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    CuInS2/ZnS量子點(diǎn)對人卵顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)與機(jī)制

    2022-06-10 13:55:52劉曉寧徐江垚林桂淼王曉梅郭遂群
    癌變·畸變·突變 2022年3期
    關(guān)鍵詞:顆粒細(xì)胞原代卵母細(xì)胞

    劉曉寧,耿 薔,徐江垚,林桂淼,王曉梅,郭遂群

    (1.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣東廣州 510600;2.深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,廣東 深圳 518100;3.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部國際腫瘤中心,廣東 深圳 518055)

    量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)亦稱作半導(dǎo)體納米晶體,是一種三維尺度均在2~10 nm的半導(dǎo)體納米熒光顆粒,不僅具有光穩(wěn)定性好、抗光漂白,具有寬吸收窄發(fā)射及高生物相容性[1]等優(yōu)良特性,而且熒光強(qiáng)度高、特異性強(qiáng),可用于生物分子的多色標(biāo)記,亦可實(shí)現(xiàn)單分子示蹤,其表面還能作相應(yīng)修飾以獲得良好的生物相容性,故在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2-3],尤其在單分子標(biāo)記、靶蛋白示蹤等活體成像中更具有應(yīng)用前景,但其生物安全性尚不清楚,尤其是對人體卵母細(xì)胞的影響尚缺少報(bào)道,本課題組前期觀察量子點(diǎn)對小鼠卵母細(xì)胞的毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)其主要進(jìn)入顆粒細(xì)胞發(fā)揮作用[4-5]。因人卵母細(xì)胞的特殊稀缺性與倫理限制而很難直接觀察其毒性,顆粒細(xì)胞通過細(xì)胞質(zhì)穿過透明帶與卵母細(xì)胞膜形成縫隙連接,為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的雙向信息交流及新陳代謝物質(zhì)傳遞主要通過縫隙連接蛋白43和連接蛋白45 進(jìn)行[6]??p隙連接的變化可改變卵母細(xì)胞成熟狀態(tài)[7]。本研究采用人超排卵母細(xì)胞周圍的卵顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng),檢測聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修飾的CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)(非鎘量子點(diǎn))對顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng),間接反映納米材料對人卵母細(xì)胞的毒性效應(yīng),為CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)在臨床應(yīng)用中的生物安全性評估提供信息。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    CuInS2/ZnS量子點(diǎn)(Najing Tech公司);透明質(zhì)酸酶(Sigma 公 司); TUNEL Assay 試 劑 盒-FITC 熒 光(Colorimetric,Abcam);Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(DOJINDO公司);CCK-8試劑盒及人卵顆粒細(xì)胞內(nèi)的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH) 與谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)均為國產(chǎn)檢測試劑盒;總RNA 提取試劑盒(成都福際生物公司);Taq Master Mix(Gene Solution 公 司);SYBR?Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio 公司);GoScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega); 雌 二 醇(E2)/孕 酮(P4) 試 劑 盒(Roche Diagnostics公司)。

    主要儀器包括:三氣培養(yǎng)箱(ASTECAPM50D 公司);超凈工作臺(江蘇安泰);單人IVF 工作站(STERILE181ICSIHIMAC 公 司);離 心 機(jī)(Eppendorf 公司);體視顯微鏡(日本,SZX10 公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 公 司);流 式 細(xì) 胞 儀(BD 公司);酶標(biāo)儀(MD公司)。

    1.2 體外獲取人卵巢顆粒細(xì)胞及原代培養(yǎng)

    收集2020 年6 月—2020 年8 月在深圳恒生醫(yī)院生殖中心行體外受精/卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(IVF/ICSI)的不孕癥患者13例超排卵,迅速將吸出的卵泡液及沖洗液倒入培養(yǎng)皿中,用吸管吸出可見的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(oocyte-corona-cumulus complex,OCCs)放入培養(yǎng)液中,示意圖見圖1A。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~4 h后用透明質(zhì)酸酶消化OCCs,收集顆粒細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。所有研究對象均自愿參加,本研究獲深圳恒生醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)編號HSYY-SZ-2019-001)及生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(生殖倫理批準(zhǔn)編號HSYY-SZ-2019-002)通過后采集人體樣本,所有患者均已簽署知情同意書。

    將上述人卵顆粒細(xì)胞收集至離心管,加入M199培養(yǎng)基4 mL,并以1 500 r/min離心5 min。用培養(yǎng)基洗滌兩次,棄去上清液,添加含20% FBS 的M199 培養(yǎng)基重懸,將其接種在培養(yǎng)皿中,然后置于37 °C、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)備用。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)與量子點(diǎn)表征

    將顆粒細(xì)胞分離并置于單獨(dú)培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞貼壁后分組培養(yǎng):設(shè)立PBS 對照組,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)低(1 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)3 個劑量組,培養(yǎng)示意圖見圖1B。使用動態(tài)光散射法測量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的流體動力學(xué)直徑和Zeta 電位。圖1C顯示CuInS2/ZnS量子點(diǎn)的平均流體動力學(xué)直徑約為14~17 nm。圖1D 顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的代表性透射電子顯微鏡圖像,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的Zeta 電位約為-13.52 mV。圖1E 顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)的消光和光致發(fā)光光譜,量子點(diǎn)的發(fā)射峰約為610 nm。

    圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖與量子點(diǎn)表征

    1.4 CCK-8法檢測顆粒細(xì)胞活力

    采用陽性對照藥物5-Fu驗(yàn)證顆粒細(xì)胞對毒性檢測的靈敏性。用透明質(zhì)酸酶消化志愿者卵母細(xì)胞上的顆粒細(xì)胞后,將顆粒細(xì)胞分離并轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞貼壁后,分別將不同濃度的5-Fu添加到培養(yǎng)基中。在顆粒細(xì)胞貼壁后,將5-Fu 設(shè)置7 個濃度(0.031 6、0.1、0.316、1、3.16、10 和31.6 μmol/L)梯度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,24 h后檢查細(xì)胞活力計(jì)算半數(shù)活性抑制濃度(IC50)。隨后顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)1~6 d,使用CCK-8法動態(tài)檢測細(xì)胞存活變化,確定原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞狀態(tài),為后續(xù)毒性檢測確定最佳時(shí)間。并檢測CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 后人卵顆粒細(xì)胞的IC50。細(xì)胞活力檢測按CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行操作,通過酶標(biāo)儀測定各實(shí)驗(yàn)組在450 nm 處的吸光度值計(jì)算細(xì)胞活力,每組設(shè)3 個平行樣,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.5 TUNEL 法和Annexin V/PI 雙染色法分別檢測顆粒細(xì)胞凋亡

    細(xì)胞分組培養(yǎng)后,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 檢測細(xì)胞凋亡情況。TUNEL 法檢測中,按照TUNEL Assay-FITC 熒光試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測細(xì)胞DNA片段化情況。

    Annexin V/PI 雙染色法檢測:調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL,取100 μL 放入檢測管中,加入5 mL PBS 洗滌,1 000 r/min 離心5 min,棄去上清,用孵育緩沖液洗滌1 次,1 000 r/min 離心5 min。棄去上清,向沉淀內(nèi)加入100 μL Annexin V 標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞,室溫下避光孵育10~15 min,沉淀細(xì)胞用孵育緩沖液洗1 次,加入PI 溶液室溫孵育20 min,避光上機(jī)檢測。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)

    細(xì)胞分組培養(yǎng)后,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理48 h 收獲顆粒細(xì)胞,使用TRIzol 試劑提取總RNA。利用GoScript 逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega,A5004)對RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)合成顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因引物(見表1),采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)技術(shù)檢測如下基因的表達(dá):睪酮合成調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白(steroidogenic acute regulatory,StAR)、細(xì)胞色P450 側(cè)鏈裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme,P450scc),細(xì)胞色P450 芳香化酶(cytochrome P450 aromatase,P450arom)、雌激素受體α(estrogen receptorα,ERα)、雌激素受體β(estrogen receptorβ,ERβ)、 3β-羥 基 類 固 醇 脫 氫 酶(3βhydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)、17β羥化類固醇脫氫酶(17 β hydroxylated steroid dehydrogenase17β-HSD)、 黃 體 生 成 素 受 體(luteinizing hormone receptor,LHR)、卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor,F(xiàn)SHR)。在ABI 7500 DNA 實(shí) 時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測:95 ℃變性5 min 后30 個PCR 循環(huán):95 ℃、1 min,58 ℃、1 min,72 ℃、1 min。隨后在SYBR Green PCR Mix 中進(jìn)行定量,按2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。

    表1 顆粒細(xì)胞功能相關(guān)基因引物序列信息

    1.7 顆粒細(xì)胞分泌雌二醇與孕酮的檢測

    各組細(xì)胞在量子點(diǎn)處理48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,所有標(biāo)本收集后于-80 ℃分裝凍存。送醫(yī)院檢驗(yàn)科采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)法檢測細(xì)胞上清液中雌二醇(E2)以及孕酮(P)含量。

    1.8 顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)檢測

    分組培養(yǎng)顆粒細(xì)胞并接種于6 孔板內(nèi),24 h 后更換含有終濃度分別為1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后,顆粒細(xì)胞用PBS 洗滌3次,用預(yù)冷的裂解液裂解后,于4 ℃下1 000 r/min離心15 min,保留上清液用于測定MDA、T-AOC、TSOD、GSH 與GSH-PX 的活性。分別按照試劑盒操作步驟測定,檢測結(jié)果依照說明書進(jìn)行計(jì)算。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均用xˉ±s表示,兩組之間的差異通過兩個獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 5-Fu驗(yàn)證體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的毒性敏感性

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與PBS對照組相比,5-Fu可明顯抑制顆粒細(xì)胞活性(P<0.01)。1 μmol/L 時(shí)5-Fu 對細(xì)胞活性的抑制率為(40.35±3.89)%,10 μmol/L 時(shí)活性抑制率為(85.30±4.32)%,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.958,P<0.05)。5-Fu 抑 制顆 粒細(xì) 胞 生 長 的IC50值 為1.227 μmol/L(圖2A)。同時(shí)我們對0.5、1、2 μmol/L 5-Fu處理的顆粒細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,5-Fu處理后的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)明顯早期凋亡特征(圖2B 和C)。5-Fu 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率在10 μmol/L時(shí)是1 μmol/L 的2.37±1.84 倍,顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    圖2 5-Fu驗(yàn)證體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)

    2.2 CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)對顆粒細(xì)胞活力和凋亡率的影響

    在顆粒細(xì)胞貼壁后,分別將1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS量子點(diǎn)添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中。從第1天到第6 天,每天動態(tài)檢查細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,顆粒細(xì)胞在第3 天開始出現(xiàn)自發(fā)凋亡(顆粒細(xì)胞出現(xiàn)黃素化,圖3A)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在體外培養(yǎng)48 h 顆粒細(xì)胞功能良好狀態(tài)下進(jìn)行毒性檢測。不同劑量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)作用48 h觀后顆粒細(xì)胞存活率呈現(xiàn)劑量依賴性下降(r=0.9631,P<0.05),CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)對顆粒細(xì)胞的IC50值為66.72 μg/mL(圖3B)。對CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理的顆粒細(xì)胞采用TUNEL和Annexin V/PI雙染色法流式細(xì)胞儀分別進(jìn)行凋亡檢測:TUNEL凋亡測試的結(jié)果表明,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后,顆粒細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的DNA 片段化,并隨著劑量增加呈現(xiàn)增加趨勢(圖3C和D)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果亦表明,CuInS2/ZnS量子點(diǎn)處理后的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)顯著細(xì)胞早期凋亡特征(圖3E和F)。

    圖3 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)對顆粒細(xì)胞活力和凋亡的影響

    2.3 CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞雌激素與孕激素釋放

    排卵后顆粒細(xì)胞生物功能為分泌孕酮(P)和雌二醇(E2),它們在生殖系統(tǒng)中起著非常重要的作用。CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后,在顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中檢測到E2和P,表明其生理功能正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后顆粒細(xì)胞大量釋放內(nèi)源性E2和P 與PBS 對照組比較,E2 和P 顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖4A 和B),且明顯上調(diào)FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細(xì)胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(圖4C)。

    圖4 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)引發(fā)顆粒細(xì)胞孕雌激素釋放并上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)

    2.4 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)

    結(jié)果發(fā)現(xiàn),10 和100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)顯著增加顆粒細(xì)胞中的ROS 含量(P<0.05 或P<0.01,圖5A和B)。與PBS對照組相比,1 μg/mL 量子點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的顆粒細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的活性未發(fā)生顯著變化,而10 和100 μg/mL 量子點(diǎn)處理后顆粒細(xì)胞中的MDA、T-AOC 及T-SOD 活性均顯著低于對照組(P<0.01),100 μg/mL 量子點(diǎn)的GSH 活性顯著高于PBS 對照組(P<0.01),GSH-PX明顯低于對照組(P<0.01)。

    圖5 CuInS2/ZnS量子點(diǎn)處理后細(xì)胞中氧化損傷情況

    3 討 論

    本實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行了人類卵顆粒細(xì)胞的體外原代培養(yǎng),原代培養(yǎng)的細(xì)胞可以保留其分泌雌、孕激素的功能特性,相關(guān)研究亦證實(shí)其體外培養(yǎng)的可行性[8-10],并且對不同濃度的5-Fu 具有敏感的毒性檢測反應(yīng)性,呈現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系,結(jié)果表明原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞可以檢測理化因子的毒性效應(yīng),與國外相關(guān)報(bào)道一致[11-13]。但持續(xù)6 d 體外原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn),顆粒細(xì)胞在第3 天出現(xiàn)自發(fā)凋亡現(xiàn)象,提示細(xì)胞開始黃素化,因此,毒性檢測實(shí)驗(yàn)我們控制在體外培養(yǎng)72 h以內(nèi)開展各項(xiàng)檢測。利用此細(xì)胞體系,我們觀察不同濃度CuInS2/ZnS量子點(diǎn)作用48 h對人卵顆粒細(xì)胞的毒性效應(yīng)并探索其損傷機(jī)制。

    中、高劑量CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后,顆粒細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的DNA片段化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并呈現(xiàn)劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果亦表明,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡發(fā)生。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)非鎘量子點(diǎn)對多種細(xì)胞具有毒性作用:Chen 等[14]報(bào)道InP/ZnS量子點(diǎn)對鯽魚卵母細(xì)胞具有明顯毒性,本研究團(tuán)隊(duì)課題組報(bào)道InP/ZnS 量子點(diǎn)表面不同亞基修飾后對肺癌細(xì)胞HCC-15和正常肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN均引發(fā)明顯凋亡,濃度在20~80 μg/mL 范圍內(nèi)的量子點(diǎn)可以引起細(xì)胞損傷,增加壞死細(xì)胞的數(shù)量,顯著降低細(xì)胞活力,并表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞IC50為66.72 μg/mL,結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果基本一致。

    顆粒細(xì)胞受損后可以釋放內(nèi)源性激素,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量組量子點(diǎn)明顯促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮的釋放,與量子點(diǎn)損傷激活并上調(diào)FSH 受體、17β羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)、3β羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)、細(xì)胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān),Du等[12]發(fā)現(xiàn)甲基醚通過抑制細(xì)胞色素P450芳香化酶功能可以抑制人卵顆粒細(xì)胞雌激素生物合成,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)可以激活細(xì)胞色素P450芳香化酶功能促進(jìn)雌激素合成與釋放,其可能的分子機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

    氧化損傷主要是由ROS產(chǎn)生增加引起的。本研究顯示CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后,具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的能力,亦有文獻(xiàn)報(bào)道了InP/ZnS 量子點(diǎn)明顯增加肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS 含量[13]。當(dāng)ROS 的產(chǎn)生超過人體的抗氧化能力時(shí),將嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常功能,并可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷、酶失活、脂質(zhì)過氧化和DNA鏈斷裂。為了抵消ROS的毒性作用,細(xì)胞啟動由酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)組成的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行防御。還原型谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,其過度氧化和細(xì)胞中總谷胱甘肽濃度的降低可能是導(dǎo)致人體抗氧化能力下降的原因。GSH-PX 具有將體內(nèi)過量的過氧化物還原為無毒的羥基化合物和H2O,從而降低氧化毒性。MDA是主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其含量的變化可用作判斷自由基對人體損害程度的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用量子點(diǎn)處理的人卵顆粒細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生量顯著增加,并表現(xiàn)出劑量依賴性,表明量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞后存在氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)暴露使MDA 含量顯著增加,并且中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)劑量量子點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組中MDA 含量呈顯著增加趨勢,表明量子點(diǎn)對人卵顆粒細(xì)胞具有明顯的自由基損傷作用。暴露于100 μg/mL 量子點(diǎn)會導(dǎo)致人卵顆粒細(xì)胞中GSH 含量顯著增加,這表明當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),人卵顆粒細(xì)胞會增加GSH 含量并促進(jìn)其與有毒物質(zhì)(量子點(diǎn))的結(jié)合以防止自由基損害。SOD、CAT 和GSH-PX 是研究最多的抗氧化酶,其中SOD 主要負(fù)責(zé)去除超氧陰離子自由基,CAT主要負(fù)責(zé)過氧化氫的分解,而GSH-PX 主要負(fù)責(zé)去除H2O2和脂質(zhì)過氧化物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高劑量CuInS2/ZnS量子點(diǎn)顯著抑制TSOD和CAT的活性,表明量子點(diǎn)誘導(dǎo)人卵顆粒細(xì)胞活性氧自由基的增加,CAT降低將引起H2O2堆積,超過T-SOD 和SOD 的清除能力而引起氧化損傷。用100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)處理后,人卵顆粒細(xì)胞的GSH-PX 活性明顯降低,表明GSH-PX 被抑制在一定程度上可提高過氧化水平,可見,細(xì)胞有限的修復(fù)能力不能完全解決量子點(diǎn)引起的毒性作用。

    綜上,本實(shí)驗(yàn)成功建立了體外培養(yǎng)的人卵顆粒細(xì)胞毒性檢測體系,CuInS2/ZnS 量子點(diǎn)可以通過侵入顆粒細(xì)胞導(dǎo)致氧化損傷發(fā)生細(xì)胞凋亡,其毒性的分子機(jī)制有待更深入研究。

    致謝:感謝深圳恒生醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室所有成員收集標(biāo)本,感謝深圳大學(xué)(西麗校區(qū))儀器分析中心提供的幫助。

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