基于重組酶聚合酶擴增結(jié)合側(cè)流層析試紙條 快速檢測鯉皰疹病毒2型的方法研究

韓進剛　王菁　徐赟霞　劉群　羅璋　馮守明

摘要：為建立CyHV-2的重組酶聚合酶擴增結(jié)合側(cè)流層析（RPA-LFD）快速檢測鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）的方法，針對鯉皰疹病毒2型的DNA聚合酶基因設(shè)計引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)溫度和時間條件，建立了鯉皰疹病毒2型的RPA-LFD檢測方法，并將樣品簡易處理方法運用于該方法對實驗室保存的鯽組織樣品進行檢測。結(jié)果顯示，該RPA-LFD檢測方法最佳反應(yīng)條件為40 ℃ 20 min，最低檢出限為6×100 copies/μL，與熒光PCR的靈敏度相當(dāng)，與其他鯉皰疹病毒等無交叉反應(yīng);運用該方法并結(jié)合待檢樣品簡易處理方法（直接RPA法）對50份鯽組織樣品進行處理和檢測，其結(jié)果與運用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）中熒光 PCR方法檢測結(jié)果一致。本文建立的RPA-LFD檢測方法具有操作簡單、反應(yīng)迅速、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，適于在水產(chǎn)養(yǎng)殖場和基層部門用于鯉皰疹病毒病的輔助診斷和監(jiān)測。

關(guān)鍵詞：鯉皰疹病毒2型（CyHV-2）;重組酶聚合酶擴增（RPA）;側(cè)流層析試劑條（LFD）;直接RPA法

鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），也稱為金魚造血器官壞死病毒，是一種感染異育銀鯽、金魚、鯽及其變種的高致病性魚類病毒。由于該病毒是第二個分離自鯉科魚類的皰疹病毒，國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會將其命名為鯉皰疹病毒2型。CyHV-2病毒對魚卵、魚苗、魚種和親魚均可感染，危害嚴(yán)重。近年來，由CyHV-2引起的鯽造血器官壞死病是國內(nèi)異育銀鯽養(yǎng)殖出現(xiàn)“鰓出血”引發(fā)暴發(fā)死亡的一種高度傳染性疾病，死亡率可達90%[1]。通常病毒檢測的首選方法是細胞培養(yǎng)分離技術(shù)，由于目前分離CyHV-2病毒的敏感細胞系培養(yǎng)操作等需要條件較高，分子生物學(xué)診斷方法仍是該病毒最常用的檢測方法。我國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）金魚造血器官壞死病毒檢測方法中采用了PCR和熒光PCR法，其也需要較昂貴的儀器、實驗環(huán)境及專業(yè)培訓(xùn)的實驗室人員，較難在基層單位尤其是鄉(xiāng)鎮(zhèn)以及普通養(yǎng)殖戶推廣應(yīng)用。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA）是Piepenburg等2006年提出的一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，它的優(yōu)勢在于可在常溫下十幾分鐘內(nèi)將痕量核酸模板擴增到可檢測水平[2]。目前RPA方法已經(jīng)應(yīng)用于鯉春病毒血癥病毒[3-4]、白斑綜合征病毒[5]、傳染性造血器官壞死病毒[6]、Ⅱ型鯉皰疹病毒[7-8]、鯉浮腫病毒[9]、錦鯉皰疹病毒[9]、傳染性脾腎壞死病毒和鯰愛德華氏菌[10]等水生動物病原檢測中。RPA擴增結(jié)合側(cè)流層析試紙條（lateral flow dipstick，LFD）檢測技術(shù)的應(yīng)用，可以實現(xiàn)病毒核酸檢測結(jié)果的肉眼直接觀察。本文通過鯉皰疹病毒2型的RPA-LFD檢測方法的建立以及樣品簡易處理方法的應(yīng)用，為基層單位和養(yǎng)殖場中鯽造血器官壞死病的輔助診斷監(jiān)測提供一種操作簡單、反應(yīng)迅速、靈敏度高、特異性強的檢測方法。

1材料與方法

1.1實驗毒株及主要試劑

鯉皰疹病毒（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）、鯉痘瘡病毒（Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1）、錦鯉皰疹病毒（Cyprinid herpeavirus 3，CyHV-3）、鯉春病毒血癥病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鯉浮腫病毒（Carp edema virus，CEV）等水生動物病毒病料及檢測用鯽樣品均由本中心實驗鑒定并保存。CyHV-2的鑒定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）金魚造血器官壞死病毒檢測方法。ELISA包被緩沖液、PBST緩沖液購自北京索萊寶公司;DNA提取試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）公司;TwistAmp nfo Kit試劑盒，Milenia HybriDetect1試紙條;PCR相關(guān)試劑為Takara產(chǎn)品。

1.2所用主要儀器設(shè)備

臺式高速冷凍離心機：Eppendorf 5430R;PCR儀：Life ProFlex、Biometra;凝膠成像分析儀：BIO-RAD Gel Dox R+、電泳儀BIO-RAD powerPac basic、熒光定量PCR儀AB QuantStudio5;超微量核酸蛋白分析儀：IMPLEN P330;干式恒溫器：MK-20等。

1.3RPA引物和探針的設(shè)計

選取鯉皰疹病毒2型的DNA聚合酶基因作為目標(biāo)序列，在NCBI基因庫中檢索（序列號：AY939863.1），使用Primer Premier5.0軟件結(jié)合TwistDx公司的設(shè)計手冊（https：//www.twistdx.co.uk/en/rpa）設(shè)計PRA引物和探針，本實驗設(shè)計引物和探針為：上游引物C2F：ACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGATACC

GGC，下游引物C2R：Biotin -TCTTTCTCGGTCTTGATGCGTTTCTTGTACTG，探針C2P：FAM-AGAGATCAAGGAATACCCGCACAGCGAAGACC/THF/GTACACGATCCTGTGC-（C3spacer），委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.4配制反應(yīng)預(yù)混液與擴增

參照TwistAMP nfo kit試劑盒推薦反應(yīng)體系，在1.5 mL離心管按照以下比例配制反應(yīng)預(yù)混液，充分混勻并短暫離心。引物C2F（10 μM）2.1 μL、引物C2R（10 μM）2.1 μL、nfo探針C2P（10 μM）0.6 μL、Rehydration buffer緩沖液29.5 μL、模板DNA 2.0 μL、ddH2O 11.2 μL，總體積47.5 μL。將47.5 μL反應(yīng)預(yù)混液加入盛有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，手指輕彈使凍干粒充分溶解并短暫離心。吸2.5 μL醋酸鎂（MgOAc，280 mM）到管蓋內(nèi)壁，通過簡短離心使醋酸鎂進入預(yù)混液而啟動反應(yīng)（加入MgOAc反應(yīng)即刻進行）。反應(yīng)結(jié)束后用側(cè)流層析試紙條分析。對于低濃度模板（小于103拷貝/反應(yīng)），反應(yīng)4 min后取出反應(yīng)管，手輕彈混勻并短暫離心，放回金屬浴中繼續(xù)反應(yīng)可提高反應(yīng)效率。

1.5試紙條檢測

每樣品吸取100 μL試紙條配套HybriDetect Assay Buffer緩沖液或者自備PBS緩沖液到一潔凈PCR管中。吸取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物加到上述緩沖液或者加到試紙條樣品區(qū)。然后將試紙條樣品區(qū)不超上限位直立放入緩沖液，數(shù)分鐘后觀察試紙條層析結(jié)果。

1.6反應(yīng)條件優(yōu)化

優(yōu)化實驗以重組質(zhì)粒（6×105拷貝/μL）為模板。采用方陣法對反應(yīng)溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）和反應(yīng)時間（5、10、15、20、25、30 min）進行試驗優(yōu)化，反應(yīng)體系按照步驟1.4中TwistAMP nfo kit試劑盒推薦。優(yōu)化試驗的反應(yīng)產(chǎn)物通過LFD試紙條檢測。選擇陽性樣品出現(xiàn)最強檢測線和質(zhì)控線，陰性樣品不出現(xiàn)檢測線僅出現(xiàn)質(zhì)控線時的條件作為RPA-LFD的優(yōu)化條件。

1.7靈敏度試驗

1.7.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與定量采用GB/T 36194-2018標(biāo)準(zhǔn)中CyHVpol引物擴增CyHV-2病毒DNA聚合酶基因362 bp特異性序列。測序確認后將其克隆至pMD18T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-CyHV-2。該重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后，采用超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度，根據(jù)公式：{質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9/[660×（基因片段長度+載體長度）]}×6023×1023=質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝/μL），換算為其拷貝數(shù)。

1.7.2比較建立的RPA-LFD檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T36194-2018中CyHV2熒光PCR檢測方法的靈敏度。將陽性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍系列稀釋，濃度從6×107～6×100拷貝/μL梯度稀釋，分別以其為模板進行RPA-LFD檢測和熒光PCR檢測。

1.8特異性試驗

用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒抽提本實驗室保藏SVCV、GCRV核酸，并將其逆轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的cDNA，用DNA提取試劑盒分別提取本實驗室保藏的CyHV-1、CyHV-2、CyHV-3、CEV基因組DNA。利用已建立的RPA-LFD檢測方法檢測上述cDNA和DNA。

1.9臨床樣品檢測應(yīng)用

將待檢樣品簡易處理方法應(yīng)用于建立的RPA-LFD法檢測鯽樣品，并與國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果比較，評估該方法的穩(wěn)定性和可靠性。

1.9.1待檢樣品簡易處理方法（直接RPA法）將待檢測樣品約100 mg的組織勻漿液與碳酸氫鹽緩沖液（ELISA包被液）混合，吸取50 μL移入PCR管中，放入金屬浴中50 ℃孵育15 min。用200 μL PBS-T（含0.05% Tween20）洗3次。加入47.5 μL RPA反應(yīng)預(yù)混液（含緩沖液、引物、探針和水），95 ℃ 10 min，迅速放置冰上2～3 min，稍離心。以上處理的反應(yīng)液移入含RPA酶的反應(yīng)管中，再加入2.5 μL醋酸鎂啟動劑放入金屬浴中進行反應(yīng)，反應(yīng)完成后用試紙條檢測。

1.9.2熒光PCR法檢測按照DNA提取試劑盒說明書提供的方法進行DNA抽提，采用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）中熒光PCR法對待檢樣品進行檢測。

2結(jié)果

2.1最佳反應(yīng)條件選擇

本試驗在25～45 ℃溫度反應(yīng)20 min均可出現(xiàn)肉眼可分辨較清晰檢測帶。綜合比較不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間檢測結(jié)果，本實驗選擇40 ℃反應(yīng)20 min作為CyHV-2檢測的最佳反應(yīng)條件。

2.2靈敏度試驗

采用10倍倍比稀釋的陽性重組質(zhì)粒作為模板，比較RPA-LFD方法與熒光PCR的敏感性。結(jié)果顯示，本文建立的RPA-LFD方法最低檢出限為6×100拷貝/μL（圖2），熒光PCR檢出限也為6×100拷貝/μL（圖3），表明本文建立的RPA-LFD方法敏感性與熒光PCR相當(dāng)。

1～6為溫度20、25、30、35、40、45 ℃反應(yīng)20 min時試紙條檢測結(jié)果;7～12為40 ℃反應(yīng)5、10、15、20、25、30 min時試紙條檢測結(jié)果。

1～8為10倍系列稀釋質(zhì)粒模板濃度：6×107拷貝/μL～6×100拷貝/ μL;9為陰性對照

2.3特異性試驗

分別以SVCV、GCRV的cDNA和CyHV-1、CyHV-2、CyHV-3、CEV的DNA為模板，驗證建立的檢測CyHV-2的RPA-LFD方法的特異性。結(jié)果顯示，僅CyHV-2的DNA模板的反應(yīng)產(chǎn)物在試紙條上同時出現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線。陰性對照（RNase-free水）及SVCV、GCRV、CEV、CyHV-1、CyHV-3均未出現(xiàn)擴增，僅在試紙條上顯示質(zhì)控線（圖4）。由此可知，該方法能特異性擴增出CyHV-2中的靶序列，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。

1～7依次為為：CyHV-2，陰性對照，SVCV，GCRV，CyHV-1，CyHV-3，CEV。

2.4臨床樣品檢測

利用所建立的RPA-LFD方法與國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）中熒光 PCR 方法分別檢測2018—2021年收集保存于本實驗室鯽樣品50份。結(jié)果顯示RPA-LFD檢測出陽性34份、陰性16份;熒光PCR檢測出陽性34份、陰性16份，兩種方法檢測結(jié)果一致，符合率100%。表明本文建立的RPA-LFD方法可用于CyHV-2待檢樣品的現(xiàn)場檢測。

3討論

在病毒性疾病的潛伏感染期，機體患病癥狀大多表現(xiàn)不明顯，常給疾病的早期診斷帶來困難。CyHV-2作為鯽皰疹病毒病的病原，早期檢測發(fā)現(xiàn)該病毒感染，盡早采取積極有效的防控措施是阻斷該病毒感染傳播，降低魚類發(fā)病死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。重組酶聚合酶擴增技術(shù)作為一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，具有特異性好、靈敏度高（1～10拷貝）的優(yōu)點，可以與實時熒光定量PCR相媲美[11]。RPA技術(shù)與PCR比較有一些基本的優(yōu)勢，如待檢樣品在RPA擴增前只需要簡單處理，甚至可以在未經(jīng)處理的尿液樣品中可以直接檢測某類衣原體[12];另外，RPA還具有耐PCR抑制因子的能力，已有研究顯示RPA在某些已知的PCR抑制因子如未稀釋血清、肝素（0.5 U）、血紅蛋白（50 g/L）、乙醇（4% V/V）等存在時仍然可以有效進行[13-14]。RPA被認為是可能替代PCR的一種核酸擴增技術(shù)，結(jié)合側(cè)流流層析試紙條檢測其擴增產(chǎn)物，可以提高RPA方法的特異性和檢測速度[15]。

基于核酸檢測的水生動物疫病診斷，通常需要3個主要步驟：樣品處理制備、擴增、檢測。在待檢樣品的處理制備中，本文為了節(jié)約實驗室DNA抽提步驟時間，根據(jù)ELISA抗原包被原理和熱裂解核酸簡易提取方法，本文采用了待檢樣品簡易處理方法（直接RPA法）進行了樣品的處理。Wang等[16]試驗研究，乙肝病毒結(jié)合到塑料管上溫育1 min后就能被檢測到，10 min以后達到最高水平。Soliman H等[9，17]50 ℃溫育15 min，可使病魚組織勻漿液中CEV和CyHV-3病毒粒子充分吸附在微量離心管表面。這種現(xiàn)象與ELISA包被中抗原或抗體蛋白吸附在固相載體的方式相似，即病毒蛋白與聚丙烯/聚苯乙烯固相載體通過物理吸附結(jié)合。本文將直接RPA法應(yīng)用在CyHV-2病毒RPA-LFD檢測實驗，從樣品處理到獲得檢測結(jié)果，整個過程約在1 h內(nèi)完成，與標(biāo)準(zhǔn)方法首先進行DNA抽提再熒光PCR檢測相比，可簡化操作流程，提高檢測的速度，降低檢測成本。

鯉皰疹病毒2型的核酸檢測方法主要基于該病毒DNA聚合酶基因和解旋酶基因設(shè)計引物。Goodwin等[18]針對CyHV-2病毒DNA聚合酶基因設(shè)計引物和探針，建立了探針法熒光定量PCR，該方法能夠區(qū)分CyHV-2與CyHV-1和CyHV-3，靈敏度達到了1個病毒基因拷貝數(shù)。我國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 36194-2018）中熒光PCR方法也引用了Goodwin文獻基于DNA聚合酶基因進行CyHV-2檢測。本文也針對該病毒DNA聚合酶基因，設(shè)計了RPA-LFD法檢測用引物和探針，建立了CyHV-2的RPA-LFD快速檢測方法。 RPA反應(yīng)溫度和所需時間范圍較寬，考慮反應(yīng)效率和檢測時間，選擇40 ℃孵育20 min作為最佳擴增條件。該方法與其它鯉皰疹病毒等常見水生動物病原核酸無交叉反應(yīng)，擴增產(chǎn)物可直接用試紙條層析肉眼觀察。該方法最低檢測限為6拷貝/μL，靈敏度與熒光PCR法相當(dāng)，與王姝等[8]建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型RAA-LFD法的靈敏度接近。分別對50份鯽樣品進行檢測，該方法與熒光 PCR方法檢測結(jié)果一致。本文建立的RPA-LFD 方法操作簡單、反應(yīng)迅速、靈敏度高、特異性強，適于在基層部門和養(yǎng)殖場用于鯉皰疹病毒病的輔助診斷和監(jiān)測。

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Rapid detection of Cyprinid herpesvirus 2 based on recombinase

polymerase amplification combined with lateral flow dipstick

HAN Jingang WANG Jing XU Yunxia LIU Qun LUO Zhang FENG Shouming

Abstract：In order to establish the rapid test method of detecting Cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2） based on recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick（RPA-LFD） ，we designed primers and probe on the basis of the conserved sequences of the gene encoding DNA polymerase of CyHV-2.The incubating conditions involving temperatures and times were optimized.The sample processing method of? DNA release was simply applied to detect the Carassius auratus gibelio samples preserved in the laboratory.The results showed that the optimum reaction condition of the RPA-LFD was 40 ℃ incubating 20 minutes，and the minimum detection limit was 6 copies/μL.This new method had the same sensitivity as TaqMan Real-time PCR，and no cross reaction with other Cyprinid herpesvirus.A total of 50 samples of crucian carp were analyzed by this method with simply treatment process of samples （direct RPA ），and the detection results were consistent with the fluorescent PCR method of the national standard（GB/T 36194-2018）.In conclusion，the newly established RPA-LFD method in this paper has the advantages of simple operation，rapid response，high sensitivity and specificity.It is suitable for auxiliary diagnosis and monitoring of Cyprinid herpesvirus disease at farms and primary service departments.

Key words：Cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2）; Recombinase polymerase amplification （RPA）; lateral flow dipstick（LFD） ; direct RPA

（收稿日期：2022-03-02）

基金項目：天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心青年科技創(chuàng)新項目（zxkj202101）資助。

作者簡介：馮守明（1965-），男，博士，研究員，研究方向：水生動物免疫學(xué)。E-mail：smfeng65@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.06.009