基于qPCR檢測(cè)方法的溺死診斷研究

余仲昊，徐曲毅，肖 成，李 歡，吳偉斌，杜蔚安，趙 建，劉 宏，王慧君,*，劉 超,,*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，公安部法醫(yī)病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510442；3.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016；4.廣東華美眾源生物科技有限公司，廣東 佛山 518000）

溺死，是由于溺液阻塞呼吸道及肺泡，阻礙氣體交換，造成體內(nèi)缺氧及二氧化碳潴留而發(fā)生的窒息性死亡。水中尸體的死因診斷是法醫(yī)工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。早期法醫(yī)工作者常通過(guò)相關(guān)尸體征象，如口、鼻部蕈樣泡沫，水性肺氣腫等[1]來(lái)初步推斷水中尸體死因是否為溺死。然而，隨著尸體在水中浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，尸體征象常因腐敗而消失，且一些其他死因的尸體也偶有上述征象出現(xiàn)，故單獨(dú)依靠尸體征象來(lái)診斷溺死的準(zhǔn)確性較低。

硅藻檢驗(yàn)診斷溺死有其歷史，法醫(yī)工作者在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察計(jì)算尸體臟器組織中的硅藻形態(tài)和數(shù)量而推斷是否溺死。該法雖操作簡(jiǎn)單，但由于光鏡觀(guān)察的局限性，檢驗(yàn)陽(yáng)性率較低，且其操作過(guò)程也較易造成污染[2-5]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)光鏡下硅藻檢驗(yàn)的改良優(yōu)化，Zhao等[6-8]建立了微波消解-真空抽濾-自動(dòng)掃描電鏡法（MD-VF-Auto SEM），以自動(dòng)掃描電鏡代替了傳統(tǒng)的光鏡，既提高了檢測(cè)靈敏度，又使方法具有定量能力而將準(zhǔn)確性大幅提高。但該法所需要的儀器設(shè)備價(jià)格較昂貴，使用條件要求高，難以在基層實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有不少研究者將DNA檢測(cè)應(yīng)用到溺死診斷領(lǐng)域中。以水體中的硅藻、藍(lán)藻、氣單胞菌等溺死相關(guān)浮游微生物的特定基因[9-13]為靶點(diǎn)，PCR毛細(xì)管電泳檢測(cè)法（PCR-CE）可完成水中尸體臟器硅藻、氣單胞菌等微生物的檢測(cè)，從而可診斷溺死。如麥柏盛等[14]采用PCR-CE法檢測(cè)嗜水氣單胞菌gyrB和16S rRNA基因，彭帆等[15]檢測(cè)rbcL基因，均表明PCR-CE檢測(cè)技術(shù)在一般案件中具有較高的實(shí)用價(jià)值。然而，該法耗時(shí)較長(zhǎng)、靈敏度也不高。

在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一種實(shí)時(shí)監(jiān)控核酸擴(kuò)增的技術(shù)，通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。憑借其特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測(cè)周期較短等特點(diǎn)，qPCR技術(shù)現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于臨床病原檢測(cè)、腫瘤診斷以及基因差異表達(dá)中[16-18]。在水質(zhì)研究領(lǐng)域，也有學(xué)者采用qPCR檢測(cè)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)水體中有害藻華的動(dòng)態(tài)變 化[19-20]。

在我們前期研究發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)的有限硅藻種類(lèi)中，以硅藻UPA基因?yàn)榘悬c(diǎn)的qPCR檢測(cè)技術(shù)在溺死診斷研究中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[21]。基于對(duì)廣東省內(nèi)珠江水體微生物的研究[22-23]，針對(duì)水體中常見(jiàn)的硅藻、藍(lán)藻、氣單胞菌等浮游生物，我們?cè)O(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD，擬構(gòu)建一種qPCR溺死診斷方法，以便能夠更加全面、快速、靈敏地檢測(cè)水體微生物的DNA，從而為溺死診斷提供更多的證據(jù)信息，為法醫(yī)學(xué)溺死診斷再提供一種鑒定手段。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PowerSoilTMDNA Isolation Kit試 劑 盒、20 mg/ mL蛋白酶K (Qiagen)，DTT、Qubit?dsDNA HS Assay Kit DNA定量試劑盒 (Thermo fisher Scientific)，NuHi?Robustic SYBR Green Mix（蘇州新海），濃硝酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)）。

高速冷凍離心機(jī)（Sigma），Thermomixer Vortex振蕩儀及恒溫混勻儀（Eppendorf），Qubit?fluoro- meter v2.0熒光定量?jī)x（Invitrogen），Milli-Q超純水系統(tǒng) （Millipore），高壓蒸汽滅菌鍋（Hirayama），Quant-StudioTM7 Flex Real-Time PCR System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)，MW 3000微波消解儀（Anton Paar），HL-6型多聯(lián)濾膜富集裝置（珠海黑馬儀器公司），F(xiàn)EI Quanta 600型掃描電鏡（FEI公司）。

1.2 樣本準(zhǔn)備

1.2.1 藻種、菌種標(biāo)準(zhǔn)株及人基因組DNA

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，針對(duì)廣東省珠江流域水體中常見(jiàn)的溺死相關(guān)浮游生物種類(lèi)，特購(gòu)置以下藻種、菌種標(biāo)準(zhǔn)株：4種淡水硅藻（小環(huán)藻Cyclotella sp.、針桿藻Synedra radians、菱形藻Nitzschia sp.、舟 形 藻Navicula sp.），5種 海 水 硅 藻（三 角褐指藻Phaeodactylum tricornutum、旋鏈角毛藻Chaetoisceros curvisetus、威氏海鏈藻Thalassiosira weissflogii、中肋骨條藻Skeletonema costatum、隱秘小環(huán)藻Cyclotella cryptita），4種淡水藍(lán)藻（念珠藻Nostoc sp.、魚(yú)腥藻Anabaena sp.、產(chǎn)毒銅綠微囊藻Toxic microcystis、不產(chǎn)毒銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa），2種海水藍(lán)藻（鈍頂螺旋藻Spirulina platensis、聚球藻Synechococcus），以上藻種標(biāo)準(zhǔn)株均購(gòu)自廈門(mén)譜藍(lán)生物科技公司；5種水生氣單胞菌（殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、舒氏氣單胞菌Aeromonas schubertii、維氏氣單胞菌Aeromonas veronii、溫和氣單胞菌Aeromonas sobria），3種人體共生菌（長(zhǎng)雙歧桿菌Bifidobacterium longum、大腸桿菌Escherichia coli、白色念珠菌Candida albicans），以上菌種均購(gòu)自廣東省微生物研究所；人類(lèi)女性基因組DNA 9947A購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)兔樣本

經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：L2020064）后，選取38只普通級(jí)新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，雌雄參半，體重在2 ～ 2.5 kg之間，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。

實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為甲、乙、丙三組：甲組為溺死組（drowned group, DG, n ＝ 16），將實(shí)驗(yàn)兔置于兔籠沉入水下溺死，死后在水下浸泡30 min；乙組為死后浸泡組（postmortem submersion group, PSG, n＝16），在遠(yuǎn)離水的地面上采用空氣栓塞法將兔子處死，待確認(rèn)兔子完全死亡后，將兔子置于水下浸泡30 min；丙組為空白對(duì)照組（blank control group, BCG, n＝6），在遠(yuǎn)離水的環(huán)境中采用空氣栓塞法將兔子處死，后將兔子置于解剖臺(tái)上等待解剖。為提高檢出率及避免交叉污染，每只實(shí)驗(yàn)兔均采用一次性器械解剖，分別提取其所有的肺、肝、腎組織。同時(shí)收集溺死地水樣2 L，-80 oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取及定量

藻種和菌種培養(yǎng)液：取1 mL加入到含有細(xì)胞裂解液及研磨珠的PowerBread管中，10 000 r/min離心30 min，棄上清液0.5 mL。

器官組織樣本：取0.5 g，置于PowerBread管中，采用滅菌后的剪刀剪碎，然后于其中加入10 μL的蛋白酶K和10 μL的DTT；恒溫振蕩儀56 oC振蕩3 h，振幅為1 500 r/min。

水樣中浮游生物：取200 mL溺死地點(diǎn)水樣，經(jīng)真空抽濾富集于濾膜上，置于PowerBread管中，采用滅菌后的剪刀將濾膜剪碎，然后于其中加入10 μL的蛋白酶K和10 μL的DTT。

以上三種樣本均采用PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒按說(shuō)明書(shū)提取各自DNA。以Thermo Fisher Scientific公司Qubit熒光定量試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：1 μL樣品DNA，199 μL工作液，振蕩離心，室溫避光孵育3 min，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并測(cè)定DNA 濃度。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期硅藻形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)，針對(duì)廣東省珠江流域內(nèi)常見(jiàn)的硅藻、藍(lán)藻及氣單胞菌等浮游生物，選取其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的6個(gè)特異性基因，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express 3.0.1設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過(guò)NCBI中Primer-BLAST的引物特異性驗(yàn)證，最終篩選出6對(duì)高度特異的引物：ND、UPA、CBR、AER、rPOD、HLYA（表1）。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成這些引物。

表1 篩選所得的引物詳細(xì)信息Table 1 The selected primers and their detailed information

1.5 qPCR檢測(cè)

25 μL的qPCR擴(kuò)增檢測(cè)體系：NuHi?Robustic SYBR Green Mix 12.5 μL，正、反向引物各0.5 μL（濃度均為 10 μmol/L），DNA模板1 μL，擴(kuò)增水10.5 μL。qPCR擴(kuò)增程序參數(shù)：95 oC × 5 min；95 oC × 5 s, 60 oC × 25 s, 40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)分析：60 oC × 1 min，95 oC × 1 min，升溫過(guò)程中收集信號(hào)。使用QuantStudioTM7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，相關(guān)操作按該設(shè)備操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 引物特異性及靈敏度

分別使用上述6對(duì)引物，擴(kuò)增9種硅藻、6種藍(lán)藻、5種水生氣單胞菌以及3種人體共生菌和人類(lèi)基因組DNA 9947A，采用qPCR檢測(cè)方法，驗(yàn)證引物特異性。

經(jīng)Qubit熒光定量?jī)x檢測(cè)所提取的藻種和菌種標(biāo)準(zhǔn)株DNA濃度后調(diào)整至1 ng/μL，續(xù)以10×倍比濃度梯度稀釋6次，用qPCR方法確定上述6對(duì)引物對(duì)各種模板DNA的最低檢測(cè)范圍以確定引物的靈 敏度。

1.7 陽(yáng)性率實(shí)驗(yàn)

使用上述6對(duì)引物，經(jīng)qPCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔的臟器組織；采用微波消解-真空抽濾-自動(dòng)電鏡掃描法（MD-VF-Auto SEM）對(duì)實(shí)驗(yàn)兔的臟器組織及水樣進(jìn)行硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)。參照法醫(yī)學(xué)診斷溺死的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，以肺組織檢出陽(yáng)性為基礎(chǔ)，肝、腎任一組織檢出陽(yáng)性，則診斷為溺死。

計(jì)算上述6對(duì)引物產(chǎn)物的總體檢測(cè)陽(yáng)性率，與MD-VF-Auto SEM法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率相比較，分析兩種方法對(duì)溺死診斷的有效性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0做統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)分布類(lèi)型，選擇Fisher精確性檢驗(yàn)比較上述6對(duì)引物分別對(duì)38只實(shí)驗(yàn)兔的溺死診斷正確率和38只實(shí)驗(yàn)兔的所有肺、肝、腎樣本的溺死診斷陽(yáng)性率是否與MD-VF-Auto SEM法具有顯著性差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α ＝ 0.05，若P＜ 0.05，則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性和靈敏度

經(jīng)qPCR，用ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD等6對(duì)引物分別擴(kuò)增上述的硅藻、藍(lán)藻、氣單胞菌、人體共生菌以及人基因組DNA。結(jié)果顯示：ND引物能特異擴(kuò)增舟形藻、三角褐指藻和旋鏈角毛藻；UPA引物能特異擴(kuò)增小環(huán)藻、針桿藻、菱形藻、威氏海鏈藻、中肋骨條藻和隱秘小環(huán)藻；CBR能特異擴(kuò)增念珠藻、魚(yú)腥藻、產(chǎn)毒銅綠微囊藻、不產(chǎn)毒銅綠微囊藻、鈍頂螺旋藻和聚球藻；AER能特異擴(kuò)增殺鮭氣單胞菌；HLYA能特異擴(kuò)增嗜水氣單胞菌和舒氏氣單胞菌；rPOD能特異擴(kuò)增維氏氣單胞菌和溫和氣單胞菌。

6對(duì)引物均不能擴(kuò)增長(zhǎng)雙歧桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌等3種人體共生菌的DNA以及人基因組DNA 9947A，表明上述引物特異性較好，在尸體溺死診斷中不會(huì)受到宿主因素的影響。

Qubit測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)株DNA濃度并調(diào)整至1 ng/μL及10×倍比濃度梯度稀釋6次后，qPCR方法測(cè)定上述6對(duì)引物對(duì)各種模板DNA的最低檢測(cè)范圍而確定引物的靈敏度為：除UPA對(duì)菱形藻的檢測(cè)下限為0.001 ng外，其余引物對(duì)其特異擴(kuò)增的藻種或菌種均能達(dá)到0.000 1 ng的檢測(cè)下限，表明該溺死診斷方法靈敏度較高，能夠在一定程度上解決因尸體腐敗而造成的部分檢材降解的診斷難題。

2.2 實(shí)驗(yàn)兔檢測(cè)結(jié)果

利用上述6對(duì)引物，經(jīng)qPCR方法分別檢測(cè)了38只實(shí)驗(yàn)兔（16只溺死兔，16只死后入水兔，6只空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)兔）的肺、肝、腎組織及溺死所用水樣，結(jié)果表明，16只溺死實(shí)驗(yàn)兔的肺、肝、腎組織和溺死水樣皆有不同程度的檢出（表2）；在16只死后入水實(shí)驗(yàn)兔和6例空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)兔的肺、肝、腎組織檢測(cè)中，只有5例死后入水兔的肺組織檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，檢出引物分別是ND、UPA、AER和rPOD（如圖1所示），同時(shí)這5例肺組織的掃描電鏡觀(guān)察到的硅藻大多是小環(huán)藻和菱形藻等硅藻屬（如圖2所示），表明在硅藻檢測(cè)方面，MD-VF-Auto SEM和qPCR兩種方法具有一定程度的一致性。

表2 兔子樣本浮游生物檢出率Table 2 The detection rate of plankton from the handling-different sampling rabbits killed

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

qPCR和MD-VF-Auto SEM兩種方法對(duì)38只實(shí)驗(yàn)兔的診斷正確的結(jié)果以及對(duì)38只兔子的所有肺、肝、腎組織的診斷陽(yáng)性分析的結(jié)果分別見(jiàn)表3，經(jīng)Fisher精確性檢驗(yàn)分析，上述兩種方法對(duì)該38只實(shí)驗(yàn)兔的總體檢測(cè)診斷結(jié)果差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.49＞0.05），對(duì)38只實(shí)驗(yàn)兔的所有肺、肝、腎樣本檢測(cè)的結(jié)果診斷陽(yáng)性率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＝0.29＞0.05）。

表3 實(shí)驗(yàn)兔診斷結(jié)果匯總分析表Table 3 Summary about the diagnosis results from the experimental rabbits

這表明在溺死診斷方面，本文所建立的qPCR方法和MD-VF-Auto SEM法一樣，具有較高的準(zhǔn)確性，具有應(yīng)用于實(shí)際檢案中的潛能。

3 討論

3.1 對(duì)所選6對(duì)引物的評(píng)價(jià)

溺死研究，不少學(xué)者采用多種技術(shù)、多層次分析診斷，比如形態(tài)學(xué)層次的硅藻電鏡檢驗(yàn)方法，分子生物學(xué)層次的藻類(lèi)16S rRNA、SSU以及水生氣單胞菌areA等基因靶點(diǎn)的PCR-CE檢測(cè)方法。

基于以上研究，本文選擇珠江水體中常見(jiàn)的浮游生物，包括硅藻、藍(lán)藻、水生氣單胞菌等，針對(duì)不同物種的不同基因，設(shè)計(jì)特異性引物（ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD）。

經(jīng)過(guò)特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，引物ND、UPA能夠特異性擴(kuò)增小環(huán)藻、針桿藻、舟形藻、菱形藻等硅藻屬；引物CBR能夠特異擴(kuò)增念珠藻、聚球藻、魚(yú)腥藻等藍(lán)藻屬；而針對(duì)水中常見(jiàn)的水生氣單胞菌如殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌以及維氏氣單胞菌等，引物AER、HLYA和rPOD則能分別完成特異性擴(kuò)增。而用上述6對(duì)引物對(duì)常見(jiàn)的人體共生菌（長(zhǎng)雙歧桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌）以及人類(lèi)基因組DNA 9947A擴(kuò)增檢測(cè)均呈陰性，故正常條件下，上述引物在實(shí)際案件檢測(cè)中不會(huì)受到人體宿主DNA及體內(nèi)常見(jiàn)共生菌的干擾，具有較高的特異性。

同時(shí)，引物靈敏度實(shí)驗(yàn)表明，除引物UPA對(duì)菱形藻的檢測(cè)下限為0.001 ng外，其余引物對(duì)其特異擴(kuò)增的藻種或菌種均能達(dá)到0.000 1 ng的檢測(cè)下限，擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線(xiàn)平穩(wěn)，峰尖且窄，表明該6對(duì)引物靈敏度較高，能夠在一定程度上解決因尸體腐敗而造成的部分檢材降解的診斷難題。

應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)已知的溺死/非溺死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體中的水生浮游生物（硅藻、藍(lán)藻、氣單胞菌屬）DNA分子標(biāo)記，在16例已知溺死動(dòng)物尸體中有14例檢出水生浮游生物，剩余2例只在肺中檢出而肝、腎未檢出，根據(jù)硅藻檢驗(yàn)結(jié)果診斷溺死原則，該2例檢出結(jié)果不能判定為陽(yáng)性。

此外，在16例死后浸泡以及6例空白對(duì)照的實(shí)驗(yàn)兔肺、肝、腎組織檢驗(yàn)中，有5例死后浸泡實(shí)驗(yàn)兔的肺組織檢出陽(yáng)性，而肝、腎則為陰性，表明這5例的檢出結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相一致，均為死后浸泡，即非溺死。此5例的肺組織檢驗(yàn)呈陽(yáng)性，可能是它們?cè)谒薪輹r(shí)，水中浮游生物經(jīng)呼吸道進(jìn)入到肺組織所致。

上述結(jié)果表明以qPCR法為基礎(chǔ)的浮游生物DNA檢測(cè)方法具有可行性，對(duì)溺死案件的診斷能起幫助作用。

3.2 對(duì)建立的qPCR方法的評(píng)價(jià)

按照溺死標(biāo)準(zhǔn)，本研究中16例溺死實(shí)驗(yàn)兔的肺、肝、腎組織以及溺死所用水樣經(jīng)MD-VF-Auto SEM法檢驗(yàn)浮游生物，結(jié)果陽(yáng)性率均為100%，而qPCR檢測(cè)方法對(duì)肺、肝、腎以及溺死所用水樣的浮游生物檢出率分別為100%、81.25%、87.50%和100%，總檢出率為87.50%；16例死后浸泡兔的檢測(cè)，MDVF-Auto SEM法和qPCR法都只在5例肺組織中檢出陽(yáng)性：掃描電鏡下觀(guān)察主要為小環(huán)藻和菱形藻等硅藻屬，但數(shù)量不多，計(jì)算總數(shù)分別為36個(gè)/10 g肺組織和41個(gè)/10 g肺組織；qPCR的檢出陽(yáng)性引物分別為UPA、ND、AER和rPOD，硅藻檢出結(jié)果與掃描電鏡檢出結(jié)果相一致。因掃描電鏡觀(guān)察細(xì)菌的前處理操作較為復(fù)雜，且對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及儀器的要求更嚴(yán)格，本次實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)菌層面下兩種方法的比較。

MD-VF-Auto SEM方法檢材用量較多（肺3 g、肝10 g 和腎10 g），過(guò)程耗時(shí)，且易產(chǎn)生污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境的酸霧或污染物，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作技術(shù)要求也高，故難以同時(shí)處理大量樣本。qPCR法檢材用量少（肺、肝和腎各 0.5 g），從DNA提取到qPCR結(jié)束僅需4～6 h，分析擴(kuò)增曲線(xiàn)即可得到結(jié)果，無(wú)須電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)，又不產(chǎn)生環(huán)境污染物，因而有利于處理大量樣本。且在檢測(cè)全面性上，本研究建立的qPCR檢測(cè)方法能同時(shí)檢測(cè)硅藻屬、藍(lán)藻屬以及氣單胞菌屬。因此，在大規(guī)模快速篩查檢測(cè)方面，qPCR法更具優(yōu)勢(shì)。

但是需要指出的是，在診斷準(zhǔn)確率方面中，qPCR法稍低于MD-VF-Auto SEM法，原因可能是：

1）檢材提取因素：溺死過(guò)程中，浮游生物進(jìn)入各器官、組織后并不是均勻分布，qPCR法的單次檢材提取量較少（肺、肝、腎均0.5 g），取材覆蓋面較低，可能無(wú)法包含組織中所有的浮游生物，從而導(dǎo)致診斷準(zhǔn)確率低于檢材提取量多（肺3 g、肝10 g、腎10 g）的電鏡法。

2）浮游生物活性因素：電鏡法為藻類(lèi)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，觀(guān)察到的是藻類(lèi)堅(jiān)硬的外殼，即使藻類(lèi)活性喪失，其外殼仍不受影響，電鏡下仍可檢出陽(yáng)性。而qPCR法為核酸檢驗(yàn)，浮游生物的活性喪失、提取方法不夠成熟導(dǎo)致的DNA缺失等問(wèn)題就會(huì)直接影響到后續(xù)的DNA模板質(zhì)量，從而導(dǎo)致該法的診斷準(zhǔn)確率較電鏡法略低。

綜上，本研究基于硅藻、藍(lán)藻和氣單胞菌檢測(cè)所建立的qPCR溺死診斷方法，雖存在診斷準(zhǔn)確率稍低的問(wèn)題，但其具有所需檢材少、檢測(cè)周期較短、檢測(cè)通量大等優(yōu)點(diǎn)，隨qPCR檢測(cè)和DNA提取技術(shù)的不斷完善，將其與MD-VF-Auto SEM法聯(lián)用，將能極大提高硅藻以及其他浮游生物在溺亡者內(nèi)臟中的檢出率，降低電鏡法所致的假陽(yáng)性率，增強(qiáng)溺死相關(guān)浮游生物檢驗(yàn)診斷溺死的證據(jù)力。盡管現(xiàn)在還缺少qPCR診斷溺死的標(biāo)準(zhǔn)，但該法作為溺死診斷的輔助性手段，對(duì)于溺死樣本的快速篩查檢驗(yàn)相關(guān)技術(shù)研發(fā)與拓展應(yīng)會(huì)有較好的應(yīng)用前景。