薄荷醇對(duì)TRPM8小鼠呼吸道上皮短路電流的影響

郅 琳， 臧文華， 張雪鵬， 胡久略

(南陽理工學(xué)院張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 南陽 473004)

0 引言

支氣管哮喘是臨床中一種常見的慢性氣道炎癥性疾病[1-3]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，溫度變化可以引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，而哮喘的病理可能與此有關(guān)[4]。研究認(rèn)為這類溫度感受離子通道屬于瞬時(shí)受體勢(shì)能(transient receptor potential，TRP)離子通道亞家族成員，是一種陽離子通道[5]。根據(jù)其序列同源性可分為7個(gè)主要的亞家族：TRPA(ankyrin)、TRPC(canonical)、TRPM(melastatin)、TRPML(mucolipin)、TRPN(nomechanopotential，NOMP)、TRPP(polycystin)、TRPV(vanilloid)[6]。

圖1 TRP通道結(jié)構(gòu)示意圖

目前普遍認(rèn)為溫度感受TRP受體(thermoTRP receptors)包括TRPV1-V4、TRPM8、TRPA1[7]等6種受體，也有學(xué)者將TRPM2、TRPM4和TRPM5歸于此類[8]。研究證明瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)通道(如圖1)可以受溫度、pH值、滲透壓等多種因素的影響[9]。其中，在傷害性感覺神經(jīng)元有表達(dá)的TRPV1、V2可分別被大于43 ℃和大于52 ℃溫度激活，屬于“熱受體”范圍，而TRPM8可在低于 25 ℃被激活，TRPA1在低于17 ℃可被激活，因此，TRPM8和TRPA1被稱為“冷受體”[10]。2001年，Tsavaler認(rèn)為TRP-p8很可能是一種與癌基因或腫瘤啟動(dòng)子相關(guān)并可通透鈣離子(Ca2+)離子的通道，根據(jù)TRP通道的命名方法，TRP-p8歸屬于TRPM亞家族，因此命名為TRPM8[11,12]。隨后，由于發(fā)現(xiàn)TRPM8可被冷溫度、薄荷醇、桉樹油等激活，因此又稱其為“冷受體”(cold-and menthol-sensitive receptor，CMR)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，冷空氣的刺激和過度吸入都可以加重氣道炎癥或加重哮喘發(fā)作[14]，從而誘發(fā)哮喘。Ashwini等克隆出一種在人類肺組織上皮細(xì)胞上可以增強(qiáng)IL-6、IL-8表達(dá)的功能性TRPM8的變異體[15]，TRPM8在被激活后可以介導(dǎo)哮喘病的某些病理改變[16]，具有非常重要的藥理學(xué)研究價(jià)值。來源于唇形科植物薄荷(Mentho haplocalyx Bing)[17]的薄荷醇(Menthol)，是TRPM8的經(jīng)典激動(dòng)劑，歸屬于中藥活性成分范疇。根據(jù)中醫(yī)理論，中藥可劃分為寒、熱、溫、涼四性，這也與TRP通道的冷(cold)、涼(cool)、溫(warm)、熱(hot)特性契合。由此可見研究中藥和TRP通道之間的聯(lián)系，對(duì)于臨床疾病研究具有重要的指導(dǎo)意義。

支氣管哮喘是一種由多種因素相互作用引起的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病，臨床以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為其病理特征，其中以氣道炎癥為其最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的嚴(yán)重程度。本課題提出假設(shè)認(rèn)為TRPM8在哮喘病程中尤其在炎癥過程中具有調(diào)控作用，這種調(diào)控作用很可能是通過神經(jīng)機(jī)制所介導(dǎo)，并且在此基礎(chǔ)上，設(shè)想具有寒熱溫涼性質(zhì)的中藥及其活性成分可能會(huì)影響TRPM8通道的作用，進(jìn)而導(dǎo)致其功能的修飾和改變。本研究利用TRPM8基因敲除小鼠的哮喘模型研究TRPM8對(duì)過敏性支氣管哮喘小鼠模型的病理影響。采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建動(dòng)物模型，從呼吸道上皮細(xì)胞及呼吸道平滑肌兩個(gè)方面展開研究，考察其各自的功能改變，TRPM8+/+、TRPM8-/-小鼠采用卵蛋白(OVA)腹腔注射致敏，激發(fā)液霧化激發(fā)建立過敏性支氣管哮喘模型，在本研究中，根據(jù)中醫(yī)理論，針對(duì)TRPM8為冷受體的特性，探索中藥薄荷的活性成分薄荷醇(Menthol)與TRPM8通道在哮喘疾病發(fā)生中的聯(lián)系，以期在中藥藥性理論的指導(dǎo)下，闡明薄荷醇對(duì)溫度敏感離子通道的作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康6～8周齡TRPM8+/+、TRPM8-/-小鼠，由上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院徐天樂教授惠贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要藥品與試劑

薄荷醇(Sigma，Lot：05617 MHV)；Icilin(Cayman Chemical，lot：10147-5)；Krebs-Henseleit液；其余試劑均為國藥制劑。

1.3 主要儀器

短路電流測(cè)定系統(tǒng)：放大器(CEZ-9100，日本光電)；多通道電流/電壓鉗(VCCMC-6，Physiologic Instruments)；Ussing型浴槽(P2300，Physiologic Instruments)。

1.4 TRPM8小鼠呼吸道上皮短路電流測(cè)定

1.4.1 Ussing小室短路電流測(cè)定

采用恒溫灌流裝置體外測(cè)定上皮短路電流Isc，小鼠氣道黏膜面朝向A室，黏膜標(biāo)本置于Ussing小室的標(biāo)本夾上，標(biāo)本夾的內(nèi)徑為4.2 mm2，加入Krebs-Henseleit緩沖液，兩室各5 mL；緩沖液溫度需保持在37 ℃，持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣。小鼠處死后，迅速取下呼吸道上皮，固定在標(biāo)本夾上，置于Ussing室內(nèi)，兩側(cè)加入緩沖液，平衡60 min，通過Ag/AgCl參考電極測(cè)量跨上皮電壓差。短路狀態(tài)可用外來電流以及液體電阻補(bǔ)償鉗于零電位，測(cè)得的電流即為短路電流(Isc)。

1.4.2 薄荷醇對(duì)TRPM8小鼠呼吸道上皮短路電流影響

以不同濃度薄荷醇(0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，10 mmol/L)加入A室的緩沖液中刺激呼吸道上皮，由電子計(jì)算機(jī)持續(xù)記錄Isc。

1.4.3 薄荷醇對(duì)卡巴膽堿誘導(dǎo)的TRPM8小鼠氣道上皮短路電流增強(qiáng)的影響

薄荷醇預(yù)孵育30 min后，加入10 μmol/L卡巴膽堿，觀察Isc變化，以10 μmol/L卡巴膽堿引起的最大反應(yīng)為對(duì)照。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism5.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以Mean± SEM表示，組間數(shù)據(jù)采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，多組之間數(shù)據(jù)的采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05，具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 薄荷醇對(duì)TRPM8小鼠氣道上皮短路電流變化的影響

結(jié)果表明，薄荷醇降低TRPM8+/+小鼠氣道上皮Isc呈濃度依賴性，而TRPM8-/-小鼠無此反應(yīng)(見圖2)。

圖2 薄荷醇對(duì)TRPM8小鼠氣道上皮短路電流變化的影響

2.2 薄荷醇對(duì)卡巴膽堿誘導(dǎo)的TRPM8小鼠氣道上皮短路電流增強(qiáng)的影響

結(jié)果表明，高濃度薄荷醇(3000 μmol/L)能顯著降低卡巴膽堿刺激引起的TRPM8+/+小鼠氣道上皮Isc(P<0.01)，而TRPM8-/-小鼠無此反應(yīng)(見圖3)。

圖3 薄荷醇對(duì)卡巴膽堿誘導(dǎo)的TRPM8小鼠氣道上皮短路電流增強(qiáng)的影響。

3 討論

本項(xiàng)目利用TRPM8小鼠首先對(duì)TRPM8的通道功能特性進(jìn)行研究，薄荷醇呈劑量依賴性的影響TRPM8+/+小鼠氣道上皮的Isc變化，并且可有效降低CCh刺激引起的Isc水平，而在TRPM8-/-小鼠，這種作用不顯著(圖1和圖2)，說明TRPM8同樣參與了小鼠氣道上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程。值得關(guān)注的是，TRPM8+/+小鼠中低濃度薄荷醇刺激誘導(dǎo)的Isc呈激活趨勢(shì)，而高濃度情況下反而起到抑制作用。Chiyotani等人[18-20]的研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇可以通過Ca2+依賴性機(jī)制影響犬科氣道上皮氯離子分泌，進(jìn)而影響氣道上皮Isc水平，并發(fā)現(xiàn)薄荷醇刺激引起的持續(xù)性Ca2+內(nèi)流可能來源于細(xì)胞外，因此認(rèn)為氣道上皮上可能存在Ca2+敏感性受體，考慮到TRPM8的通道特性，結(jié)合我們的研究，進(jìn)一步推測(cè)薄荷醇對(duì)氣道上皮的調(diào)節(jié)是通過TRPM8發(fā)揮生物學(xué)活性，低濃度的薄荷醇刺激氣道上皮引起TRPM8通道的激活，通道開放引起鈣離子內(nèi)流，進(jìn)而影響上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)例如氯離子分泌增加，導(dǎo)致Isc上升，而后期隨著高濃度的薄荷醇持續(xù)刺激，TRPM8通道脫敏，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少，最終導(dǎo)致Isc的下降。

冷空氣的刺激可誘發(fā)哮喘、慢性阻塞性肺病等，TRPM8作為“冷受體”，可能與溫度敏感相關(guān)疾病的發(fā)作有重要關(guān)系。Reid等[21]相關(guān)研究證實(shí)，TRPM8通道在23～34 ℃之間可以被薄荷醇激活，從而誘導(dǎo)背神經(jīng)元內(nèi)TRPM8的電流發(fā)生，而在對(duì)三叉神經(jīng)元上TRPM8的研究中，McKemy[19]通過TRPM8電流在冷刺激、薄荷醇的敏感性以及離子的選擇性等方面與內(nèi)源性的冷激活產(chǎn)生的電流相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者是相同的?？梢姡鳛橐环N冷受體，TRPM8通道的研究在炎癥尤其是與氣道相關(guān)疾病中具有重要意義。

目前對(duì)TRP通道的認(rèn)識(shí)僅可以確定TRP通道參與了多種病理生理過程，如介導(dǎo)感覺信息傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡、影響發(fā)育等。有關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，包括薄荷醇在內(nèi)的一些化合物也可激活TRPM8通道[22]，另外，一些合成化合物，例如Icilin激活TRPM8能力是薄荷醇的20到200倍，同樣也可以作為TRPM8的激動(dòng)劑[19]。在中國，自然界藥物資源豐富，很多中藥均可衍生出多種人工合成物，因此利用中醫(yī)中藥研究TRP通道的相關(guān)功能具有很廣闊的前景[23]。

總之，通過本研究對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)利用薄荷醇激活TRPM8通道，可以調(diào)控小鼠氣道上皮短路電流，從而為進(jìn)一步研究其在哮喘疾病中的作用機(jī)制等提供了科學(xué)依據(jù)。