液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化脫細(xì)胞法構(gòu)建豬心臟瓣膜支架的研究

崔勇 梅富楊 胡志斌 葛根賢 孫高忠

心臟瓣膜病是我國常見的成人心臟病，瓣膜置換手術(shù)是目前主要的治療方法。目前臨床上應(yīng)用的人造心臟瓣膜主要有機(jī)械瓣和生物瓣兩大類，均能有效改善血流動(dòng)力學(xué)，但又各有缺陷。機(jī)械瓣置換后患者需終身抗凝，因抗凝不當(dāng)而造成的出血和血栓栓塞是影響患者長期存活的重要因素，而生物瓣置換后一般15年左右會(huì)發(fā)生衰敗，需要再次更換[1-2]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，組織工程心臟瓣膜（tissue engineered heart valve,TEHV）有望解決上述問題[3-4]。TEHV的研制涉及瓣膜支架的制備、種子細(xì)胞的選擇、細(xì)胞種植與體外預(yù)適應(yīng)等過程。瓣膜支架的制備是TEHV研究的核心內(nèi)容之一，理想的生物材料支架需具備生物相容性、抗鈣化及細(xì)胞親和性等條件[5-6]。脫細(xì)胞瓣膜是將同種異體或者異種心臟瓣膜作為TEHV的支架材料，具有瓣膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整、生物相容性好、利于內(nèi)皮細(xì)胞黏附和生長等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究通過液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化的方法，對(duì)豬心臟瓣膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，期望獲得無免疫原性、結(jié)構(gòu)完整、有抗鈣化潛能的去細(xì)胞瓣膜，為TEHV研制提供合適的支架材料。

1 材料和方法

1.1 材料和分組 成年豬（由浙江省桐鄉(xiāng)市濮院國聯(lián)商業(yè)有限公司屠宰場(chǎng)提供）宰殺后即刻（熱缺血時(shí)間10 min以內(nèi)）在清潔條件下取出主動(dòng)脈瓣膜，肉眼檢查瓣膜質(zhì)量，留取外觀正常的瓣葉，無菌操作下剪成約1 cm×1 cm的小塊，經(jīng)PBS沖洗后置入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室處理。將豬心臟瓣膜小塊按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和未處理組，平均每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 豬心臟瓣膜標(biāo)本的處理 將標(biāo)本予5次液氮凍融，每次3 min；經(jīng)PBS清洗后，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本浸入0.6%胰蛋白酶溶液，37℃搖床，消化3 d；再經(jīng)PBS清洗后浸入5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）（批號(hào)：A100227，上海生工生物工程股份有限公司）溶液中，40℃，3 d。對(duì)照組標(biāo)本經(jīng)液氮凍融后浸入5%SDS溶液中，37℃，6 d。未處理組通過液氮凍融后，浸入無菌0.9%氯化鈉溶液中，常溫，6 d。

1.2.2 瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分變化觀察 將3組豬心臟瓣膜組織標(biāo)本浸入4%多聚甲醛溶液（批號(hào)：P0099，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）中固定12 h，經(jīng)石蠟包埋、組織切片和脫蠟，經(jīng)HE（批號(hào)：C0105S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）染色后，用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察 將上述脫蠟后的組織切片，經(jīng)維多利亞藍(lán)（Victoria blue,VB）染液、麗春紅-苦味酸染液（批號(hào)：A600985，上海生工生物工程股份有限公司）染色后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 瓣膜組織殘留DNA含量檢測(cè) 將脫細(xì)胞的豬心臟瓣膜標(biāo)本真空抽干后，經(jīng)液氮研磨成粉末，取20 mg，利用 DNA提取試劑盒（批號(hào)：9765，日本 TaKaRa公司）提取DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)殘留DNA含量。

1.2.5 瓣膜組織α-Gal抗原殘留檢測(cè) 采用Western blot法。將上述的組織粉末，按100 mg組織加入30 μl RIPA溶液（批號(hào)：P0013C，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）提取組織蛋白，離心后經(jīng)BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010C）測(cè)定蛋白濃度。以30 μg蛋白作為上樣量，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入 1∶1 000稀釋的 α-Gal一抗（批號(hào)：A01135-2，武漢博士德生物技術(shù)有限公司），4℃孵育過夜；再經(jīng)1∶5 000稀釋的二抗室溫下孵育1 h；清洗后顯影。免疫印跡條帶的灰度值使用Image J軟件分析，并以上樣蛋白量為參照計(jì)算相對(duì)灰度值。

1.2.6 瓣膜組織抗鈣化潛能觀察 將脫蠟復(fù)水的組織切片，加入茜素紅染色液（批號(hào)：ST1078，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）浸染5～10 min；蒸餾水充分洗滌；經(jīng)常規(guī)水化透明后用中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組豬心臟瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分比較實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織無明顯的細(xì)胞殘留[（3.8±1.3）%]，而對(duì)照組仍有少量細(xì)胞殘留[（17.8±3.7）%]，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；未處理組可見大量的細(xì)胞殘留，見圖 1（插頁）。

圖1 3組豬心臟瓣膜組織大體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分比較（a：豬心臟瓣膜組織的大體結(jié)構(gòu)，HE染色，×200；b：3組心臟瓣膜組織細(xì)胞殘留率比較，**P＜0.01）

2.2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)組膠原纖維結(jié)構(gòu)完整，纖維束排列整齊，未見明顯破壞和斷裂；對(duì)照組膠原纖維也未受到明顯破壞，但組織略顯疏松，見圖2（插頁）。

圖2 3組豬心臟瓣膜組織膠原纖維結(jié)構(gòu)觀察（麗春紅-苦味酸染色，×200）

2.3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較 脫細(xì)胞處理后，實(shí)驗(yàn)組瓣膜組織殘留DNA含量為（55.6±16.8）μg/g，對(duì)照組瓣膜組織殘留DNA含量為（750.4±178.1）μg/g，兩組瓣膜組織殘留DNA含量均顯著低于未處理組的（7 563.1±1 169.3）μg/g（均 P＜0.01），見圖 3。

圖3 3組豬心臟瓣膜組織殘留DNA含量比較

2.4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較 與未處理組（0.61±0.07）相比，實(shí)驗(yàn)組無明顯的α-Gal抗原殘留（0.02±0.01），而對(duì)照組仍有少量 α-Gal抗原殘留（0.14±0.02），后兩組的抗原殘留均低于未處理組（均 P＜0.01），見圖 4。

圖4 3組豬心臟瓣膜組織殘留α-Gal抗原比較（a：3組標(biāo)本的α-Gal電泳圖；b：相對(duì)灰度值的比較，**P＜0.01）

2.5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較 大鼠皮下包埋2周后，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)輕微鈣化結(jié)節(jié)，平均結(jié)節(jié)數(shù)為（44±12）個(gè)/mm2；而對(duì)照組鈣化結(jié)節(jié)較多，平均結(jié)節(jié)數(shù)為（157±21）個(gè)/mm2。兩組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量均低于未處理組的（697±165）個(gè)/mm2（均P＜0.01），見圖5（插頁）。

圖5 3組豬心臟瓣膜組織抗鈣化潛能比較（a：3組豬心臟瓣膜組織的茜素紅染色所見，×200；b：?jiǎn)挝幻娣e的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)比較，**P＜0.01）

3 討論

經(jīng)典的TEHV構(gòu)建方法是按照組織工程學(xué)原理，先構(gòu)建具有心臟瓣膜形態(tài)的支架，然后在支架上種植自體活細(xì)胞，細(xì)胞在支架上生長并逐漸對(duì)原來的支架進(jìn)行改建，最終形成完全由自體細(xì)胞和基質(zhì)所構(gòu)成的瓣膜組織。目前組織工程瓣膜的發(fā)展尚需克服當(dāng)前建模材料的臨床應(yīng)用局限性，才有可能徹底改變瓣膜置換手術(shù)的現(xiàn)狀[9-10]。由于異種移植物具有幾乎無限的可用性，因此可以作為理想的供體組織類型[4]。本研究采用豬心臟瓣膜為研究對(duì)象，通過對(duì)脫細(xì)胞瓣膜的結(jié)構(gòu)完整性、免疫原性及抗鈣化等分析，明確了其作為TEHV支架材料的可行性和潛在優(yōu)勢(shì)。

支架材料為種子細(xì)胞提供一個(gè)生長、發(fā)育、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及發(fā)揮其他功能的生物學(xué)空間，同時(shí)也為鄰近細(xì)胞遷移、生長、分化提供良好的微環(huán)境，為TEHV構(gòu)建提供了細(xì)胞載體與組織結(jié)構(gòu)平臺(tái)。良好的細(xì)胞外支架應(yīng)具備生物相容性良好、表面活性利于細(xì)胞黏附與增殖、適宜的生物降解性、力學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。前期研究證實(shí)，乙酸和膠原酶方案盡管能分離出基質(zhì)成分，但會(huì)破壞機(jī)械性能[13]。真空冷凍干燥是提高脫細(xì)胞材料支架孔隙率的方法，但一些研究發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白破裂，組織機(jī)械性能有所下降[14-15]。本研究中采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化和SDS的方法，既有效清除了細(xì)胞及DNA殘留，又保證了組織結(jié)構(gòu)的完整性，是瓣膜材料的優(yōu)化脫細(xì)胞方法。

成熟TEHV的構(gòu)建需要脫細(xì)胞基質(zhì)框架支持種植細(xì)胞的生長黏附。研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是目前TEHV再細(xì)胞化的首選細(xì)胞群，但種植后細(xì)胞生長會(huì)出現(xiàn)極性缺失、排列松散、黏附力較低等問題[16-17]。因此，在脫細(xì)胞去除免疫原性的同時(shí)，不破壞基質(zhì)細(xì)胞生長黏附的性能顯得尤為重要。目前，各種類型的涂層具備良好的細(xì)胞生長特性，顯著提升脫細(xì)胞支架的細(xì)胞附著性能，如PHBHHx涂層[18]、鈦基表面納米銀復(fù)合涂層[19]、Galectin-8[20]等。本研究中采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化和SDS的方法，在基質(zhì)完整性保持方面具有較好的效果，但對(duì)于種植細(xì)胞的黏附生長等方面的特性還需進(jìn)一步研究，為生物材料的組織工程瓣膜發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本研究采用液氮凍融聯(lián)合胰蛋白酶消化對(duì)豬心臟瓣膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，可有效去除殘余細(xì)胞成分，降低免疫排斥反應(yīng)；保留基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性，維持天然的組織結(jié)構(gòu)和功能；具有一定的抗鈣化效果，延長生物材料的潛在使用期。運(yùn)用該方法獲得的脫細(xì)胞豬心臟瓣膜，可作為TEHV的優(yōu)質(zhì)支架材料。