桑黃素在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中的相關(guān)機(jī)制

于 婧，馮丹丹，潘文森，*

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)二科，河北 石家莊 050000；2．河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物研究室，河北石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種以高發(fā)病率、高致死率為特點(diǎn)的臨床常見危重癥疾病，主要由于多種致病因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及過(guò)度炎癥，從而表現(xiàn)出急性呼吸窘迫和頑癥性低氧血癥等臨床特征。氧化應(yīng)激是ALI 發(fā)病的關(guān)鍵因素之一， 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶(NADPH oxidase，NOX) 根據(jù)細(xì)胞類型，可分為NADPH 氧 化 酶1(NADPH oxidase 1， NOX1)、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)等[1]，它是正常和病理?xiàng)l件下血管細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要來(lái)源。有研究表明，ROS的增加可誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生和釋放，炎癥細(xì)胞通過(guò)浸潤(rùn)肺組織引起炎癥細(xì)胞的聚集，進(jìn)一步誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[2-3]。因此，抑制ROS的產(chǎn)生，即抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生可能是減緩ALI 發(fā)生發(fā)展的有效策略。桑黃素(morin)是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等多重藥理作用[4-5]。據(jù)報(bào)道[6]，桑黃素可以通過(guò)細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制提供氧化應(yīng)激保護(hù)，從而增加細(xì)胞或生物體階段的抗氧化活性。紅系衍生的核因子2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)-血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是經(jīng)典參與氧化應(yīng)激的通路，當(dāng)Nrf2被激活后，可與抗氧化基因啟動(dòng)子結(jié)合并提高其表達(dá)，從而提高抗氧化系統(tǒng)的活性。HO-1 作為Nrf2 的下游抗氧化酶之一，能在抗炎及抗氧化應(yīng)激中迅速作出反應(yīng)，對(duì)組織損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[7]。在目前針對(duì)急性肺損傷的研究中，關(guān)于桑黃素與氧化應(yīng)激信號(hào)通路中蛋白的作用機(jī)制鮮見報(bào)道。因此本研究通過(guò)建立小鼠體內(nèi)ALI 模型，探究桑黃素對(duì)氧化應(yīng)激表達(dá)和ALI 的影響，以期為桑黃素的藥理學(xué)研究及急性肺損傷疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動(dòng)物雄性健康C57BL/6 小鼠32 只，8~10 周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)環(huán)境中，環(huán)境溫度23~25 ℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均受到人道對(duì)待，符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物福利與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查，審查編號(hào)2022-AE250。

1.1.2 主要試劑和儀器桑黃素、 脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)、 二 甲 基 亞 砜(methyl sulfoxide，DMSO)、細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；NOX1 抗體、NOX4 抗體、Nrf2 抗體、HO-1 抗體和β-actin 抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；Total RNA 提取試劑盒(美國(guó)OMEGA 公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher 公司)；SYBR Green Mix 試 劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)。

NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀、電泳儀及電泳槽(美國(guó)Bio-Rad 公司)；ECL 化學(xué)發(fā)光儀(法國(guó)Vilber Lourmat公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices 公司)；CountessTM自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Invitrogen 公司)；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、多功能顯微鏡(美國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠急性肺損傷模型的構(gòu)建32只C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成4 組即對(duì)照組(生理鹽水)、ALI 模型組(LPS 處理)、LPS+桑黃素低濃度(25 mg/kg)處理組和LPS+桑黃素高濃度(50 mg/kg)處理組，每組8只。處理劑量與方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[8]。首先使用DMSO溶解桑黃素，配置好的桑黃素母液使用生理鹽水稀釋，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組小鼠注射等量的DMSO 稀釋液，適應(yīng)性給藥連續(xù)3 d，觀察小鼠狀態(tài)。第3天注射桑黃素后1 h，將小鼠麻醉經(jīng)氣管滴注給予LPS(6 mg/kg)溶液，使藥液通過(guò)氣道進(jìn)入肺中，直接刺激支氣管及肺組織，對(duì)照組小鼠經(jīng)氣道滴入等體積生理鹽水。給藥處理后觀察小鼠狀態(tài)，待其穩(wěn)定可正?；顒?dòng)后離開，24 h后，小鼠實(shí)施安樂死。肺組織置于離心管中作好組間標(biāo)記并稱取質(zhì)量，部分肺組織置于4%多聚甲醛固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)，其余肺組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值測(cè)定剖取各組小鼠完整左肺，生理鹽水洗去多余血液，然后用濾紙吸干多余水分。稱取每只小鼠的左側(cè)肺組織濕質(zhì)量，標(biāo)記后，放入烘箱，烘干。取烘干肺組織再次稱質(zhì)量，記錄每只小鼠左肺干質(zhì)量。計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比值(W/D)，用來(lái)衡量小鼠肺組織的通透性情況。

1.2.3 切片制備及HE染色取出置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h以上的肺組織標(biāo)本，經(jīng)流水沖洗15 min后，置于包埋盒內(nèi)按以下程序進(jìn)行脫水、透明：70%、80%、90%、95%乙醇各5 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min。取出標(biāo)本后，浸蠟、包埋、切片、烤片。取出切片，按以下程序進(jìn)行脫蠟：組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，95%、90%、80%、70%乙醇各5 min。隨后蒸餾水浸泡5 min，蘇木精染色5 min，可根據(jù)具體染色情況，適當(dāng)增加或減少染色時(shí)間。流水沖洗5 min，1%鹽酸酒精分化。流水沖洗5 min，伊紅染色30 s，根據(jù)染色情況，適當(dāng)增加或減少染色時(shí)間。流水沖洗5 min。然后按以下程序進(jìn)行梯度乙醇脫水：70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 s，100%酒精Ⅲ、組織透明劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min。中性樹膠封片，拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)收取各組肺組織于1.5 mL離心管中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入TRIzol 處理液，按照Total RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。加入引物和SYBR mix配制實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，循環(huán)39次。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)收取各組肺組織于1.5 mL離心管中，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入蛋白裂解液，超聲裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)法定量，加入5×上樣緩沖液混合后沸水浴5 min。10%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropho?resis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(NOX1抗體、NOX4抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體均按照1∶500 濃度稀釋，β-actin 抗體按照1∶1 000 濃度稀釋)孵育、二抗(1∶10 000 濃度稀釋)孵育后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，分別進(jìn)行NOX1、NOX4、Nrf2 和HO-1 蛋白的檢測(cè)。ImageJ圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 桑黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的影響

HE染色后肺組織病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果見圖1，顯示正常對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)規(guī)則，肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)明顯出血或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ALI 模型組小鼠肺組織肺泡塌陷、肺泡壁與肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；桑黃素低劑量(25 mg/kg)處理組小鼠肺泡組織較ALI 模型組病理形態(tài)略有改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。桑黃素高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺泡組織較ALI 模型組病理形態(tài)顯著改善，肺泡壁薄且結(jié)構(gòu)完整清晰，較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。上述結(jié)果提示，桑黃素可有效抑制急性肺損傷小鼠的肺部病變。

圖1 桑黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI肺組織病理學(xué)改變的影響(HE染色，×200倍)

2.2 桑黃素對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織W/D 比值的影響

各組小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值的比較見圖2，與正常對(duì)照組比較，ALI模型組小鼠肺組織W/D 值顯著增加(P＜0.01)。與ALI 模型組比較，桑黃素低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺組織W/D值均顯著降低(P＜0.01)。

圖2 各組小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值

2.3 桑黃素對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織NOX1和NOX4表達(dá)的影響

qPCR 檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，與正常對(duì)照組比較，ALI模型組小鼠肺組織中NOX1和NOX4的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.01)。與ALI模型組比較，桑黃素低劑量(25 mg/kg)和高劑量(50 mg/kg)處理組小鼠肺組織NOX1 和NOX4 的mRNA 表達(dá)量均顯著降低(P＜0.01)。Western blot 檢測(cè)各組肺組織中NOX1 和NOX4 蛋白表達(dá)，得到和mRNA表達(dá)類似的結(jié)果(圖4)。上述結(jié)果表明，桑黃素處理可有效抑制急性肺損傷小鼠肺組織中氧化應(yīng)激的發(fā)生。

圖3 各組小鼠肺組織中NOX1和NOX4 mRNA的表達(dá)情況

2.4 桑黃素對(duì)LPS 刺激下肺組織中Nrf2-HO-1 信號(hào)通路的影響

如圖5所示，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，ALI模型組抗氧化應(yīng)激指標(biāo)Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)；與ALI 模型組比較，桑黃素處理組Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P＜0.05或P＜0.01)。表明桑黃素可通過(guò)Nrf2-HO-1 通路降低LPS 誘導(dǎo)的ALI氧化應(yīng)激水平。

圖5 各組小鼠肺組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)情況

3 討 論

ALI 是一種由各種原因?qū)е碌姆闻菝?xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮損傷、微血管通透性增加而引起的以彌漫性肺水腫和微小肺不張、進(jìn)行性低氧血癥為病理特征的炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。多個(gè)國(guó)家的流行病學(xué)研究報(bào)告顯示，ALI 嚴(yán)重威脅著住院病人的生命健康[9-11]。目前臨床上針對(duì)ALI 和ARDS患者的治療主要依賴機(jī)械通氣、液體管理等手段，缺乏較為有效的藥物治療[12]。因此，發(fā)現(xiàn)更多與ALI 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞通路及作用機(jī)制，篩選出精準(zhǔn)靶向信號(hào)通路和位點(diǎn)從而找到有效治療ALI 的藥物顯得尤為迫切。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展和我國(guó)中醫(yī)藥利好政策的不斷出臺(tái)，中醫(yī)藥的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用得到了快速發(fā)展。越來(lái)越多的研究表明[13-14]，中藥在防治ALI發(fā)生發(fā)展中的作用日益顯著。其中，具有抗氧化和消除自由基作用的黃酮類化合物也引起了大家的關(guān)注。丹參酮IIA、細(xì)辛酮、木犀草素、黃岑黃素等黃酮類化合物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)通路，降低腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)水平抑制炎癥發(fā)生，發(fā)揮抗ALI的作用[15]。研究[4]表明，黃酮類化合物桑黃素能夠通過(guò)清除ROS，提高抗氧化酶的活性發(fā)揮作用。此外，研究[1]還表明，桑黃素能明顯抑制LPS 對(duì)肺組織中性粒細(xì)胞的誘導(dǎo)，并降低肺組織中核苷酸結(jié)合域和富含亮氨酸的重復(fù)序列家族pyrin 結(jié)構(gòu)域包含3(nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體的蛋白水平。因此，我們推測(cè)，桑黃素能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生減輕小鼠急性肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，LPS處理的ALI模型組小鼠肺濕質(zhì)量與干質(zhì)量(W/D)比值顯著升高，肺泡間隔明顯增厚，且肺泡內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，桑黃素處理可有效減少ALI 導(dǎo)致的肺泡水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解了LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷。此外，桑黃素還可顯著降低ALI 小鼠肺組織NOX1和NOX4的表達(dá)。LPS刺激可上調(diào)肺組織中Nrf2和HO-1 蛋白的表達(dá)，桑黃素處理則進(jìn)一步上調(diào)了Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，從而抑制NOX1和NOX4的表達(dá)及氧化應(yīng)激的發(fā)生。結(jié)果表明，桑黃素通過(guò)激活Nrf2-HO-1 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，進(jìn)而減輕ALI的肺泡水腫，抑制肺組織纖維化的形成。

最近的研究表明，氧化應(yīng)激在病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，例如由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒和SARS-CoV-2 引起的病毒感染，特別是在ARDS感染階段[16-17]。Nrf2是細(xì)胞保護(hù)性抗氧化蛋白表達(dá)產(chǎn)物的主要調(diào)節(jié)因子，在防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞和組織損傷中起重要作用。研究[18]表明，Nrf2 能夠參與巨噬細(xì)胞代謝和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并且Nrf2的激活對(duì)包括ALI/ARDS 在內(nèi)的各種肺部疾病均具有保護(hù)作用[19]。HO-1 是Nrf-2 的下游抗氧化劑，激活的Nrf-2 能夠增強(qiáng)HO-1 表達(dá)，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生[20]。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)在肺組織中的表達(dá)情況，證實(shí)桑黃素可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制細(xì)胞中氧化應(yīng)激的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過(guò)建立小鼠體內(nèi)ALI 模型，初步證實(shí)桑黃素可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，緩解ALI 導(dǎo)致的肺泡水腫等損傷。此外，桑黃素的抗氧化作用機(jī)制可能與激活Nrf2-HO-1 信號(hào)通路，抑制NOX1和NOX4的表達(dá)有關(guān)。本研究為尋找ALI的有效治療靶點(diǎn)提供了新的思路。