枸杞多糖減輕雷公藤多苷致卵巢顆粒細(xì)胞損傷的研究

楚玉鳳，王 靜，王 彤，崔瑞琴

（寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004）

雷公藤為傳統(tǒng)中草藥中的常用藥，性寒，味苦、辛，有大毒，具有通絡(luò)除痹、祛風(fēng)活血、除濕止痛等功效。雷公藤多苷（tripterygium wilfordii glycosides，GTW）是最常用的雷公藤制劑之一，是從雷公藤根部提取精制而成的脂溶性混合物，由我國(guó)自主研發(fā)的免疫抑制藥，被譽(yù)為“中草藥激素”，對(duì)自身免疫性疾病、腎系病癥、癌癥、皮膚病、移植后抗排異等有確切療效[1]。GTW是一種療效與毒性并存的藥物，即其有效成分和毒性成分為相同物質(zhì)，臨床用藥時(shí)無法精準(zhǔn)區(qū)分GTW的治療與中毒劑量，故GTW在臨床應(yīng)用期間，其毒副作用及不良反應(yīng)被大量報(bào)道，尤其是生殖毒性，嚴(yán)重限制該藥的臨床使用范圍[2]。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是從枸杞子中提取的水溶性多糖物質(zhì)，是枸杞生物活性的重要組成成分。LBP有抗衰老、抗氧化作用，可保護(hù)心臟、肝臟、神經(jīng)及生殖系統(tǒng)，還有抗癌、免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中輻射或化療所致的器官毒性也有保護(hù)作用[3]。LBP對(duì)生殖系統(tǒng)的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在抑制細(xì)胞凋亡、降低氧化損傷及調(diào)節(jié)人體激素分泌等多個(gè)方面[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過研究GTW及LBP對(duì)人卵巢顆粒（SVOG）細(xì)胞增殖與凋亡的影響，探討GTW對(duì)SVOG的毒性作用，以及LBP對(duì)該毒性損傷的減毒作用，以期為雷公藤多苷在臨床用藥的安全性提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 SVOG細(xì)胞來自寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 藥物與相關(guān)試劑 得恩德雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司），95%濃度LBP（寧夏宏德公司），胎牛血清、1640培養(yǎng)液（Gibco公司），胰蛋白酶消化液（0.25%不含EDTA和酚紅）（Solarbio公司），PBS（HyClone公司），CCK8檢測(cè)試劑盒（蘇州優(yōu)逸蘭迪公司），ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特公司），全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin-V-FITC/PI流式檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基公司），Caspase3、Bax（Abmart公司），Bcl-2（Proteintech公司），β-actin（BIOSS公司），羊抗兔、羊抗鼠二抗（Abbkine公司），ECL顯色劑（蘭博利德公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平（先行者，OHAUS公司），WH-861臺(tái)式震蕩器（華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司），離心機(jī)（SC-05，中科中佳公司），流式細(xì)胞儀（Accuri C6，美國(guó)BD公司），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan GO，美國(guó)Thermo公司），ICO150細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)MEMMERT公司），ChemiDoc XRS+凝膠成像儀（美國(guó)BioRad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SVOG細(xì)胞復(fù)蘇后接種于10 cm培養(yǎng)皿中，加入8 mL完全培養(yǎng)基（10%FBS+青、鏈霉素各100μg·mL-1+1640培養(yǎng)液）后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2）。在顯微鏡下觀察細(xì)胞，密度在80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代、凍存。取2代以后對(duì)數(shù)期穩(wěn)定狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 制備不同安全濃度的GTW與LBP溶液 精準(zhǔn)稱取12.8 mg GTW粉末加入100μL DMSO中，渦旋至完全溶解，并用新配完全培養(yǎng)基將其濃度稀釋到0.1%以下，定容至4 mL[5]；稱取2 mg LBP粉末加入2 mL完全培養(yǎng)基中，渦旋溶解。將以上2種母液均經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，包上錫紙，GTW母液避光保存于-20°C備用，LBP母液現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)驗(yàn)時(shí)按濃度需要進(jìn)行配比。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 GTW對(duì)SVOG細(xì)胞存活率的影響 用胰酶消化顆粒細(xì)胞后，以2×104/mL的細(xì)胞濃度接種于96孔板中，100μL/孔，細(xì)胞完全貼壁后用不同濃度的GTW（0、20、40、60、80μg·mL-1）干預(yù)24 h。0μg·mL-1即對(duì)照組，加入等體積的培養(yǎng)基。24 h后棄去所有組的舊培養(yǎng)基，避光條件下每孔加入含有90μL培養(yǎng)基和10μL CCK8溶液的新鮮培養(yǎng)基，孵育1.5 h后于450 nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞存活率（%）=（OD給藥組-OD空白孔）/（OD對(duì)照組-OD空白孔）×100%。每組5個(gè)平行復(fù)孔，每組復(fù)做3次。

1.3.1.2 LBP對(duì)SVOG細(xì)胞因GTW所致?lián)p傷的影響 將傳代后細(xì)胞分為3組：對(duì)照組（等體積無藥物的培養(yǎng)基）、損傷組（60μg·mL-1GTW）、干預(yù)組（在加入60μg·mL-1GTW前24 h加入LBP 200μg·mL-1），加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用CCK8法測(cè)定各組OD值。

1.3.1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察各組細(xì)胞變化 傳代后將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組（等體積無藥物的培養(yǎng)基）、損傷組（60μg·mL-1GTW）、干預(yù)組（在加入60μg·mL-1GTW前24 h加入LBP 200μg·mL-1）種于6孔板，加入對(duì)應(yīng)藥物處理細(xì)胞，24 h后拍照記錄。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)抗苗勒氏管激素（AMH）濃度 細(xì)胞分組、藥物干預(yù)同步驟1.3.1.3，24 h后3 000 r·min-1、4℃離心20 min。各組培養(yǎng)基按說明書操作，檢測(cè)OD值，在Origin 2019軟件中制作標(biāo)準(zhǔn)化曲線，并計(jì)算AMH濃度。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分組及藥物處理同步驟1.3.2。收集3組細(xì)胞培養(yǎng)液以終止無EDTA胰酶對(duì)細(xì)胞的消化，1 500 r·min-1離心5 min，用2 mL PBS重懸細(xì)胞，此步驟重復(fù)2次。加入Binding-Buffer 500μL，吹打與細(xì)胞充分混勻，避光加入5μL Annexin-V-FITC及5μL PI，混勻避光靜置15 min。立即上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 Western blot檢測(cè) 細(xì)胞分組、處理同1.3.3步驟。加入200μL裂解液后冰上靜置30 min裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。40μg/孔加樣，進(jìn)行電泳分離（80～120 V），轉(zhuǎn)膜1 h（200 mA），室溫5%脫脂奶粉慢搖封閉1 h。加入一抗Caspzase3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、鼠抗Bcl-2（1∶3 000）、β-actin（1∶1 000）搖床孵育，4℃過夜。洗膜3次（TBST），10 min/次，分別加入羊抗兔（1∶20 000）、羊抗鼠（1∶10 000）室溫慢搖1 h，洗膜同前，顯色曝光。Image J軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad 7.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GTW對(duì)SVOG細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組比較，0、20、40、60、80μg·mL-1GTW作用于細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率均降低（P均＜0.05），且細(xì)胞存活率隨著GTW濃度的增高而降低，見圖1。

圖1 GTW對(duì)SVOG細(xì)胞存活率的影響

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

顯微鏡下可見，藥物作用24 h后，正常SVOG生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞間緊密連接，大小均一、數(shù)量較多，邊界清楚，透光性良好；損傷組逐漸出現(xiàn)形態(tài)固縮、變圓，細(xì)胞間隙增大，存活細(xì)胞較正常組明顯減少，可見壞死細(xì)胞及凋亡細(xì)胞脫落漂浮于培養(yǎng)基上；與損傷組比較，干預(yù)組存活細(xì)胞數(shù)量較多，損傷程度較輕，見圖2。

圖2 不同藥物組干預(yù)24 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×200）

2.3 對(duì)細(xì)胞活力的影響

損傷組細(xì)胞活力低于對(duì)照組，干預(yù)組細(xì)胞活力高于損傷組（P均＜0.05），見圖3。

圖3 不同藥物干預(yù)后對(duì)SVOG細(xì)胞活力的影響

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中AMH水平變化

損傷組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中AMH水平低于對(duì)照組，干預(yù)組的細(xì)胞培養(yǎng)基上清中AMH水平高于損傷組（P均＜0.05），見圖4。

圖4 不同藥物干預(yù)后對(duì)細(xì)胞AMH分泌水平的影響

2.5 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，經(jīng)GTW處理后的細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；與損傷組比較，干預(yù)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見表1、圖5。

表1 各組細(xì)胞凋亡情況（±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡情況（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05；與損傷組比較#P＜0.05。

分組對(duì)照組損傷組干預(yù)組n 3 3 3細(xì)胞凋亡率/%4.333±0.59 20.90±0.81*15.23±0.23#

圖5 不同藥物干預(yù)后對(duì)各組細(xì)胞凋亡的影響

2.6 Western blot法檢測(cè)Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞Bax、Caspase3蛋白表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)量下調(diào)（P均＜0.05）；與損傷組相比，干預(yù)組細(xì)胞Bax、Caspase3蛋白表達(dá)量下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)量上調(diào)（P均＜0.05），見圖6。

圖6 各組不同藥物干預(yù)后對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

卵巢顆粒細(xì)胞（granulosa cells，GCs）是卵巢的體細(xì)胞，參與卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟及激素生成。GCs與卵母細(xì)胞構(gòu)成了卵泡，GCs提供相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)成熟，卵母細(xì)胞指導(dǎo)支持GCs的增殖分化，二者互給互存，共同促進(jìn)了卵泡的成熟。當(dāng)GCs出現(xiàn)10%以上凋亡時(shí)，會(huì)引起卵泡閉鎖增加，阻礙卵泡發(fā)育[6-7]。GCs過度凋亡會(huì)加速卵泡閉鎖，引起性激素分泌紊亂，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞在數(shù)量和（或）質(zhì)量下降，使卵巢儲(chǔ)備功能減退[8]。在女性生殖系統(tǒng)中，卵巢儲(chǔ)備功能是女性生育能力的體現(xiàn)，故GCs的功能狀態(tài)影響了女性的生育能力。同時(shí)GCs的細(xì)胞毒性程度是評(píng)價(jià)藥物對(duì)卵巢的毒性大小的重要的體外指標(biāo)，因此，GCs常被視作研究雌性生殖及內(nèi)分泌功能的最佳靶細(xì)胞。

AMH為卵巢儲(chǔ)備情況的敏感指標(biāo)，主要由竇前卵泡和小腔GCs分泌并持續(xù)表達(dá)，在始基卵泡及閉鎖卵泡中不表達(dá)。AMH能調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，可判斷生長(zhǎng)卵泡池的大小，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備能力及生殖潛能。AMH不受月經(jīng)周期及性激素變化的影響，且靈敏度優(yōu)于FSH、E2、AFC等指標(biāo)，能更早反映出卵巢儲(chǔ)備功能的變化趨勢(shì)。卵巢功能的減退或衰竭直接反應(yīng)在顆粒細(xì)胞數(shù)量的減少及功能的下降，造成AMH分泌的減少[9-11]。這是本研究選擇顆粒細(xì)胞的凋亡率和AMH作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的依據(jù)。

GTW可損傷女性生殖功能，造成卵巢儲(chǔ)備功能減退或卵巢早衰。臨床上可見月經(jīng)周期紊亂、月經(jīng)量減少，隨著病情的加重逐漸發(fā)展成閉經(jīng)、不孕等[1]。孫鳳等[12]通過Meta分析評(píng)價(jià)GTW在臨床應(yīng)用中生殖毒性的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)GTW組造成生殖毒性的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的5.1倍，出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)隨用藥時(shí)間和劑量的累積而升高。卵巢儲(chǔ)備功能對(duì)女性生育力的保持具有重要作用，育齡期女性長(zhǎng)期服用雷公藤制劑可促進(jìn)生殖細(xì)胞凋亡，加速卵巢功能的衰退。研究[13]發(fā)現(xiàn)，用GTW給小鼠灌胃后可出現(xiàn)小鼠的動(dòng)情周期紊亂、AMH、E2值及體質(zhì)量均降低，卵巢組織萎縮并呈纖維結(jié)締樣或脂肪樣改變，子宮內(nèi)膜較正常組變薄，閉鎖卵泡增多，顆粒細(xì)胞層明顯減少。停藥后小鼠體質(zhì)量雖恢復(fù)，但對(duì)小鼠生殖功能的損傷任然存在。Ai等[14]發(fā)現(xiàn)GTW誘導(dǎo)內(nèi)源性miR-15α表達(dá)，抑制Hippo-YAP通路，從而影響了GCs的正常生理生化，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，促進(jìn)GCs衰老。本研究重復(fù)驗(yàn)證了GTW可損傷GCs功能這一結(jié)果。

GTW為脂溶性制劑，不溶于水。本研究選擇DMSO做溶劑，通過查閱文獻(xiàn)確認(rèn)DMSO濃度在0.1%～0.25%，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)的影響同空白對(duì)照組相似，因此可忽略其對(duì)研究結(jié)果可能造成的偏倚[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，用GTW作用細(xì)胞24 h時(shí)后，細(xì)胞的存活率隨GTW濃度的增加而降低，提示GTW對(duì)GCs增殖有抑制，用LBP干預(yù)后可提高細(xì)胞存活率，說明LBP能夠減輕GTW對(duì)顆粒細(xì)胞增殖抑制的作用強(qiáng)度；同時(shí)，GTW作用后的顆粒細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型的凋亡樣改變（呈固縮、變圓狀），細(xì)胞間隙增大，可見大量壞死及凋亡細(xì)胞，AMH濃度也隨顆粒細(xì)胞的減少而降低；用LBP干預(yù)后細(xì)胞的形態(tài)、培養(yǎng)基中壞死及凋亡細(xì)胞明顯減少，AMH濃度增高，提示LBP可減輕GTW對(duì)GCs的損傷強(qiáng)度。

細(xì)胞凋亡貫穿了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老的過程，是維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，體內(nèi)細(xì)胞的自我更新、調(diào)控的重要機(jī)制[2]。細(xì)胞凋亡主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑。Bcl-2、Bax是內(nèi)源性途徑即線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，二者互為拮抗但同源的兩個(gè)亞群，均屬于Bcl家族。Bcl-2具有抗凋亡特性，可直接阻斷Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保持線粒體膜電位穩(wěn)定。在GCs中，且Bcl-2可促進(jìn)GCs的分裂，降低卵泡閉鎖率；Bax是促凋亡的主要執(zhí)行因子，通過降解細(xì)胞底物降低線粒體的活性，觸發(fā)線粒體膜電位的變化，增加細(xì)胞色素c的釋放加速Caspase3及其下游促凋亡過程[17-18]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是內(nèi)、外源凋亡途徑下游的共同途徑，Caspase3是該途徑的關(guān)鍵因子及標(biāo)志因子。Bcl-2/Bax的比值反映細(xì)胞的凋亡與否。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，Bax表達(dá)上調(diào)，此時(shí)Bcl-2＜Bax，線粒體膜電位降低，加速細(xì)胞凋亡。反之，細(xì)胞存活率增加[19]。本研究結(jié)果顯示，GTW誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與促凋亡蛋白Bax水平升高和抗凋亡蛋白Bcl-2降低有關(guān)。GTW損傷組Caspase3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量增多，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，提示GTW可誘發(fā)GCs的凋亡，推測(cè)其作用機(jī)制是上調(diào)相關(guān)促凋亡蛋白Caspase3、Bax的表達(dá)，加速了細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，引發(fā)生殖損傷；而LBP可有效減輕GTW的生殖損傷強(qiáng)度。本研究結(jié)果可證實(shí)LBP對(duì)GCs凋亡的抑制作用，尚不能確定是否可完全消除GTW對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性作用。

綜上所述，GTW可造成GCs的功能損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率的下降和AMH分泌量的降低，推測(cè)其作用是增加了顆粒細(xì)胞的凋亡率和凋亡分子的表達(dá)量，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡；LBP通過拮抗GTW的部分毒性損傷來完成減毒作用。