IMP和GMP值與SG組相比均有顯著增加（P＜0.05），各組IMP的TAV值大小順序為MB＞DB＞MG＞LB＞FS＞SG，GMP的TAV值大小順序為MB＞DB＞LB＞MG＞FS＞sSG，且均大于1，說明各組的IMP和GMP對鱸魚肌肉鮮味有顯著貢獻，且MB組的鮮味最大，與對照組相比差異明顯。因為脫脂奶粉對干酪乳桿菌K17的保護，使其在鱸魚腸道中存活率最高，產生了一系列的小分子代謝物（包括IMP和GMP），這部分物質進一步被肌肉組織吸收，增加了鱸魚肌肉的鮮味。MB組AMP含量在100 mg/g以上時，鮮味逐漸增強，甜味逐漸減弱[39]。各組AMP含量均大于100 mg/g，AMP的TAV值均大于1，且FS＞DB＞MB＞MG＞LB＞SG，說明各組AMP對鮮味特征貢獻較大而對甜味特征貢獻較弱，且FS組的AMP最大，但各組之間差異不顯著。呈味氨基酸與呈味核苷酸同時存在能顯著提高食品的鮮味，即產生協同效應。因此為了更加全面地評價加州鱸魚的鮮味，可采用EUC值來評價鮮味強度[32]。本研究根據6個處理組加州鱸魚肌肉鮮味氨基酸和呈味核苷酸的數值計算出各組的EUC值，如表4所示。MB組的EUC值最大，與對照組相比差異顯著，6組EUC呈現為MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG，與電子舌測定大小值一致，可見EUC是量化魚肌肉鮮度的推薦指標。其中味精呈味閾值為0.03%，MB中EUC為2.93%相當于100 g碎肉和頭肉中所具有的鮮味強度相當于2.93 g味精產生的鮮味，其值遠高于味精的閾值。結合EUC來看，MB組的EUC增加最明顯，且與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其原因可能是添加脫脂奶粉保護劑的干酪乳桿菌，在飼料和進入加州鱸魚腸道中活菌數更高，該活菌在魚腸道中能調節(jié)腸道中營養(yǎng)物質代謝，進而在魚體內產生部分鮮味物質，這與在北京黑豬飼料中添加干酪乳桿菌后其鮮味氨基酸總量顯著高于未加干酪乳桿菌組的結果一致[37]。綜合TAV值與EUC值，MB組的鮮味增強最為明顯。

表4 飼喂6組不同干酪乳桿菌K17飼料對加州鱸魚肌肉呈味核苷酸、TAV和EUC值的影響Table 4 Effects on taste nucleotides, TAV and EUC in muscle of M. salmoides in the six groups

3 結論

6組加州鱸魚肌肉中檢測出16種游離氨基酸，MB組鮮味氨基酸總量、Asp含量和EUC顯著高于SG組（P＜0.05），6組的鮮味氨基酸總量、苦味氨基酸總量和EUC的大小順序均與電子舌預測的順序基本一致。因此飼喂干酪乳桿菌K17不同劑型對加州鱸魚滋味成分和含量的影響存在明顯差異， MB組飼料對加州鱸魚肌肉整體滋味貢獻最大，這可為干酪乳桿菌K17在加州鱸魚養(yǎng)殖中應用提供參考。另外，本文雖對飼喂干酪乳桿菌K17不同劑型對加州鱸魚滋味成分和含量進行了測定和分析，但是導致這些差異的具體原因需要進一步的實驗驗證。