四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶等溫擴(kuò)增技術(shù)快速聯(lián)檢四種難鑒別蚊媒病毒的效果觀察

韓明月 林源吉 吳新新 魏晨星 董學(xué)妍 王曉明 萬海同 余道軍

蚊蟲是地球上對人類健康危害最為嚴(yán)重的動物之一，作為疾病的傳播媒介可引起多種蚊媒傳染病[1]。流行于亞洲、非洲及南美洲地區(qū)的登革熱[2]、寨卡、基孔肯雅熱、黃熱病[3]等蚊媒傳染病在我國亦時有發(fā)生，這4種典型蚊媒傳染病臨床癥狀相似，均可表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛、厭食、乏力等[4]，給臨床診斷和鑒別診斷帶來一定困難。因此對蚊媒傳染病中登革病毒（dengue fever virus,DENV）、黃熱病毒（yellow fever virus,YFV）、基孔肯雅病毒（chikungunya virus,CHIKV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）4種臨床難鑒定病原體進(jìn)行快速聯(lián)合檢測及鑒別診斷意義重大。近年來，除了傳統(tǒng)的診斷方法，如血清學(xué)、病毒分離培養(yǎng)等外，分子生物學(xué)方法在病毒性疾病的診斷中得到了廣泛應(yīng)用，常見的分子生物學(xué)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、核酸分子雜交、DNA測序、等溫擴(kuò)增技術(shù)等，近年來等溫擴(kuò)增技術(shù)因其簡便、快速、精確、低成本的優(yōu)勢，在分子生物學(xué)診斷技術(shù)中越來越重要[5-10]，重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification,RPA）技術(shù)是一種建立較晚的等溫擴(kuò)增方法，被認(rèn)為是一種可以替代PCR的技術(shù)[11-12]。目前，基于等溫擴(kuò)增技術(shù)同時檢測多種蚊媒病毒的研究報道較為少見[13-14]。本研究以登革熱、黃熱病、基孔肯雅熱、寨卡的病原體為研究對象，基于RPA技術(shù)實(shí)現(xiàn)4種典型輸入性蚊媒病毒聯(lián)合檢測[15-17]，建立針對DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（quadruple reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA）檢測方法，旨在加快檢測速度，提高檢測靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本、儀器和試劑 本研究使用的臨床血清樣本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心提供，包含DENV-1型5例、DENV-2型 5例、DENV-3型5例、DENV-5型5例，所有標(biāo)本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心確認(rèn)為DENV陽性。含有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV靶基因的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品和體外合成RNA樣本由杭州邦唯生物科技有限公司合成。ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀（型號：7500）購自美國 ABI公司，TwistAmp Liquid Exo Kit（批號：153689）購自英國TwistDX公司，WarmStart RTx（批號：M0380L）購自美國NEB公司。所有引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：KY-20211105-0083-01）。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計 在NCBI上檢索DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的基因序列，應(yīng)用Clustalw軟件對所有序列比對分析，選取各自同源性高的保守序列，根據(jù)TwistAmpRDNA Amplification Kits Assay Design Manual進(jìn)行引物和探針設(shè)計，作為待檢靶基因特異性核酸序列的引物和探針，登錄NCBI通過BLAST程序比對分析，每種病毒設(shè)計3對不同的引物和相應(yīng)的特異探針，見表1。

表1 引物和探針序列

1.2.2 單重RT-RPA體系建立及引物篩選 50 μl RT-RPA 反應(yīng)體系包括：2×反應(yīng)緩沖液 25 μl，dNTPs 5 μl，10×Probe E-mix 5 μl，正向引物 F（10 μmol/L）2.1 μl，反向引物 R（10 μmol/L）2.1 μl，探針（10 μmol/L）0.6 μl，20× Core Reaction Mix 2.5 μl，50×Exo（每個反應(yīng)）1 μl，WarmStart RTx 1 μl（當(dāng)模板為RNA時加入），MgOAc（280 mmol/L）2.5μl，模板1 μl（質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA或體外合成RNA），ddH2O補(bǔ)至50 μl。反應(yīng)條件：40 ℃，30 min。采用上述建立的反應(yīng)體系對DENV、YFV、CHIKV及ZIKV的引物進(jìn)行篩選，DENV、YFV及ZIKV的引物有9種不同的排列組合方式，CHIKV的引物有6種不同的排列組合方式（預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示R1不適用），根據(jù)熒光信號和擴(kuò)增曲線的變化確定最合適的引物組合。

1.2.3 四重RT-RPA體系的建立 在上述建立的RT-RPA體系基礎(chǔ)上建立四重RT-RPA體系，通過正交設(shè)計對四重RT-RPA體系進(jìn)行了優(yōu)化，包括引物濃度、反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix濃度和 50×Exo濃度、10×Probe E-mix濃度、探針濃度、模板濃度，每個因素設(shè)置高低不同的4個水平，所有因素分成3組進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果及熒光信號和擴(kuò)增曲線的變化確定最佳反應(yīng)條件和最合適的反應(yīng)體系（WarmStart RTx按照試劑說明書加入1 μl后，四重RT-RPA熒光信號強(qiáng)、擴(kuò)增曲線良好，故WarmStart RTx用量未做優(yōu)化）。

1.2.4 單重及四重RT-RPA的特異度、靈敏度試驗(yàn)將已知拷貝數(shù)的含DENV、YFV、CHIKV、ZIKV目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋至濃度在 1×101～1×108Copies/ml作為單重RT-RPA 的模板；將 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA按1∶1∶1∶1混合后進(jìn)行10倍倍比稀釋成 1×101～1×108Copies/ml，作為四重 RT-RPA的模板。取不同載量的模板1 μl（質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA），用滅菌注射用水做對照實(shí)驗(yàn)，按照上述確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件對各稀釋度模板進(jìn)行單重及四重RT-RPA檢測，所有檢測標(biāo)本至少檢測3次，確定該方法的檢測靈敏度。同時應(yīng)用上述建立的4種病毒各自的單重及四重反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以臨床巨細(xì)胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒核酸及DENV、YFV、CHIKV、ZIKV病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA為模板，同時設(shè)置陰性對照和空白對照，對上述建立的單重及四重RTRPA反應(yīng)體系的特異度進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性試驗(yàn) 將已知拷貝數(shù)的DENV、YFV、CHIKV、ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液或體外合成RNA混合液（1×105Copies/ml）平均分成10份，-20℃冷凍保存作為模板，按上述實(shí)驗(yàn)建立的四重RT-RPA反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，最后分析檢測結(jié)果[閾值時間（threshold time,TT）]的重復(fù)性，以變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）表示[19]。

1.2.6 臨床標(biāo)本驗(yàn)證 取經(jīng)RT-PCR確認(rèn)的臨床確診登革熱患者的20份血清樣本和30份陰性血清樣本，使用單重RT-RPA及四重RT-RPA方法對標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與臨床實(shí)驗(yàn)室在用的實(shí)時熒光RT-PCR方法的檢測結(jié)果相比較，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的可靠性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用方差分析計算反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果；計算單重RT-RPA和四重RT-RPA與RT-PCR法的診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value,PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value,NPV）。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選結(jié)果 根據(jù)單重RT-RPA的擴(kuò)增曲線，DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的最佳引物組合分別為：DENV-F2/DENV-R1，YFV-F2/YFV-R3，CHIKV-F2/CHIKV-R3和 ZIKV-F2/ZIKV-R1。

2.2 四重RT-RPA反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 引物加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV引物加入量的不同對四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果的影響不同（FDENV=9.976，P＜0.05），而 YFV、CHIKV、ZIKV 引物加入量的不同對四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果的影響不明顯（FYFV=0.431、FCHIKV=0.416、FZIKV=1.644，均 P ＞0.05）。

2.2.2 反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix及50×Exo加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV不同反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix 及 50×Exo加入量對四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果TT值的影響不同（FDENV=4.883、FYFV=6.873、FCHIKV=20.746、FZIKV=15.293，均P＜0.05）。

2.2.3 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量及探針濃度的優(yōu)化結(jié)果 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量、探針濃度對四重RT-RPA擴(kuò)增結(jié)果TT的影響不明顯（F=1.083、3.453、1.191，均 P ＞0.05）。

2.2.4 確定四重RT-RPA反應(yīng)體系 結(jié)合2.2.1至2.2.3的結(jié)果，確定最終的60 μl的四重RT-RPA反應(yīng)體系：2×反應(yīng)緩沖液 25 μl，dNTPs 4.8 μl，10× Probe E-mix 5 μl，正向引物 F（10 μmol/L）2.1 μl，反向引物R（10 μmol/L）2.1 μl，探針（10 μmol/L）0.6 μl，20×Core Reaction Mix 2.5 μl，50×Exo 1.5 μl，WarmStart RTx 1 μl（當(dāng)模板為 RNA 時加入），MgOAc（280 mmol/L）3.0 μl，模板 1 μl，ddH2O 補(bǔ)至 60 μl；反應(yīng)條件：42 ℃，30 min。

2.3 單重及四重RT-RPA的特異度 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV之間以及與其他多種常見病毒之間不存在交叉反應(yīng)，只有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV產(chǎn)生了陽性擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增曲線較為平滑。巨細(xì)胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等均未產(chǎn)生陽性擴(kuò)增曲線，呈陰性反應(yīng)，見圖1-2。

圖1 單重RT-RPA特異性試驗(yàn)圖

圖2 四重RT-RPA特異性試驗(yàn)圖（a、b、c、d分別為四重RT-RPA僅加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV中的一種時的特異性試驗(yàn)圖；e為四重RT-RPA同時加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV時的特異性試驗(yàn)圖）

2.4 單重及四重RT-RPA的靈敏度 RT-RPA對DENV、ZIKV、CHIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102Copies/ml，對YFV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限＜1×102Copies/ml，對 DENV、YFV、CHIKV 和 ZIKV 體外合成 RNA 的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml，見圖 3-4；四重RT-RPA對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml，對體外合成 RNA 標(biāo)本的檢出限分別為 5×102、5×102、5×102、5×102Copies/ml，見圖5-6。

圖3 單重RT-RPA檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗(yàn)

圖4 單重RT-RPA檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗(yàn)

圖5 四重RT-RPA檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗(yàn)

圖6 四重RT-RPA檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗(yàn)

2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果 RT-RPA法TT值的CV為1.76%～5.96%，見表2。

表2 四重RT-RPA的重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.6 臨床標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果 50份血清樣本中，RT-PCR及單重RT-RPA法將20份DENV陽性樣本全部檢出，陽性標(biāo)本檢出率均為100.00%，四重RT-RPA檢測DENV陽性19份，陽性標(biāo)本檢出率為95.00%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，單重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR對DENV檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 DENV臨床標(biāo)本不同檢測方法的靈敏度、特異度、PPV和NPV比較

3 討論

本研究開發(fā)了一種四重RT-RPA方法，該方法在單個反應(yīng)中包含4對引物和相應(yīng)的探針，用于單獨(dú)或同時檢測4種蚊媒病毒，通過對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV基因的檢索及序列比對，選擇相對保守的區(qū)域進(jìn)行了引物和探針的設(shè)計，為了獲得最佳的擴(kuò)增效果，本研究中使用的引物長度均為32～34 bp，并通過對不同引物組合方式的篩選實(shí)驗(yàn)為每種病毒選擇了最佳的引物組合。

本研究采用正交設(shè)計對反應(yīng)體系（包括反應(yīng)溫度、Mg2+濃度和50×Exo加入量等）進(jìn)行了優(yōu)化。合適的反應(yīng)溫度是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素之一，RPA技術(shù)的推薦反應(yīng)溫度為37～42℃，以往的研究表明，RPA可以在15～50℃進(jìn)行[20]。較高的反應(yīng)溫度可以避免非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，因此對于四重RT-RPA，較高的反應(yīng)溫度更適合，于是本研究在38、40、42℃進(jìn)行了四重RT-RPA，并最終確定四重RT-RPA的最佳反應(yīng)溫度為42℃。Mg2+可以與dNTPs和核酸骨架相互作用，影響聚合酶分子生物學(xué)檢測技術(shù)的活性，因此Mg2+的濃度對擴(kuò)增效率有很大影響，Mg2+濃度過高會降低擴(kuò)增的特異度，Mg2+濃度過低會影響擴(kuò)增的產(chǎn)物獲得率。同樣，單重及四重RT-RPA反應(yīng)中也需要加入Mg2+，且Mg2+加入后RT-RPA反應(yīng)立即開始，經(jīng)過上述的正交實(shí)驗(yàn)，單重RT-RPA中加入MgOAc 14 mmol/L或四重RT-RPA中加入16.8 mmol/L時，反應(yīng)結(jié)果最佳。在單重及四重RT-RPA反應(yīng)體系中，逆轉(zhuǎn)錄酶對擴(kuò)增效率較為關(guān)鍵，因此，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報道[21-22]，選擇逆轉(zhuǎn)錄效果較好的WarmStart RTx作為逆轉(zhuǎn)錄酶，研究結(jié)果表明，該酶逆轉(zhuǎn)錄效果好，在實(shí)際說明書推薦的用量（1 μl）情況下即能滿足實(shí)驗(yàn)要求，故未對該酶用量進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

本研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的單重RT-RPA方法和四重RT-RPA方法具有較高的靈敏度、特異度和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)表明，該單重及四重RT-RPA法不與其他常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，且可以在背景核酸存在的情況下擴(kuò)增靶核酸，但背景核酸的存在對擴(kuò)增的靈敏度有一定的影響，背景核酸濃度越高，檢測的靈敏度越低。研究表明，RPA反應(yīng)體系中所用引物、探針和靶序列的選擇會影響其自身對背景核酸的耐受性[23]。在該四重RTRPA體系中，共有4對引物和4個探針，引物之間可以形成二聚體，但由于本研究中使用了探針法，二聚體的形成對擴(kuò)增信號沒有顯著影響，但引物和探針數(shù)量的增加可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)或競爭性擴(kuò)增，影響部分引物的擴(kuò)增效率，本研究結(jié)果也表明引物探針用量對四重RT-RPA影響不明顯，但在四重RT-RPA中，背景核酸的存在對擴(kuò)增的靈敏度產(chǎn)生了一定影響，從而導(dǎo)致四重RT-RPA的靈敏度略低于單重RT-RPA。

本研究建立的針對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的單重RT-RPA和四重RT-RPA檢測方法雖然具有良好的特異度、靈敏度和重復(fù)性。但也存在一定的不足，目前的工作仍然需要昂貴的實(shí)時熒光PCR儀器，因此本研究建立的檢測方法目前尚不適合資源貧乏的地區(qū)，筆者團(tuán)隊(duì)正在嘗試開發(fā)一種更便攜的小型檢測系統(tǒng)來滿足這些要求。此外，由于引物之間的相互干擾以及背景核酸的存在，四重RT-RPA的檢測靈敏度尚不理想。同時，由于目前傳染病防控良好，臨床標(biāo)本不足，本研究僅驗(yàn)證了登革熱臨床血清標(biāo)本，尚缺乏YFV、CHIKV和ZIKV的臨床標(biāo)本，只能以體外合成的RNA樣本作為替代物來檢驗(yàn)已建立的單重及四重RT-RPA的臨床應(yīng)用價值。雖然本研究存在以上的不足，但四重反應(yīng)體系的應(yīng)用前景是不可否認(rèn)的，本研究可為其他新發(fā)再發(fā)傳染病快速診斷及鑒別診斷方法的建立提供一定的方向。