過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

吳 珊，蔣 丹，徐廣賢

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，東莞 523000）

急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）起源于淋巴祖細(xì)胞在骨髓、血液和髓外部位的惡性轉(zhuǎn)化和異常增殖，5年的總存活率為45%～90%。ALL的發(fā)病率呈雙峰分布，第一個(gè)高峰發(fā)生在兒童時(shí)期，第二個(gè)高峰發(fā)生在50歲左右[1]。盡管誘導(dǎo)化療的反應(yīng)率很高，但只有30%～40%的成年ALL患者能實(shí)現(xiàn)緩解。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）IFNG-AS1，又稱TMEVPG1或NeST，最初發(fā)現(xiàn)是由于小鼠對(duì)Theiler病毒反應(yīng)差異[2]。研究[3]表明，IFNG-AS1調(diào)控IFN-γ表達(dá)，以及調(diào)控Theiler病毒和沙門(mén)氏菌的應(yīng)答。同時(shí)，IFNG-AS1在免疫性疾病和腫瘤中高表達(dá)，如垂體腺瘤、炎癥性腸病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳腺癌和宮頸癌等。然而，關(guān)于IFNG-AS1在ALL中的機(jī)制作用研究較少。本研究通過(guò)構(gòu)建IFNG-AS1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，以驗(yàn)證IFNG-AS1過(guò)表達(dá)的體外效果，以期為ALL發(fā)病機(jī)制中涉及的靶點(diǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

急性淋巴細(xì)胞白血病jurkat T細(xì)胞株源于本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI 1640培養(yǎng)基（01-100-1A）和胎牛血清FBS（04-001-1A）購(gòu)于美國(guó)Biological Industries公司；TMT Mass Tagging Kits（90064B）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）和SYBR Green qPCR Supermix（11733046）均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；碘乙酰胺（IAA，144-48-9）、二硫蘇糖醇（DTT，16096-97-2）、尿素（57-13-6）、乙二胺四乙酸（EDTA，60-00-4）和硼氫化四乙基銨（TEAB，17083-85-1）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；可表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒購(gòu)于北京合生基因公司。

1.2 細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒侵染

將jurkat T細(xì)胞株置入含5%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞（37℃，5%CO2）。慢病毒侵染jurkat細(xì)胞后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證病毒侵染效率。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)

從IFNG-AS1過(guò)表達(dá)慢病毒侵染的jurkat細(xì)胞中使用TRIzol試劑提取總RNA。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。SYBR Green qPCR Supermix進(jìn)行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT模式對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行量化。GAPDH作為內(nèi)參，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)提取、胰蛋白酶消化和TMT標(biāo)記

用高強(qiáng)度超聲粉碎儀在冰上（8 mol·L-1尿素，1%蛋白酶抑制劑，2 mmol·L-1EDTA）對(duì)jurkat細(xì)胞進(jìn)行3次超聲粉碎（每次4～6 s）。取剩余細(xì)胞碎片，4℃12 000×g離心10 min后收集上清，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。消化時(shí)，用5 mmol·L-1DTT 56℃，30 min還原蛋白溶液，接著通過(guò)11 mmol·L-1IAA室溫暗室孵育15 min。稀釋蛋白質(zhì)樣品直至尿素濃度低于2 mol·L-1。胰蛋白酶37℃消化過(guò)夜，Strata X C18 SPE柱去除多肽后進(jìn)行真空干燥。

1.5 高效液相色譜（HPLC）分離

采用反相高效液相色譜柱（Agilent 300 Extend C18）（5μm顆粒，4.6 mm內(nèi)長(zhǎng)，250 mm全長(zhǎng)）分離胰蛋白酶肽。首先用8%～32%的乙腈（pH 9.0）梯度在60 min內(nèi)將多肽分成60個(gè)餾分。而后組合多肽成9個(gè)餾分，真空離心干燥。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析

多肽溶解在（0.1%甲酸和2%乙腈）溶劑A中，使用EASY-nLC 1000系統(tǒng)進(jìn)行分離。（0.1%甲酸和90%乙腈）溶劑B液相梯度設(shè)置為:0～30 min：8%～16%B；30～55 min：16%～30%B；55～57 min：30%～80%B；57～60 min：80%B，流速恒定為400 nL·min-1。使用超高效液相色譜（UPLC）分離肽段，并置于納米電噴霧離子源（NSI），然后在Orbitrap Fusion Lumos系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）進(jìn)行質(zhì)譜分析（MS）。電噴霧電壓為2.0 kV，利用高分辨率的Orbitrap檢測(cè)并分析肽前體離子和次級(jí)片段。對(duì)于分辨率為60 000的MS掃描，m/z掃描范圍為350～1 550，MS/MS掃描范圍固定起始點(diǎn)100 m/z，分辨率為15 000。

1.7 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

MS/MS數(shù)據(jù)使用Maxquant搜索引擎進(jìn)行處理。蛋白質(zhì)組分析，串聯(lián)質(zhì)譜在SwissProt Human數(shù)據(jù)庫(kù)（包含20 317條序列）中搜索。通過(guò)增加常見(jiàn)污染物數(shù)據(jù)庫(kù)消除蛋白質(zhì)污染對(duì)鑒定結(jié)果的影響。胰酶/P被指定為一種切割酶，最多允許有2個(gè)缺失切割。第一次搜索中前驅(qū)體離子的質(zhì)量容差為20 ppm，主搜索中是5 ppm，片段離子質(zhì)量容差是0.02 Da。Cys的烷基化修飾選擇固定修飾，Met的氧化和N端乙?；揎椷x擇可變修飾。定量方法設(shè)置為T(mén)MT-6plex，用于蛋白質(zhì)鑒定的誤檢率（FDR）和肽譜匹配（PSM）的閾值均低于1%。

1.8 生物信息學(xué)分析

通過(guò)UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行基因本體論（GO）注釋，采用InterProScan軟件將所有未被該數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)注的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列比對(duì)GO注釋。GO注釋將蛋白質(zhì)分為生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能三大類。運(yùn)用WoLF PSORT軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)通路注釋。鑒定蛋白的功能富集分析應(yīng)用Perl module進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定jurkat T細(xì)胞中IFNG-AS1的表達(dá)

提取過(guò)表達(dá)IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞總RNA，驗(yàn)證慢病毒侵染效率。熒光倒置顯微鏡結(jié)果顯示，鏡下觀察到大量綠色熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明IFNG-AS1慢病毒侵染效率較高。qRT-PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IFNG-AS1組的jurkat細(xì)胞組表達(dá)量較空載體組增加約395倍（P＜0.001）。說(shuō)明IFNGAS1過(guò)表達(dá)成功，且效率較高（圖1）。

圖1 過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞系

2.2 過(guò)表達(dá)IFNG-AS1對(duì)jurkat細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的影響

利用LC-MS/MS分析jurkat細(xì)胞中IFNGAS1過(guò)表達(dá)后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，共鑒定出429個(gè)差異表達(dá)蛋白（DEPs），其中188個(gè)下調(diào)，241個(gè)上調(diào)。共獲得402 574個(gè)二級(jí)光譜，鑒定出6 984個(gè)蛋白質(zhì)。質(zhì)譜分析鑒定了50 099個(gè)肽，包括47 898個(gè)特異性肽（圖2A）。本結(jié)果鑒定的相對(duì)分子質(zhì)量為10～100 kDa的蛋白質(zhì)數(shù)量最多（圖2B）。肽段大部分分布在7～20個(gè)氨基酸，符合碎裂方式基于trypsin酶解和HCD的一般規(guī)律（圖2C），具有兩個(gè)以上的肽段（圖2D）。絕大多數(shù)譜圖符合軌道阱質(zhì)譜的高精度特性，一級(jí)質(zhì)量誤差在10 ppm以內(nèi)（圖2E）。在樣本的蛋白定量主成分分析（PCA）結(jié)果中，重復(fù)樣本之間的聚集程度越好代表重復(fù)性越好。各重復(fù)樣本間蛋白質(zhì)定量值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）箱線圖中，整體RSD值越小，定量重復(fù)性越好。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞組和空載體組的RSD＜0.2，即兩組蛋白定量重復(fù)性較好（圖3）。

圖2 IFNG-AS1過(guò)表達(dá)jurkat細(xì)胞表達(dá)改變的蛋白

圖3 重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣本一致性檢驗(yàn)

2.3 定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)過(guò)表達(dá)LncRNA IFNGAS1的jurkat細(xì)胞的差異蛋白篩選

通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)LncRNA IFNG-AS1改變的jurkat細(xì)胞中的DEPs進(jìn)行分析，細(xì)胞中有141個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化（至少增加1.5倍或減少0.67倍，P＜0.05），其中91個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，50個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4）。

圖4 jurkat細(xì)胞中IFNG-AS1調(diào)控蛋白的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

2.4 DEPs的功能分類與注釋

通過(guò)亞細(xì)胞定位分析、同源群/真核同源群（COG/KOG）功能分類和GO分析來(lái)評(píng)價(jià)這141個(gè)DEPs的生物學(xué)功能。亞細(xì)胞定位分析顯示，DEPs廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、胞外間隙和細(xì)胞質(zhì)膜（圖5A）。COG/KOG分類表明，前5種功能分別為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架、翻譯后修飾、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（圖5B）。GO分析注釋將這141個(gè)蛋白質(zhì)分為3類，即生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能（圖5C）。

圖5 過(guò)表達(dá)IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞DEPs的亞細(xì)胞定位、COG/KOG、GO分析的分類和注釋

2.5 過(guò)表達(dá)IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞中相互作用蛋白的功能富集分析

利用GO富集的聚類分析方法，比較過(guò)表達(dá)IFNG-AS1的細(xì)胞中差異蛋白功能的相關(guān)性。生物過(guò)程分析結(jié)果表明，上調(diào)的蛋白與細(xì)胞表面受體信號(hào)通路和中性粒細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，下調(diào)的蛋白與細(xì)胞分裂、脂質(zhì)生物合成有關(guān)（圖6A、圖6B）。細(xì)胞成分分析結(jié)果表明，上調(diào)的蛋白與細(xì)胞質(zhì)膜和分泌顆粒相關(guān)，下調(diào)的蛋白與染色體相關(guān)（圖6C、圖6D）。分子功能結(jié)果顯示，上調(diào)的蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合有關(guān)，下調(diào)的蛋白與DNA作用有關(guān)（圖6E、圖6F）。此外，KEGG通路分析表明，這141個(gè)DEPs在一些基本的生物通路中發(fā)揮作用，包括PPAR信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路（圖7）。

圖6 jurkat細(xì)胞過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1后DEPs的GO富集分析

圖7 jurkat細(xì)胞過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1后DEPs的KEGG富集分析

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞中差異蛋白表達(dá)

為驗(yàn)證基因水平的變化是否與蛋白質(zhì)水平一致，對(duì)所選的蛋白質(zhì)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。選擇LIM結(jié)構(gòu)域蛋白2（LIMD2）、纖維鞘相互作用蛋白2（FSIP2）、肌糖原磷酸化酶（PYGM）、管蛋白-酪氨酸連接酶樣蛋白1（TTLL1）、姐妹染色單體內(nèi)聚蛋白2（ESCO2）、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3B（DNMT3B）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶1（ATP2A1）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示LIMD2、FSIP2、PYGM、TTLL1、ESCO2、DNMT3B、ATP2A1的相對(duì)基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平一致（圖8）。

圖8 qRT-PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)LncRNA IFNG-AS1的jurkat細(xì)胞中差異蛋白變化

3 討論

研究[4]表明，LncRNA IFNG-AS1在人類免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)、生物化學(xué)分析和生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地描述了LncRNA IFNG-AS1過(guò)表達(dá)對(duì)jurkat細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)組譜的影響，以此篩選LncRNA的潛在調(diào)控靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共141個(gè)蛋白在IFNG-AS1過(guò)表達(dá)jurkat細(xì)胞中差異表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明，許多DEPs在生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能、亞細(xì)胞定位和信號(hào)通路中發(fā)揮作用。GO和KEGG通路富集分析表明，本實(shí)驗(yàn)所鑒定的DEPs在幾個(gè)基本的分子功能和生物調(diào)控通路中富集。亞細(xì)胞定位分析表明，DEPs主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。GO分析表明，這些DEPs與細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，具有催化活性和離子結(jié)合功能。KEGG通路分析表明，DEPs參與了多種重要的信號(hào)通路（PPAR信號(hào)通路和PI3K/AKt信號(hào)通路）、代謝通路、DNA復(fù)制的調(diào)控。LncRNA IFNG-AS1通過(guò)激活這些信號(hào)通路，可以判斷出LncRNA在jurkat細(xì)胞的幾個(gè)重要病理反應(yīng)中的作用，包括遷移、侵襲和增殖。此外，通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的深度挖掘，以及qRT-PCR檢測(cè)，最終確定了7個(gè)表達(dá)顯著的差異蛋白。

ESCO2是一種姐妹染色單體內(nèi)聚蛋白，通過(guò)與MCM復(fù)制解旋酶的相互作用促進(jìn)內(nèi)聚[5]。依據(jù)KEGG結(jié)果可得，ESCO2參與了mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有研究[6]表明，ESCO2通過(guò)活化AMPKα抑制mTOR的激活，進(jìn)而降低S6K1的磷酸化水平并抑制RPS6的激活，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)能力減弱。差異蛋白PYGM與糖原代謝有關(guān)，已被證實(shí)在乳腺癌中下調(diào)，其表達(dá)與患者生存時(shí)間相關(guān)[7]。先前的研究表明糖原代謝可能在癌癥進(jìn)展中起著重要作用[8]。與正常組織相比，實(shí)體瘤中糖原含量較高，糖原的正確儲(chǔ)存和管理可能與腫瘤細(xì)胞的生存有關(guān)[9-12]，提示PYGM在腫瘤中可能具有調(diào)節(jié)作用。LIMD2是一種在轉(zhuǎn)移性腫瘤中過(guò)度表達(dá)的小型LIM-only蛋白，通過(guò)直接結(jié)合和激活整合素連接激酶來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤進(jìn)展[13]。FSIP2可作為腎細(xì)胞癌透明細(xì)胞預(yù)后的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志[14]。ATP2A1表達(dá)在乳腺癌患者中高度改變[15]。TTLL1在細(xì)胞重組過(guò)程中在Glu381位點(diǎn)上對(duì)Klf4進(jìn)行聚谷氨酰胺化，阻礙了其賴氨酸48連鎖泛素化，維持了Klf4的穩(wěn)定性，而Klf4聚谷氨?；谡{(diào)節(jié)細(xì)胞重編程和多能性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。DNMT3B作用于活性基因的主要酶甲基化內(nèi)區(qū)，其招募受染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄水平、非編碼RNA和存在的DNA結(jié)合因子機(jī)制調(diào)節(jié)。而DNMT3B表達(dá)的改變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17]。此結(jié)果提示，IFNG-AS1可通過(guò)FSIP2、PYGM、TTLL1和LIMD2的表達(dá)增加，ATP2A1、ESCO2和DNMT3B表達(dá)降低，從而促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)、DNA重組和染色體修飾。本研究驗(yàn)證的7個(gè)DEPs與TMT標(biāo)記定量結(jié)果高度一致，證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在jurkat細(xì)胞中鑒定LncRNA IFNG-AS1的下游效應(yīng)因子。結(jié)果表明LncRNA IFNG-AS1上調(diào)FSIP2、PYGM、TTLL1、LIMD2，下調(diào)ATP2A1、ESCO2、DNMT3B在促進(jìn)ALL進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并提示了LncRNA IFNG-AS1上調(diào)反應(yīng)的復(fù)雜性。本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果為ALL的診斷和治療提出了新的可能策略。