基于生物信息學(xué)篩選影響Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)基因

陳 國，田黎民，李曉平

（1.廣東省汕頭潮南民生醫(yī)院腫瘤綜合外科，汕頭 515154；2.湖北恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院病理科，恩施 445000；3.廣東省江門市中心醫(yī)院胃腸外科，江門 529000)）

據(jù)統(tǒng)計，截至2020年美國每年結(jié)腸癌新發(fā)病例147 910例，死亡53 200例；我國結(jié)腸癌年新發(fā)病例約376 000例，死亡191 000例[1-2]。結(jié)腸癌已經(jīng)成為最常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅著人類健康。腸癌一旦發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則定義為Ⅲ期，而Ⅲ期腸癌的術(shù)后輔助治療是基于5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案?？v使接受了標準療程的輔助治療，仍有40%以上的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3-4]。分辨出Ⅲ期結(jié)腸癌患者中的高?；颊?、尋找潛在的治療靶點具有重要意義。但目前針對Ⅲ期結(jié)腸癌的研究非常有限，本研究擬根據(jù)生物信息學(xué)方法，通過大數(shù)據(jù)平臺篩選出影響Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵基因，以便為后續(xù)的實驗室研究提供相應(yīng)的靶基因。

1 材料與方法

1.1 篩選患者相關(guān)數(shù)據(jù)

下載并篩選Ⅲ期腸癌患者的轉(zhuǎn)錄組核糖核酸測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后信息。從TCGA（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）數(shù)據(jù)庫中收集所有結(jié)腸癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床數(shù)據(jù)信（腫瘤位置包括升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸）[5]。從中篩選出臨床分期為Ⅲ期的患者，共篩選出126例Ⅲ期結(jié)腸癌的患者，包含126例結(jié)腸癌的癌組織和8例癌旁組織。

1.2 篩選差異表達基因

NetworkAnalyst（https：//www.networkanalyst.ca）是一個專門用于轉(zhuǎn)錄組基因表達數(shù)據(jù)分析的在線網(wǎng)站[6]。在該網(wǎng)站中，以P＜0.01以及|logFC|≥1為條件篩選出Ⅲ期結(jié)腸癌患者的癌組織和癌旁組織的差異表達基因。通過該網(wǎng)站繪制出描述差異基因表達情況的火山圖。

1.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對1.2中篩選出的差異基因進行功能富集分析和KEGG通路富集分析。具體步驟如下：首先，從NetworkAnalyst網(wǎng)站中得到差異表達基因的基因名稱，通過Ensembl數(shù)據(jù)庫，將所有差異表達基因的基因名裝換為Gene symbol形式。其次，通過可視化數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站（the Database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）對差異基因進行功能分析（https：//david.ncifcrf.gov/）[7]。P＜0.01表示富集分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義?；虮倔w論（gene ontology，GO）功能富集分析結(jié)果主要包括生物學(xué)的分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biology process，BP）和細胞成分（cellular component，CC），而KEGG通路富集分析則用于分析差異表達基因的信號通路。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及模塊分析

首先，利用蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/）構(gòu)建之前篩選出的差異表達基因，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將可信度≥0.7作為篩選條件[8]；其次，利用Cytoscape軟件將差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖可視化；最后，利用Cytoscape軟件上篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)圖上的核心模塊和核心基因。

1.5 核心基因的生存分析

在RNA序列表中找到所有Ⅲ期結(jié)腸癌患者核心基因的表達值，計算每個核心基因的中位值并以此為臨界值，把Ⅲ期結(jié)腸癌患者高表達組和低表達組，利用Graphpad軟件繪制患者每個基因的Kaplan-Meier生存曲線，P≤0.05提示該基因的高低表達組中對生存影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 分析與預(yù)后相關(guān)的基因突變位點

利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（www.cbioportal.org）來顯示基因突變的頻率（基因的擴增、突變、拷貝數(shù)增加以及基因的缺失）[9]，所有操作步驟均按照cBioPortal網(wǎng)站在線操作指南進行。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料

126例Ⅲ期結(jié)腸癌患者中，其中男性62例（49.21%），女性64例（50.79%）；平均年齡為（65.32±13.88）歲；有淋巴脈管浸潤者95例（75.40%）；T分期中T2、T3、T4分別為10例（7.94%）、100例（79.37%）、16例（12.70%）；N分期中N1、N2分別為77例（61.11%）、49例（38.89%）；腺癌104例（82.54%），黏液癌22例（17.46%）；臨床分期中ⅢA、ⅢB、ⅢC期分別為31例（24.60%）、56例（44.44%）、39例（30.95%）。

2.2 差異基因的篩選

通過篩選TCGA下載的結(jié)腸癌患者數(shù)據(jù)，我們獲得了126例Ⅲ期結(jié)腸癌的RNA測序數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床隨訪信息；我們利用NetworkAnalyst在線網(wǎng)站進行差異基因分析，比較了126個結(jié)腸癌組織與8個癌旁正常組織之間差異表達基因，共獲得991個差異表達基因（以P＜0.01以及|logFC|≥1的篩選條件）。根據(jù)NetworkAnalyst網(wǎng)站這991個差異表達基因的表達情況以火山圖的形式進行呈現(xiàn)，如圖1所示。

圖1 Ⅲ期結(jié)腸癌患者中差異表達基因

2.3 差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

為更好地了解上述篩選出的991個差異表達基因的功能，利用David對991個差異表達基因進行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。BP富集結(jié)果顯示差異基因主要富集于化學(xué)突觸傳遞、多巴胺能神經(jīng)元分化和離子跨膜轉(zhuǎn)運（圖2a）；CC結(jié)果表明，差異基因在胞外區(qū)、胞外間隙和核周體這些部位成分較為豐富（圖2b）；MF結(jié)果表明，差異基因主要富集于分子結(jié)構(gòu)活性、延遲鉀通道活動和絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性（圖2c）。同時，KEGG通路富集分析表明，差異基因在環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用相關(guān)通路中功能較為活躍（圖2d）。

圖2 差異表達基因的GO和KEGG通路富集分析

2.4 利用PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)尋找核心基因及核心模塊

PPI蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)能夠用來說明蛋白質(zhì)之間的相互作用，本研究中，利用STRING數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建991個差異表達基因的PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖3a），利用最小相互作用分數(shù)≥0.7的條件篩選出了532個候選基因；為了找到差異表達基因之間的相互關(guān)系，利用Cytoscape軟件以節(jié)點分數(shù)=0.2，K值=2.0作為篩選條件，篩選出了候選基因中相互作用最為密切的一個模塊（圖3b），通過篩選獲得20個核心的基因，包括NPY、CASR、NPY2R、PENK、CCL16、SST、HTR1D、CXCL5、CNR1、PYY、CXCR5、PPBP、INSL5、P2RY4、P2RY12、GALR1、GNG8、GNG13、CHRM2以及TAS1R1基因。

圖3 蛋白互助網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 生存分析

分別計算上述20個基因在126例患者中的中位表達量，并以此作為介值，高于中位表達量的患者認為是高表達組，低于中位表達量的患者被認為是低表達組；據(jù)此將我們篩選出來的126例患者分為高表達組和低表達組。如圖4所示，利用Kaplan-Meier生存曲線分析上述20個核心基因高表達組和低表達組的預(yù)后差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者高表達CXCL5或GNG13基因的預(yù)后較差，提示這兩個基因可能是結(jié)腸癌的促癌基因。

圖4 關(guān)鍵預(yù)后基因生存曲線

2.6 核心基因的突變位點分析

通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析CXCL5和GNG13基因發(fā)生錯義突變、深度缺失和擴增幾種突變情況的頻率。結(jié)果顯示CXCL5基因的突變率為1.7%，有7個突變位點，其中4個發(fā)生在IL-8結(jié)構(gòu)域；GNG13基因的突變率為0.8%，有1個突變位點，g-γ結(jié)構(gòu)域，見圖5。

圖5 在cBioPortal數(shù)據(jù)庫中檢測結(jié)腸癌患者CXCL5和GNG13基因的變化

3 討論

近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年升高[10]。然而，結(jié)腸癌起病隱匿、進展迅速、容易對化療藥物抵抗等因素導(dǎo)致結(jié)腸癌患者預(yù)后較差[11]。作為一種多因素疾病，結(jié)腸癌的發(fā)病機制復(fù)雜且尚未研究清楚，吸煙、飲酒、肥胖、缺乏鍛煉以及基因突變等因素均會導(dǎo)致疾病的發(fā)生[12]。臨床上，Ⅲ期腸癌被定義為存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而沒有合并遠處轉(zhuǎn)移的患者，此類患者的治療方案為根治手術(shù)聯(lián)合化療。根據(jù)患者的臨床病理因素可以將結(jié)腸癌分為高危組和低危組，選擇不同的治療方案，患者的預(yù)后情況也存在著明顯差異。André等[13]研究認為，高危型患者需要采取8個療程的化療方案治療，低危型患者則僅需要采取4個療程的XELOX化療方案進行治療。但是多種基因與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)，單純采用臨床病理因素劃分結(jié)腸癌患者的危險性，忽略了基因因素對結(jié)腸癌患者發(fā)病的影響。研究[14]顯示，KRAS、NARS以及BRAF基因突變與患者預(yù)后有關(guān)，且能夠指導(dǎo)患者的腫瘤靶向治療；BRAF V600E的突變狀態(tài)能夠?qū)︻A(yù)后進行分層，指導(dǎo)臨床治療；錯配修復(fù)蛋白（MMR）以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的檢測能夠用于篩選Lynch syndrome患者，指導(dǎo)患者的治療。也有關(guān)于人類表皮生長受體因子（HER2）與結(jié)腸癌患者關(guān)系的研究[15]。這些都說明基因在結(jié)腸癌患者的發(fā)病以及治療中的重要作用。

本研究利用大數(shù)據(jù)模式，采用生物信息學(xué)方法，通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選到126例Ⅲ期結(jié)腸癌患者，通過癌組織和癌旁組織的差異性分析，篩選出了991個差異基因，通過功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)主要富集于cAMP信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用相關(guān)通路。劉明心等[16]認為，cAMP信號通路與機體的應(yīng)激、炎癥、免疫及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過靶向cAMP/PKA/CRE信號通路，有助于逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生。瞿根義等[17]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活性配體-受體通路與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性。因而多個研究提示了cAMP信號通路與神經(jīng)活性配體-受體通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，但在Ⅲ期結(jié)腸癌中的作用上不明確，值得后續(xù)研究探討。

本研究通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及MCODE分析法，篩選出20個關(guān)鍵的差異基因。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達CXCL5和GNG13的Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后較差，提示這兩個基因可能是促癌基因。CXCL5是趨化因子家族分泌的信號蛋白。CXCL5作為一種促炎癥和促癌分子，可以介導(dǎo)多種細胞行為，包括腫瘤細胞的遷移和侵襲以及中性粒細胞的轉(zhuǎn)運。CXCL5與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18]。Yu等[19]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)基質(zhì)細胞（MSCs）分泌的CXCL5可促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。Kawagoe等[20]發(fā)現(xiàn)血清CXCL5水平可作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標，CXCL5可促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，高水平的CXCL5可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。血管生成在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，但CXCL5在Ⅲ期腸癌中仍缺乏相應(yīng)研究，其內(nèi)在的信號通路仍值得我們后續(xù)的實驗室分析。GNG13是編碼G蛋白亞基γ13的7-跨膜-螺旋G蛋白偶聯(lián)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子。GNG13是一種γ亞單位，在視網(wǎng)膜、味覺和神經(jīng)組織中均有表達，在味覺傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。Ren等[21]發(fā)現(xiàn)，GNG13在多巴胺能突觸信號通路中起重要作用，與本文的研究一致。GNG13是鈣信號通路中的靶點與骨骼肌的發(fā)育有關(guān)，有助于維持體內(nèi)平衡和再生。癌細胞的生長需要消耗大量的能量，鈣離子保證了能量的供應(yīng)，可能在一定程度上會促進腫瘤的進展。Yi等[22]推測GNG13可能通過細胞毒的抗癌作用抑制乳腺癌細胞。Sun等[23]發(fā)現(xiàn)GNG13是前列腺癌的中樞基因。查閱相應(yīng)的中英文數(shù)據(jù)庫，暫沒有關(guān)于GNG13與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)研究，提示了該基因是本研究首次發(fā)現(xiàn)并提出與Ⅲ期腸癌患者預(yù)后相關(guān)，因而在后續(xù)實驗室研究中具有重要的研究價值。

當(dāng)然，本研究具有一定的局限性。本研究是從生物信息學(xué)的角度發(fā)現(xiàn)了影響Ⅲ期腸癌患者的相關(guān)基因，仍需后續(xù)的實驗研究進行功能驗證及通路分析。

本研究通過生物信息學(xué)方法分析了公共數(shù)據(jù)庫中Ⅲ期結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)錄組水平的mRNA表達情況及臨床隨訪信息，發(fā)現(xiàn)CXCL5和GNG13可能是影響Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后的促癌基因。