重組大腸桿菌產(chǎn)腈水合酶的發(fā)酵工藝研究

齊勇，陳森林，芮枝花，沙云沖，姚崇虎

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 馬鞍山 243100）

煙酰胺（Nicotinamide），俗稱(chēng)維生素B3，分子式為C6H6N2O，分子量122，廣泛存在于自然界中，屬于B 族維生素。煙酰胺作為一種輔酶，參與機(jī)體多種氧化還原反應(yīng)，并且直接參與到碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝當(dāng)中[1]；作為藥物，煙酰胺可治療皮膚病、神經(jīng)疾病、糖尿病、肝臟疾病及日光性皮炎等；在添加劑領(lǐng)域[2]，它作為補(bǔ)充人體必需的維生素可以添加到食品中，同時(shí)它也可以應(yīng)用于畜牧業(yè)，作為動(dòng)物的飼料添加劑；此外，煙酰胺在醫(yī)學(xué)上同樣應(yīng)用廣泛，可作為醫(yī)藥中間體治療各類(lèi)疾病[3]。

煙酰胺的合成方法一直受到關(guān)注。其生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方法。煙酰胺的化學(xué)合成法是利用吡啶類(lèi)物質(zhì)作為原料，首先通過(guò)氧化反應(yīng)得到3-氰基吡啶，之后3-氰基吡啶在一定條件下進(jìn)行堿水解反應(yīng)得到煙酰胺[4]。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法存在工藝產(chǎn)率和純度較低等弊端，而且反應(yīng)條件苛刻，并對(duì)環(huán)境有一定污染。生物法即利用已知的腈水合酶催化3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺[5]，隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展以及目前大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和成熟，腈水合酶的異源表達(dá)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)[6]，利用腈水合酶催化煙腈來(lái)合成煙酰胺已經(jīng)成為目前最普遍的方法。部分學(xué)者利用重組大腸桿菌表達(dá)腈水合酶基因，并順利地進(jìn)行了小試水平的煙酰胺生產(chǎn)，其煙酰胺的最終產(chǎn)量可以達(dá)到23%。

本研究構(gòu)建出一株產(chǎn)腈水合酶的重組大腸桿菌M910001-pMh1229 進(jìn)行高密度發(fā)酵，并系統(tǒng)研究了發(fā)酵條件，同時(shí)鑒定了其催化合成煙酰胺的能力，降低其煙酰胺合成中副產(chǎn)物煙酸的生成及其穩(wěn)定性探究，為煙酰胺的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種

大腸桿菌M910001-pMh1229，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.20430。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化斜面培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：5 g/L 酵母粉；10 g/L 蛋白胨；10 g/L NaCl，瓊脂粉20 g/L。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

發(fā)酵一級(jí)種子培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉；10 g/L蛋白胨；

10 g/L NaCl。

發(fā)酵二級(jí)種子培養(yǎng)基：TB 培養(yǎng)基：24 g/L 酵母粉；12 g/L 蛋 白 胨；2.31 g/L KH2PO4；16.43 g/L K2HPO4·3H2O；5.04 g/L甘油。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

基 礎(chǔ) 鹽 溶 液：17.1 g/L Na2HPO4·12H2O；3 g/L KH2PO4；1 g/L NaCl；1 g/L NH4Cl；1.3 g/L MgSO4·7H2O。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：32 g/L 酵母粉；20 g/L 甘油；17.1 g/L Na2HPO4·12H2O；3 g/L KH2PO4；1 g/L NaCl；1 g/L NH4Cl；1.3 g/L MgSO4·7H2O；0.03 g/L氯化鈷。

1.2.4 補(bǔ)料流加培養(yǎng)基

發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基：100 g/L酵母粉；400 g/L甘油。

注：以上培養(yǎng)基均為卡那霉素抗性，Kana終濃度均為50 mg/L。

1.3 主要儀器

YXQ-LS-75SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；722 分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；OLYMPUS 生物顯微鏡，日本OLYMPUS 會(huì)社；Agilent1200高效液相色譜儀，Agilent Technologies。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

使用接種環(huán)每次從保藏-80℃的甘油管中蘸取1～2滴環(huán)菌液，然后均勻接種于3 支初代斜面培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，之后再?gòu)呐囵B(yǎng)好的一代斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種于二代斜面培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.4.2 一級(jí)種子培養(yǎng)

將3 支活化好的菌種斜面分別接種到3 個(gè)250 mL的三角搖瓶中，每個(gè)搖瓶含有40 mL 的一級(jí)種子培養(yǎng)基，然后將其放置于37℃、220 r/min的搖床上，培養(yǎng)8 h。

1.4.3 二級(jí)種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的3 個(gè)一級(jí)種子液分別接種到3 個(gè)500 mL的三角搖瓶中，每個(gè)搖瓶含有150 mL的二級(jí)種子培養(yǎng)基，然后將其放置于37℃、220 r/min 的搖床上，培養(yǎng)8 h。

1.4.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級(jí)種子液150 mL全部轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基體積為2 L。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)流加氨水，將pH控制在7.0左右。通過(guò)控制轉(zhuǎn)速及通氣量將溶氧控制在35%～45%。初始發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵過(guò)程通過(guò)補(bǔ)料流加培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到60左右，降溫至18℃，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，每4～6 h 取樣檢測(cè)發(fā)酵液OD 值、酶活。至酶活不再上升即可放罐。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 pH值和溶氧DO測(cè)定

采用發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH電極和光學(xué)溶氧電極進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 菌體量測(cè)定

每隔4 h取樣，分別稀釋100、200、400倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其生物量OD600 的吸光值，其吸光值范圍在0.3～0.7。如超過(guò)吸光值范圍后需換下一個(gè)稀釋倍數(shù)。按公式（1）計(jì)算菌體的生物量：

1.5.3 發(fā)酵液酶活測(cè)定

底物溶液：稱(chēng)取70 g 煙腈，溶于1 L PBS 緩沖溶液中。緩沖溶液（PBS）的配制：稱(chēng)取三水磷酸氫二鉀21.6 g，磷酸二氫鉀0.72 g，溶于1 L的超純水中；使用高效液相色譜分析儀進(jìn)行發(fā)酵液酶活的測(cè)定，將底物溶液放置在控溫30℃混勻振蕩器上進(jìn)行振蕩，向其加入10 μL處理后的發(fā)酵液。反應(yīng)10 min后加入500 μL的乙腈溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液用離心機(jī)在12000 r/min的條件下離心3 min，將離心后的反應(yīng)液上清液稀釋10倍，然后過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，最后采用液相色譜分析儀進(jìn)行測(cè)定；色譜柱條件：VP-ODS C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈溶液和2.28 g/L磷酸二氫鉀水溶液為流動(dòng)相，以1∶10的比例進(jìn)行同時(shí)洗脫，柱溫30℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。按照公式（2）計(jì)算發(fā)酵液酶：

式中：c-液相色譜得出的煙酰胺濃度，μg/mL；V-反應(yīng)體積，這里是500 μL 反應(yīng)液＋500 μL 乙腈；X-反應(yīng)進(jìn)樣前的稀釋倍數(shù)（10）；T-反應(yīng)時(shí)間，10 min；v-所加粗酶液體積，10 μL；122-煙酰胺分子量。

發(fā)酵液酶活（U/mL）=粗酶液酶活×發(fā)酵液稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與討論

在大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的條件及誘導(dǎo)劑的條件是決定最終發(fā)酵酶活的兩大關(guān)鍵因素，因此我們從這兩方面重點(diǎn)探討了其對(duì)發(fā)酵過(guò)程及酶活的影響。

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

細(xì)菌菌體的細(xì)胞物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等含氮化合物均由氮源組成。目前常用的氮源主要由有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源組成。而無(wú)機(jī)氮源一般含有銨鹽、氨水等，可供微生物直接利用，稱(chēng)為速效氮源；有機(jī)氮源一般較為廣泛，如蛋白胨、酵母粉、玉米漿等。在發(fā)酵工業(yè)中，有機(jī)氮源不僅作為提供菌體生長(zhǎng)繁殖和合成目標(biāo)產(chǎn)物的氮元素，還存在一些目標(biāo)產(chǎn)物所合成必須的調(diào)節(jié)物、前體等物質(zhì)。因此，工業(yè)發(fā)酵的成功與否即是選擇合適的有機(jī)氮源。

本試驗(yàn)以基礎(chǔ)鹽溶液培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入20 g/L的甘油，額外加入32 g/L的氮源（OXOID酵母抽提物、安琪酵母粉902、安琪酵母粉905、安琪酵母粉908、大豆蛋白胨、魚(yú)骨蛋白胨和玉米漿干粉）。分別考查這些氮源對(duì)該菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

由圖1 可知，最初采用酵母抽提物單配基礎(chǔ)鹽溶液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，明顯可以看到，雖然菌體量達(dá)到了120，但是酶活較低，僅僅只有2521 μ/mL，隨后在選擇其他不同氮源后，菌體量和酶活呈現(xiàn)了明顯上升的趨勢(shì)，圖1 可以看到重組菌在利用酵母粉作為氮源其產(chǎn)酶能力最好，其中安琪酵母粉908 酶活可以達(dá)到5880 μ/mL，OD600 達(dá)到了210，說(shuō)明該氮源更利于產(chǎn)酶。而蛋白胨等其他氮源的產(chǎn)酶能力次之，效果較好的大豆蛋白胨最高酶活只有4871 μ/mL，OD600 達(dá)到了198。因此我們選擇安琪酵母粉908作為最適氮源。

2.1.2 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

碳源在發(fā)酵工業(yè)的領(lǐng)域中非常關(guān)鍵，其不僅提供細(xì)胞的碳架，也為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供所需的能量。常用的碳源有糖類(lèi)、油脂、有機(jī)酸和小分子醇類(lèi)等[17-18]。為了確定該重組菌的最適碳源，將對(duì)碳源進(jìn)行優(yōu)化。

本試驗(yàn)以基礎(chǔ)鹽溶液培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入32 g/L的安琪酵母粉908，額外加入20 g/L 的碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油），來(lái)考查這些碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

由圖2 可知，重組菌在利用麥芽糖、蔗糖和淀粉作為碳源時(shí)，其菌體量達(dá)到了170、190和165，相對(duì)應(yīng)的酶活也平均在5000 μ/mL 左右，但是重組菌在利用葡萄糖和甘油作為碳源時(shí)效果比其他碳源較好，兩者OD600水平相當(dāng)，酶活分別為6551 μ/mL 和6621 μ/mL，OD值分別為210 和215。但是與葡糖糖相比，甘油代謝較慢，不會(huì)產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)，不容易產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物，因此在對(duì)比以上碳源時(shí)，我們選擇大腸桿菌較為容易吸收的甘油作為最適碳源。

2.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

發(fā)酵過(guò)程中采用誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)是必須的。但是IPTG即異丙基硫代半乳糖苷作為實(shí)驗(yàn)室最常用的誘導(dǎo)劑，由于其本身不能被大腸桿菌代謝，因此利用少量的IPTG 即可誘導(dǎo)使其表達(dá)量增高，產(chǎn)物穩(wěn)定。其在細(xì)胞內(nèi)可以穩(wěn)定誘導(dǎo)蛋白表達(dá)同時(shí)并不受細(xì)胞代謝的影響。但是在工業(yè)化大規(guī)模的發(fā)酵中，IPTG 由于本身存在價(jià)格昂貴和一定的毒性等缺陷，因此并不適合工業(yè)化應(yīng)用。相比較IPTG，乳糖同樣可作為誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，其具備雙重作用，不僅作為誘導(dǎo)劑，還可以作為碳源供重組細(xì)菌發(fā)酵利用。因此，將兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)行相比，選取最佳的誘導(dǎo)劑。

通過(guò)上述選擇合適的碳源和氮源后，我們采用其作為發(fā)酵培養(yǎng)基，保持其他條件不變，選擇不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分別考查其對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶影響，結(jié)果如圖3和圖4所示。

如圖3 所示，重組菌利用IPTG 誘導(dǎo)的酶活僅僅達(dá)到了5231 μ/mL，菌體量180；反之，重組菌在利用乳糖作為誘導(dǎo)劑，不管是其酶活還是菌體生長(zhǎng)情況都遠(yuǎn)好于IPTG 誘導(dǎo)。利用乳糖誘導(dǎo)，酶活達(dá)到了7521 μ/mL，OD600 達(dá)到了220，分別提高了43.8%和22.2%。

圖3 不同誘導(dǎo)劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

如圖4 所示，在最優(yōu)培養(yǎng)基的條件下，對(duì)比了兩種誘導(dǎo)劑的優(yōu)劣后，選擇乳糖作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)控制乳糖在發(fā)酵體系中的終濃度為0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L。從圖4可知，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為3 g/L時(shí)，菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶效果最好，酶活達(dá)到了8500 μ/mL，OD600達(dá)到了225。

圖4 不同乳糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活的影響

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，選擇乳糖作為誘導(dǎo)劑，其發(fā)酵酶活及菌體量都隨著乳糖在發(fā)酵體系中的終濃度上升而增加，但當(dāng)乳糖濃度超過(guò)3 g/L時(shí)，其酶活出現(xiàn)了略微下降的趨勢(shì)，由此可知，再增加乳糖濃度，將對(duì)發(fā)酵酶活產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)還會(huì)增加發(fā)酵成本，因此基本確定乳糖濃度為3 g/L 為最適誘導(dǎo)濃度，此時(shí)的酶活及生物量最高。

3 結(jié)論

（1）本研究利用本公司實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建出的一株產(chǎn)腈水合酶的重組大腸桿菌M910001-pMh1229進(jìn)行高密度發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在基礎(chǔ)鹽溶液的基礎(chǔ)上，采用單因素法對(duì)發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)氮源、碳源的篩選，確定最優(yōu)的碳氮源。最終確定了發(fā)酵培養(yǎng)基成分，其組成為：32 g/L酵母粉，20 g/L 甘油，17.1 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，1 g/L NaCl，1 g/L NH4Cl，1.3 g/L MgSO4·7H2O，并利用乳糖作為誘導(dǎo)劑，濃度為3 g/L。

（2）優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)于該菌發(fā)酵產(chǎn)腈水合酶酶活可以達(dá)到8500 μ/mL，OD600 達(dá)到了225，酶活對(duì)比優(yōu)化前提高了45%，為煙酰胺的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。