正交試驗優(yōu)選通癃顆粒提取工藝

陳淼，李曙光，楊淡梅

（1.中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院第二門診點，陜西 西安 710054；2.廣東省深圳市中醫(yī)院深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033；3.廣東省深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057）

通癃顆粒為醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗方，由山茱萸、熟地黃等10味中藥材組方，具有溫腎通陽、清熱通淋等功效，用于治療腎虛血瘀證，癥見尿頻、夜尿增多、尿流變細、尿無力、尿余瀝不盡、腰膝酸軟等。臨床多以湯劑使用，但煎煮麻煩、攜帶不便、不易保存，難以保證煎煮質(zhì)量。顆粒劑使用和攜帶方便，穩(wěn)定性好，生產(chǎn)參數(shù)穩(wěn)定，質(zhì)量均一性較好。本研究中在原臨床湯劑制備工藝的基礎(chǔ)上，以臨床用藥煎煮條件為基礎(chǔ)，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化其提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-250E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；Sartoris BP 211D型電子分析天平（德國Sartoris公司，精度為0.01 mg）；101-2-BS-Ⅱ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

毛蕊花糖苷對照品（批號為111530-201713，純度為92.5%），馬錢苷對照品（批號為111640-201707，純度為99.2%），莫諾苷對照品（批號為11998-201703，純度為97.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，德國默克公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水；山茱萸、熟地黃、車前子等藥材均由深圳市宏盛昌藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)廣東省深圳市中醫(yī)院藥檢室簡曉莉副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：毛蕊花糖苷為乙腈-0.1%醋酸溶液（15∶85，V/V）［1］125，［2］，馬錢苷和莫諾苷為乙腈（A）-0.3%磷酸溶液（B）、梯度洗脫（0～20 min時7%A，21～50 min時7%A→20%A）［1］27，［3］；流速：1.0 mL/min；檢測波長：334 nm（毛蕊花糖苷）和240 nm（馬錢苷和莫諾苷）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取毛蕊花糖苷、馬錢苷、莫諾苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為200.910，222.100，209.520 μg/mL的對照品貯備液。取上述毛蕊花糖苷對照品貯備液適量，配制成質(zhì)量濃度 分 別 為4.018 2，10.045 5，20.091 0，40.182 0，100.455 0 μg/mL的系列毛蕊花糖苷對照品溶液；取馬錢苷、莫諾苷對照品貯備液適量，配制成馬錢苷和莫諾苷 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為4.442，8.884，22.210，44.420，111.050 μg/mL和4.190，8.381，20.952，41.904，104.760 μg/mL的系列馬錢苷和莫諾苷對照品溶液。

供試品溶液：按處方比例稱取各中藥飲片（2倍處方量），共9份，每份320 g，按擬訂工藝煎煮，濾過，合并濾液，濃縮至約200 mL，放冷至室溫，加水定容至250 mL，分別編號為1～9號，備用，即得供試品貯備液。精密吸取供試品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例稱取中藥飲片2份（分別不含熟地黃、山茱萸），按供試品貯備液制備方法分別制備缺熟地黃和山茱萸的陰性樣品貯備液，按供試品溶液制備方法分別制備缺熟地黃和缺山茱萸的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.1.2項下5種溶液，按2.1.1項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果毛蕊花糖苷、馬錢苷、莫諾苷的分離度均大于2.0，在供試品溶液與對照品溶液色譜中均有相應(yīng)色譜峰，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

1.毛蕊花糖苷2.馬錢苷3.莫諾苷A-B.對照品溶液C-D.供試品溶液E-F.陰性對照品溶液（分別缺熟地黃和山茱萸）圖1 高效液相色譜圖1.Verbascoside 2.Loganin 3.Morroniside A-B.Reference solution C-D.Test solution E-F.Negative reference solution（lack of Rehmanniae Radix Praeparata and Corni Fructus，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.1.2項下系列毛蕊花糖苷對照品溶液、馬錢苷和莫諾苷對照品溶液各10 μL，分別按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y毛=12.386 1X毛-29.395 8（r=0.999 1，n=5），Y馬=27 986.76X馬+14 731.16（r=0.999 9，n=5），Y莫=43 126.99X莫+21 171.56（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷、馬錢苷、莫諾苷質(zhì)量濃度分別在4.018 2～100.455 0 μg/mL、4.442～111.050 μg/mL、4.190～104.760 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取2.1.2項下毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷對照品溶液各適量，倍比稀釋，按2.1.1項下色譜條件分別進樣測定，以信噪比（S/N）為10時的進樣量為定量限，以S/N為3時的進樣量為檢測限。結(jié)果毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷的定量限分別為6.17，1.59，1.64 ng，檢測限分別為1.85，0.48，0.49 ng。

精密度試驗：取2.1.2項下毛蕊花糖苷對照品溶液、馬錢苷和莫諾苷對照品溶液各適量，分別按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD分別為0.56%，0.43%，0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2項下1號供試品貯備液，分別于0，2，4，8，12 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為0.67%，0.83%，0.88%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取2.1.2項下1號供試品貯備液6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷的含量分別為21.03，20.35，32.50 μg/mL，RSD分別為0.84%，1.11%，1.07%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品貯備液（毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度分別為21.03，20.35，32.50 μg/mL）1 mL，共9份，按50%，100%，150%分別加入毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2 干膏得率測定

精密吸取各樣品濃縮液20 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，100℃水浴蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，按2015年版《中國藥典（四部）》0831項下干燥失重法測定，計算干膏得率。

干膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%

式中，W為20 mL濃縮液中干浸膏質(zhì)量；V為定容體積；Wt為飲片質(zhì)量。

2.3 L9（34）正交試驗優(yōu)選提取工藝

正交試驗設(shè)計與結(jié)果：通癃顆粒為醫(yī)院協(xié)定處方，臨床長期使用，日常的煎煮條件為中藥飲片加水沒過藥面2 cm（約10倍量水），煎煮2次，每次1.5 h。本研究中根據(jù)臨床經(jīng)驗和預(yù)試驗，并參考文獻［4-5］，以加水量（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為考察因素，以指標(biāo)性成分毛蕊花糖苷含量、馬錢苷和莫諾苷含量及干膏得率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗優(yōu)選通癃顆粒的提取工藝。同時，按公式計算綜合評分。因素與水平見表2，L9（34）正交試驗及結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

綜合評分=（40/最大干膏得率）×干膏得率+（30/最大毛蕊花糖苷含量）×毛蕊花糖苷含量+（30/最大馬錢苷和莫諾苷含量）×馬錢苷和莫諾苷含量

方差分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。方差分析結(jié)果見表4。由表3可知，各因素影響大小順序為提取次數(shù)＞提取時間＞加水量，綜合評分最高工藝組合為A3B3C3。由表4可知，提取次數(shù)對綜合評分結(jié)果有顯著影響，而提取時間和加水量無顯著影響；提取次數(shù)對干膏得率有顯著影響；各因素對毛蕊花糖苷含量均無顯著影響，對馬錢苷和莫諾苷含量均有顯著影響。綜合考慮，為了降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)周期等，選擇A1B1C3為優(yōu)選工藝，即加8倍量水，提取3次，每次1.0 h。

表3 L9（34）正交試驗及結(jié)果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

2.4 驗證試驗

為確定該水煎煮工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，按處方比例稱取飲片3份，每份320 g，按正交試驗優(yōu)選工藝參數(shù)進行驗證試驗，所得提取液加水定容至250 mL。按2.1.1項下色譜條件進樣測定，并計算干膏得率，毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷含量。結(jié)果見表5，表明工藝合理、可行。

表5 驗證試驗結(jié)果Tab.5 Results of the verification test

3 討論

通癃顆粒方中，熟地黃為君藥，具有補血滋陰、益精填髓功效，含有環(huán)烯醚萜、單萜和糖苷、氨基酸等化學(xué)成分。熟地黃多糖能增強機體造血功能和免疫力，有抗氧化、抗突變、中樞抑制作用。熟地黃水提取液能增強記憶功能，具有抗焦慮、抗腫瘤及促進內(nèi)皮細胞增殖作用；其有效成分毛蕊花糖苷具有抗自由基損傷、抑制細胞內(nèi)鈣超載、抗神經(jīng)毒性等活性，具有降低血液黏度、抗血小板聚集、保護神經(jīng)等藥理學(xué)作用［6］。山茱萸為臣藥，具有補益肝腎、收澀固脫功效，主要含有苷類（馬錢苷和莫諾苷等）、揮發(fā)性成分、多糖、有機酸類、鞣質(zhì)類等成分，具有保護肝臟和腎臟、抗糖尿病、抗氧化等藥理學(xué)作用［7-9］。2015年版《中國藥典（一部）》中熟地黃、山茱萸飲片分別以毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷作為指標(biāo)性成分［1-2］。故本研究中以君臣藥中指標(biāo)性成分毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷的含量作為正交試驗的評價指標(biāo)，綜合評分權(quán)重均定為30%。中藥提取成分濃縮為干膏，干膏得率對中藥提取效果具有重要意義。故設(shè)定干膏得率權(quán)重為40%。

本研究中最終確定的提取工藝為加8倍量水，提取3次，每次1 h。按此工藝進行驗證試驗，測得平均干膏得率為17.21%，毛蕊花糖苷、馬錢苷和莫諾苷的平均含量分別為24.78 μg/mL和53.92 μg/mL?？梢?，該提取工藝穩(wěn)定、可行，可為通癃顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。