四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)快速聯(lián)檢四種難鑒別蚊媒病毒的效果觀察

韓明月 林源吉 吳新新 魏晨星 董學(xué)妍 王曉明 萬海同 余道軍

蚊蟲是地球上對人類健康危害最為嚴重的動物之一，作為疾病的傳播媒介可引起多種蚊媒傳染病[1]。流行于亞洲、非洲及南美洲地區(qū)的登革熱[2]、寨卡、基孔肯雅熱、黃熱病[3]等蚊媒傳染病在我國亦時有發(fā)生，這4種典型蚊媒傳染病臨床癥狀相似，均可表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛、厭食、乏力等[4]，給臨床診斷和鑒別診斷帶來一定困難。因此對蚊媒傳染病中登革病毒（dengue fever virus,DENV）、黃熱病毒（yellow fever virus,YFV）、基孔肯雅病毒（chikungunya virus,CHIKV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）4種臨床難鑒定病原體進行快速聯(lián)合檢測及鑒別診斷意義重大。近年來，除了傳統(tǒng)的診斷方法，如血清學(xué)、病毒分離培養(yǎng)等外，分子生物學(xué)方法在病毒性疾病的診斷中得到了廣泛應(yīng)用，常見的分子生物學(xué)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）、核酸分子雜交、DNA測序、等溫擴增技術(shù)等，近年來等溫擴增技術(shù)因其簡便、快速、精確、低成本的優(yōu)勢，在分子生物學(xué)診斷技術(shù)中越來越重要[5-10]，重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification,RPA）技術(shù)是一種建立較晚的等溫擴增方法，被認為是一種可以替代PCR的技術(shù)[11-12]。目前，基于等溫擴增技術(shù)同時檢測多種蚊媒病毒的研究報道較為少見[13-14]。本研究以登革熱、黃熱病、基孔肯雅熱、寨卡的病原體為研究對象，基于RPA技術(shù)實現(xiàn)4種典型輸入性蚊媒病毒聯(lián)合檢測[15-17]，建立針對DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的四重逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增（quadruple reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA）檢測方法，旨在加快檢測速度，提高檢測靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本、儀器和試劑 本研究使用的臨床血清樣本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心提供，包含DENV-1型5例、DENV-2型 5例、DENV-3型5例、DENV-5型5例，所有標(biāo)本均由杭州市疾病預(yù)防控制中心確認為DENV陽性。含有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV靶基因的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品和體外合成RNA樣本由杭州邦唯生物科技有限公司合成。ABI 7500實時熒光定量PCR儀（型號：7500）購自美國 ABI公司，TwistAmp Liquid Exo Kit（批號：153689）購自英國TwistDX公司，WarmStart RTx（批號：M0380L）購自美國NEB公司。所有引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：KY-20211105-0083-01）。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計 在NCBI上檢索DENV、YFV、CHIKV、ZIKV的基因序列，應(yīng)用Clustalw軟件對所有序列比對分析，選取各自同源性高的保守序列，根據(jù)TwistAmpRDNA Amplification Kits Assay Design Manual進行引物和探針設(shè)計，作為待檢靶基因特異性核酸序列的引物和探針，登錄NCBI通過BLAST程序比對分析，每種病毒設(shè)計3對不同的引物和相應(yīng)的特異探針，見表1。

表1 引物和探針序列

1.2.2 單重RT-RPA體系建立及引物篩選 50 μl RT-RPA 反應(yīng)體系包括：2×反應(yīng)緩沖液 25 μl，dNTPs 5 μl，10×Probe E-mix 5 μl，正向引物 F（10 μmol/L）2.1 μl，反向引物 R（10 μmol/L）2.1 μl，探針（10 μmol/L）0.6 μl，20× Core Reaction Mix 2.5 μl，50×Exo（每個反應(yīng)）1 μl，WarmStart RTx 1 μl（當(dāng)模板為RNA時加入），MgOAc（280 mmol/L）2.5μl，模板1 μl（質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA或體外合成RNA），ddH2O補至50 μl。反應(yīng)條件：40 ℃，30 min。采用上述建立的反應(yīng)體系對DENV、YFV、CHIKV及ZIKV的引物進行篩選，DENV、YFV及ZIKV的引物有9種不同的排列組合方式，CHIKV的引物有6種不同的排列組合方式（預(yù)實驗顯示R1不適用），根據(jù)熒光信號和擴增曲線的變化確定最合適的引物組合。

1.2.3 四重RT-RPA體系的建立 在上述建立的RT-RPA體系基礎(chǔ)上建立四重RT-RPA體系，通過正交設(shè)計對四重RT-RPA體系進行了優(yōu)化，包括引物濃度、反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix濃度和 50×Exo濃度、10×Probe E-mix濃度、探針濃度、模板濃度，每個因素設(shè)置高低不同的4個水平，所有因素分成3組進行正交實驗，根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果及熒光信號和擴增曲線的變化確定最佳反應(yīng)條件和最合適的反應(yīng)體系（WarmStart RTx按照試劑說明書加入1 μl后，四重RT-RPA熒光信號強、擴增曲線良好，故WarmStart RTx用量未做優(yōu)化）。

1.2.4 單重及四重RT-RPA的特異度、靈敏度試驗將已知拷貝數(shù)的含DENV、YFV、CHIKV、ZIKV目的擴增片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA進行連續(xù)10倍倍比稀釋至濃度在 1×101～1×108Copies/ml作為單重RT-RPA 的模板；將 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA按1∶1∶1∶1混合后進行10倍倍比稀釋成 1×101～1×108Copies/ml，作為四重 RT-RPA的模板。取不同載量的模板1 μl（質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA），用滅菌注射用水做對照實驗，按照上述確立的反應(yīng)體系和擴增條件對各稀釋度模板進行單重及四重RT-RPA檢測，所有檢測標(biāo)本至少檢測3次，確定該方法的檢測靈敏度。同時應(yīng)用上述建立的4種病毒各自的單重及四重反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，以臨床巨細胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒核酸及DENV、YFV、CHIKV、ZIKV病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品或體外合成RNA為模板，同時設(shè)置陰性對照和空白對照，對上述建立的單重及四重RTRPA反應(yīng)體系的特異度進行驗證。

1.2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性試驗 將已知拷貝數(shù)的DENV、YFV、CHIKV、ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液或體外合成RNA混合液（1×105Copies/ml）平均分成10份，-20℃冷凍保存作為模板，按上述實驗建立的四重RT-RPA反應(yīng)體系和擴增條件進行擴增，最后分析檢測結(jié)果[閾值時間（threshold time,TT）]的重復(fù)性，以變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）表示[19]。

1.2.6 臨床標(biāo)本驗證 取經(jīng)RT-PCR確認的臨床確診登革熱患者的20份血清樣本和30份陰性血清樣本，使用單重RT-RPA及四重RT-RPA方法對標(biāo)本進行檢測，并與臨床實驗室在用的實時熒光RT-PCR方法的檢測結(jié)果相比較，進一步驗證該方法的可靠性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；采用方差分析計算反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果；計算單重RT-RPA和四重RT-RPA與RT-PCR法的診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value,PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value,NPV）。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選結(jié)果 根據(jù)單重RT-RPA的擴增曲線，DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的最佳引物組合分別為：DENV-F2/DENV-R1，YFV-F2/YFV-R3，CHIKV-F2/CHIKV-R3和 ZIKV-F2/ZIKV-R1。

2.2 四重RT-RPA反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 引物加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV引物加入量的不同對四重RT-RPA擴增結(jié)果的影響不同（FDENV=9.976，P＜0.05），而 YFV、CHIKV、ZIKV 引物加入量的不同對四重RT-RPA擴增結(jié)果的影響不明顯（FYFV=0.431、FCHIKV=0.416、FZIKV=1.644，均 P ＞0.05）。

2.2.2 反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix及50×Exo加入量的優(yōu)化結(jié)果 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV不同反應(yīng)溫度、Mg2+濃度、Core Reaction Mix 及 50×Exo加入量對四重RT-RPA擴增結(jié)果TT值的影響不同（FDENV=4.883、FYFV=6.873、FCHIKV=20.746、FZIKV=15.293，均P＜0.05）。

2.2.3 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量及探針濃度的優(yōu)化結(jié)果 核酸模板量、10×Probe E-mix加入量、探針濃度對四重RT-RPA擴增結(jié)果TT的影響不明顯（F=1.083、3.453、1.191，均 P ＞0.05）。

2.2.4 確定四重RT-RPA反應(yīng)體系 結(jié)合2.2.1至2.2.3的結(jié)果，確定最終的60 μl的四重RT-RPA反應(yīng)體系：2×反應(yīng)緩沖液 25 μl，dNTPs 4.8 μl，10× Probe E-mix 5 μl，正向引物 F（10 μmol/L）2.1 μl，反向引物R（10 μmol/L）2.1 μl，探針（10 μmol/L）0.6 μl，20×Core Reaction Mix 2.5 μl，50×Exo 1.5 μl，WarmStart RTx 1 μl（當(dāng)模板為 RNA 時加入），MgOAc（280 mmol/L）3.0 μl，模板 1 μl，ddH2O 補至 60 μl；反應(yīng)條件：42 ℃，30 min。

2.3 單重及四重RT-RPA的特異度 DENV、YFV、CHIKV、ZIKV之間以及與其他多種常見病毒之間不存在交叉反應(yīng)，只有DENV、YFV、CHIKV和ZIKV產(chǎn)生了陽性擴增曲線，且擴增曲線較為平滑。巨細胞病毒、EB病毒、HBV、丙型肝炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒等均未產(chǎn)生陽性擴增曲線，呈陰性反應(yīng)，見圖1-2。

圖1 單重RT-RPA特異性試驗圖

圖2 四重RT-RPA特異性試驗圖（a、b、c、d分別為四重RT-RPA僅加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV中的一種時的特異性試驗圖；e為四重RT-RPA同時加入DENV、YFV、CHIKV、ZIKV時的特異性試驗圖）

2.4 單重及四重RT-RPA的靈敏度 RT-RPA對DENV、ZIKV、CHIKV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102Copies/ml，對YFV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限＜1×102Copies/ml，對 DENV、YFV、CHIKV 和 ZIKV 體外合成 RNA 的檢出限分別為 1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml，見圖 3-4；四重RT-RPA對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限分別為1×102、1×102、1×102、1×102Copies/ml，對體外合成 RNA 標(biāo)本的檢出限分別為 5×102、5×102、5×102、5×102Copies/ml，見圖5-6。

圖3 單重RT-RPA檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗

圖4 單重RT-RPA檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗

圖5 四重RT-RPA檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度試驗

圖6 四重RT-RPA檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA靈敏度試驗

2.5 四重RT-RPA的重復(fù)性驗證結(jié)果 RT-RPA法TT值的CV為1.76%～5.96%，見表2。

表2 四重RT-RPA的重復(fù)性驗證結(jié)果

2.6 臨床標(biāo)本驗證結(jié)果 50份血清樣本中，RT-PCR及單重RT-RPA法將20份DENV陽性樣本全部檢出，陽性標(biāo)本檢出率均為100.00%，四重RT-RPA檢測DENV陽性19份，陽性標(biāo)本檢出率為95.00%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，單重RT-RPA、四重RT-RPA、RT-PCR對DENV檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 DENV臨床標(biāo)本不同檢測方法的靈敏度、特異度、PPV和NPV比較

3 討論

本研究開發(fā)了一種四重RT-RPA方法，該方法在單個反應(yīng)中包含4對引物和相應(yīng)的探針，用于單獨或同時檢測4種蚊媒病毒，通過對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV基因的檢索及序列比對，選擇相對保守的區(qū)域進行了引物和探針的設(shè)計，為了獲得最佳的擴增效果，本研究中使用的引物長度均為32～34 bp，并通過對不同引物組合方式的篩選實驗為每種病毒選擇了最佳的引物組合。

本研究采用正交設(shè)計對反應(yīng)體系（包括反應(yīng)溫度、Mg2+濃度和50×Exo加入量等）進行了優(yōu)化。合適的反應(yīng)溫度是實驗成功的關(guān)鍵因素之一，RPA技術(shù)的推薦反應(yīng)溫度為37～42℃，以往的研究表明，RPA可以在15～50℃進行[20]。較高的反應(yīng)溫度可以避免非特異性擴增的產(chǎn)生，因此對于四重RT-RPA，較高的反應(yīng)溫度更適合，于是本研究在38、40、42℃進行了四重RT-RPA，并最終確定四重RT-RPA的最佳反應(yīng)溫度為42℃。Mg2+可以與dNTPs和核酸骨架相互作用，影響聚合酶分子生物學(xué)檢測技術(shù)的活性，因此Mg2+的濃度對擴增效率有很大影響，Mg2+濃度過高會降低擴增的特異度，Mg2+濃度過低會影響擴增的產(chǎn)物獲得率。同樣，單重及四重RT-RPA反應(yīng)中也需要加入Mg2+，且Mg2+加入后RT-RPA反應(yīng)立即開始，經(jīng)過上述的正交實驗，單重RT-RPA中加入MgOAc 14 mmol/L或四重RT-RPA中加入16.8 mmol/L時，反應(yīng)結(jié)果最佳。在單重及四重RT-RPA反應(yīng)體系中，逆轉(zhuǎn)錄酶對擴增效率較為關(guān)鍵，因此，本研究根據(jù)文獻報道[21-22]，選擇逆轉(zhuǎn)錄效果較好的WarmStart RTx作為逆轉(zhuǎn)錄酶，研究結(jié)果表明，該酶逆轉(zhuǎn)錄效果好，在實際說明書推薦的用量（1 μl）情況下即能滿足實驗要求，故未對該酶用量進行優(yōu)化實驗。

本研究團隊開發(fā)的單重RT-RPA方法和四重RT-RPA方法具有較高的靈敏度、特異度和重復(fù)性。實驗表明，該單重及四重RT-RPA法不與其他常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，且可以在背景核酸存在的情況下擴增靶核酸，但背景核酸的存在對擴增的靈敏度有一定的影響，背景核酸濃度越高，檢測的靈敏度越低。研究表明，RPA反應(yīng)體系中所用引物、探針和靶序列的選擇會影響其自身對背景核酸的耐受性[23]。在該四重RTRPA體系中，共有4對引物和4個探針，引物之間可以形成二聚體，但由于本研究中使用了探針法，二聚體的形成對擴增信號沒有顯著影響，但引物和探針數(shù)量的增加可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)或競爭性擴增，影響部分引物的擴增效率，本研究結(jié)果也表明引物探針用量對四重RT-RPA影響不明顯，但在四重RT-RPA中，背景核酸的存在對擴增的靈敏度產(chǎn)生了一定影響，從而導(dǎo)致四重RT-RPA的靈敏度略低于單重RT-RPA。

本研究建立的針對DENV、YFV、CHIKV和ZIKV的單重RT-RPA和四重RT-RPA檢測方法雖然具有良好的特異度、靈敏度和重復(fù)性。但也存在一定的不足，目前的工作仍然需要昂貴的實時熒光PCR儀器，因此本研究建立的檢測方法目前尚不適合資源貧乏的地區(qū)，筆者團隊正在嘗試開發(fā)一種更便攜的小型檢測系統(tǒng)來滿足這些要求。此外，由于引物之間的相互干擾以及背景核酸的存在，四重RT-RPA的檢測靈敏度尚不理想。同時，由于目前傳染病防控良好，臨床標(biāo)本不足，本研究僅驗證了登革熱臨床血清標(biāo)本，尚缺乏YFV、CHIKV和ZIKV的臨床標(biāo)本，只能以體外合成的RNA樣本作為替代物來檢驗已建立的單重及四重RT-RPA的臨床應(yīng)用價值。雖然本研究存在以上的不足，但四重反應(yīng)體系的應(yīng)用前景是不可否認的，本研究可為其他新發(fā)再發(fā)傳染病快速診斷及鑒別診斷方法的建立提供一定的方向。