氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)子代大鼠腎臟毒性損傷與細(xì)胞自噬的影響

田曉琳，楊玲玲，趙 倩，仇玉蘭，孫子龍，牛瑞燕，*，閻小艷，*

(1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西省環(huán)境獸醫(yī)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030801；2．山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，山西太原 030001)

無機(jī)氟和砷是自然界中廣泛存在的環(huán)境污染物。中國是全球地方性氟、砷中毒較為嚴(yán)重的國家，由于特殊的氣候、地貌和地質(zhì)特征，我國面臨著地下水中多種地質(zhì)污染的情況，其中高氟與高砷的共存現(xiàn)象廣泛分布在高堿度的半干旱地區(qū)，包括河套盆地、大同盆地、松嫩平原及準(zhǔn)葛爾盆地等[1-3]。因此我國地下水氟、砷的廣泛分布對(duì)人類和動(dòng)物健康產(chǎn)生有害影響，成為最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[4]。

慢性氟中毒與慢性砷中毒均集中表現(xiàn)為全身多器官、多系統(tǒng)的損傷。眾多研究表明，腎臟作為機(jī)體主要的排泄器官，是機(jī)體氟、砷代謝的必經(jīng)之路。1937年Dharmaratne 等[5]首次發(fā)現(xiàn)氟暴露可能導(dǎo)致機(jī)體腎臟組織發(fā)生病變。隨后的流行病學(xué)表明，氟一方面改變腎功能相關(guān)酶的代謝活力，導(dǎo)致腎功能紊亂[6]，另一方面導(dǎo)致人體腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生病變，促進(jìn)慢性腎臟疾病的發(fā)生[7-8]。砷在1978 年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確定為致癌物，其中飲用水中砷長期暴露不僅增加機(jī)體非癌病變風(fēng)險(xiǎn)，而且引發(fā)癌變[9]。2021 年美國環(huán)境保護(hù)署學(xué)者，基于美國疾病控制與預(yù)防中心提供的砷暴露數(shù)據(jù)與國家癌癥研究所2011—2015年的癌癥數(shù)據(jù)，采用回歸模型預(yù)測發(fā)現(xiàn)每年砷的累計(jì)濃度與腎癌的發(fā)生率呈正相關(guān)[10]。可見，氟和砷的單獨(dú)暴露可對(duì)腎臟造成毒性損傷，然而現(xiàn)階段關(guān)于氟與砷聯(lián)合中毒的相關(guān)研究仍處于初期階段。

細(xì)胞自噬不僅參與了腎臟正常的發(fā)育及衰老過程，更多的體現(xiàn)在其對(duì)急性腎損傷、腎纖維化、免疫性腎小球疾病、足細(xì)胞病及IgA 腎病等疾病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控[11]?？梢?，在腎臟發(fā)育及疾病中，細(xì)胞自噬在腎小球與腎小管中均發(fā)揮了重要的作用。因此，為進(jìn)一步完善氟、砷暴露對(duì)腎臟的毒性損傷機(jī)制，本研究建立妊娠期至成年期氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露大鼠模型，初步評(píng)估了氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)模型大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)的毒性影響，并進(jìn)一步探究細(xì)胞自噬在氟、砷所致腎臟毒性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氟化鈉與亞砷酸鈉(美國Sigma公司)；Masson染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；LC3抗體和p62抗體(美 國CST 公 司)；Beclin1 抗 體(美 國Abcam 公司)；GAPDH抗體(美國Abcam公司)；熒光二抗(中國博士德生物有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JEM-1011 透射電子顯微鏡(日本JEOL 公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek 公司)；萊卡切片機(jī)(德國Leica 公司)；Chemi-Doc 成像系統(tǒng)(英國Bio-Rad 公司)；CK40倒置顯微鏡和正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 妊娠期至成年期氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露動(dòng)物模型的建立

本研究SD 大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(晉)2019-0007。研究建立妊娠期至成年期氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露的子代雄性大鼠模型，采用飲水染毒方式，分為4 組即對(duì)照組(蒸餾水)、氟暴露組(100 mg/L 氟化鈉)、砷暴露組(75 mg/L亞砷酸鈉)、氟與砷聯(lián)合暴露組(100 mg/L氟化鈉+75 mg/L 亞砷酸鈉)。子代大鼠在妊娠期經(jīng)其母體宮內(nèi)暴露于氟、砷；哺乳期(出生后第0 天至第21 天斷乳)經(jīng)母乳暴露于氟、砷；斷乳后，通過飲水染毒方式暴露至120 d 后，各組隨機(jī)選6 只子代雄性大鼠作為本研究最終試驗(yàn)大鼠。采集腎臟組織，稱量體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量，并計(jì)算腎系數(shù)。

1.4 腎臟組織病理學(xué)觀察

采集子代雄性大鼠新鮮腎臟皮質(zhì)部分組織，固定于多聚甲醛中；經(jīng)過脫水、透明后將組織包埋成蠟塊；切為厚3 μm 的切片，并確保切片中有腎小球與腎小管的分布；最后采用Masson染色試劑盒染色并評(píng)估腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 腎臟組織超微結(jié)構(gòu)的觀察

采集子代雄性大鼠新鮮的腎臟皮質(zhì)部分組織，切成1 mm3大小的切塊，經(jīng)過固定、脫水、包埋后進(jìn)行切片與染色，此過程中需要經(jīng)過半包埋技術(shù)以確定所包埋組織中均包含有腎小球與腎小管的分布，最后每個(gè)組織制備2~3 張切片在透射電鏡下觀察腎臟組織中腎小管及腎小球的超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 Western blot 測定腎臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

取30 mg腎臟皮質(zhì)部分組織，加入300 μL裂解液混合物，研磨儀破碎組織后，1×104r/min 離心5 min，采用BCA法測定蛋白濃度，計(jì)算并配制體系后將蛋白煮沸變性備用。配制分離膠與濃縮膠，加樣后采用恒壓電泳與恒流轉(zhuǎn)膜，之后將膜封閉2 h，一抗孵育過夜，洗滌3 次后再孵育二抗，膜上滴加ECL 發(fā)光液后上機(jī)曝光，最后獲得條帶并保存。本實(shí)驗(yàn)中涉及的一抗包括： 自噬基因Atg6 同系物(homologue of autophagy gene Atg6，Beclin1)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated proteins light chain 3，LC3)、泛素結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-binding protein p62，p62)、植物磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)。GAPDH、Beclin1、LC3 與p62 的一抗稀釋比例分別為1∶10 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000；二抗稀釋比例均為1∶4 000。

1.7 免疫熒光測定腎臟組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

切取3 μm 腎臟組織白片60 ℃烘烤3 h 后進(jìn)行脫蠟與復(fù)水，使用過氧化氫溶液去除內(nèi)源性酶，檸檬酸鈉溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加5% BSA 封閉15 min，并依次在濕盒中滴加一抗(稀釋比例為1∶200)過夜，隨后滴加熒光二抗(稀釋比例為1∶100)在室溫孵育2 h，最后使用DAPI 染細(xì)胞核，用熒光猝滅劑封片后使用熒光顯微鏡觀察自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 與p62 的熒光強(qiáng)度與分布情況(避光環(huán)境下操作)。每組隨機(jī)選取3 只大鼠腎組織切片，每張切片隨機(jī)選擇6 個(gè)視野進(jìn)行定量分析并取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用xˉ±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，LSD-t進(jìn)行兩兩比較，交互作用采用析因分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大鼠腎系數(shù)的影響

基于氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露的子代SD 大鼠模型，腎系數(shù)的改變?nèi)鐖D1 所示，相較于對(duì)照組，砷暴露組腎系數(shù)顯著升高(P＜0.01)，而氟暴露組與聯(lián)合暴露組腎系數(shù)未見顯著性改變。

圖1 氟、砷暴露對(duì)腎系數(shù)的影響(n=6)

2.2 氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大鼠腎臟組織纖維化病變的影響

Masson 染色結(jié)果見圖2。腎小球腎小管上皮細(xì)胞胞漿、間質(zhì)細(xì)胞胞漿、肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。對(duì)照組腎小球腎小管完整，腎小管腎間質(zhì)纖維化不明顯；氟暴露組著色較深，腎小球和腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞淤積增多，腎小管肌纖維化輕微加重，腎小球旁的腎小管排列紊亂，腎間質(zhì)纖維化加重；砷暴露組腎小球基底膜斷裂，腎小管輕微擴(kuò)張，肌纖維化加重，腎間質(zhì)纖維化加重；氟與砷聯(lián)合暴露組，腎小球萎縮并伴有系膜增生，腎小管擴(kuò)張并伴有上皮細(xì)胞碎片脫落，腎間質(zhì)纖維化加重。

圖2 氟、砷暴露對(duì)腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響(標(biāo)尺50 μm，20 μm)

2.3 氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的影響

腎小球系膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察如圖3 所示，相較于對(duì)照組，各暴露組系膜細(xì)胞數(shù)量增多，氟暴露組與砷暴露組中腎小球系膜數(shù)量增多，氟與砷聯(lián)合暴露組中系膜細(xì)胞數(shù)量增多的同時(shí)并伴隨胞漿內(nèi)容物的蓄積。

圖3 氟、砷暴露對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響(標(biāo)尺5 μm，2 μm)

2.4 氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大鼠腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

足細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)如圖4 所示，相較于對(duì)照組，各暴露組中大鼠腎臟組織足細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡化，部分嵴斷裂；氟暴露組中發(fā)生了嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；砷暴露組中觀察到典型的自噬小體。

圖4 氟、砷暴露對(duì)腎小球足細(xì)胞的影響(標(biāo)尺2 μm，500 nm)

2.5 氟與砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白熒光分布及表達(dá)的影響

自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 在腎臟組織中的表達(dá)水平見圖5。與對(duì)照組相比，各暴露組中Beclin1、LC3、p62 蛋白的表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 分別在腎小球與腎小管中的熒光分布情況見圖6 和圖7。與對(duì)照組相比，各暴露組中自噬蛋白的熒光強(qiáng)度增加且熒光分布面積增大；進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖8 所示，在腎小球與腎小管中，氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露導(dǎo)致組織中自噬蛋白Beclin1、LC3、p62 的表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.01)。

圖5 氟、砷暴露對(duì)腎臟組織中Beclin1、LC3、p62蛋白表達(dá)水平的影響(n=6)

圖6 氟、砷暴露對(duì)腎小球中Beclin1、LC3、p62蛋白表達(dá)的免疫熒光分布的影響(標(biāo)尺50 μm，20 μm)

圖7 氟、砷暴露對(duì)腎小管中Beclin1、LC3、p62蛋白表達(dá)的免疫熒光分布的影響(標(biāo)尺50 μm，20 μm)

圖8 氟、砷暴露對(duì)自噬相關(guān)蛋白的免疫熒光分布的影響(n=3)

2.6 氟與砷在對(duì)腎臟自噬相關(guān)蛋白熒光分布及表達(dá)的交互影響

腎臟組織中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62的表達(dá)水平結(jié)果中，氟與砷的析因分析見表1，結(jié)果顯示氟與砷均存在交互作用(均為P＜0.01)。腎小球與腎小管中細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62 的熒光表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果中，氟與砷的析因分析見表2。結(jié)果顯示在各指標(biāo)中，氟與砷存在交互作用(均為P＜0.01)。由于各指標(biāo)在氟與砷聯(lián)合暴露組中的表達(dá)低于單獨(dú)氟暴露組與砷暴露組之和，推測氟與砷交互作用可能為拮抗作用。

表1 氟與砷在Beclin1、LC3、p62蛋白表達(dá)水平中的析因分析表

表2 氟與砷在Beclin1、LC3、p62免疫熒光指標(biāo)中的析因分析表

3 討 論

長期飲用氟或砷污染的地下水，對(duì)機(jī)體發(fā)育與健康構(gòu)成威脅，智利的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示生命早期(子宮內(nèi)和嬰幼兒時(shí)期)暴露于砷環(huán)境可以增加暴露人群的死亡率[12]。多項(xiàng)研究表明，在生命早期，機(jī)體更容易受到砷的毒性危害，影響了嬰兒和兒童的生長發(fā)育[13-14]。此外，氟化物的暴露也增加?jì)胗變夯挤哐里L(fēng)險(xiǎn)，并與兒童腎臟損害密切相關(guān)[15-17]。印度雅魯藏布江平原的流行病學(xué)調(diào)查顯示，相較于成人，地下水中氟和砷同時(shí)暴露給兒童帶來更為嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)[18]。綜合以上結(jié)果，生命早期暴露于氟和砷的群體具有更高的患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了更好的模擬地下水氟和砷的實(shí)際暴露情況，本課題建立了妊娠期至成年期的氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露的大鼠模型，氟與砷的暴露過程包括了母體的宮內(nèi)與母乳暴露方式及子代斷乳后自由飲水暴露方式。

研究表明腎臟組織病理學(xué)改變是氟和砷中毒性腎臟損傷的重要指標(biāo)之一[19-20]。高濃度的氟暴露可引發(fā)腎小管擴(kuò)張、變性、炎癥及纖維化[21]，而砷暴露也可導(dǎo)致腎小球萎縮、腎小管上皮細(xì)胞脫落等病變的發(fā)生[22]。這些報(bào)道與本研究中腎小管及腎小球的病理損傷結(jié)果相一致。此外，線粒體是為腎臟足細(xì)胞提供所需的能量的重要細(xì)胞器。多項(xiàng)研究表明，足細(xì)胞損傷伴隨著線粒體功能障礙的發(fā)生，加入線粒體呼吸鏈復(fù)合物抑制劑后氧化應(yīng)激水平降低，同時(shí)有效的緩解了足細(xì)胞的損傷[23]；另一項(xiàng)研究也通過促進(jìn)與抑制線粒體裂變，進(jìn)而調(diào)控足細(xì)胞凋亡、足突消失等足細(xì)胞損傷的發(fā)生[24]。本研究首次在染毒組中觀察到腎小球足細(xì)胞中細(xì)胞器的改變，主要體現(xiàn)在線粒體的空泡化損傷，再次證實(shí)了線粒體在腎臟足細(xì)胞中的重要性。最重要的是在超微結(jié)構(gòu)中還觀察到典型自噬小體的分布，這一結(jié)果為我們提供了自噬相關(guān)研究的思路。

大量研究已表明，細(xì)胞自噬參與了氟和砷暴露對(duì)機(jī)體多器官毒性損傷的過程，如海馬、肝臟、睪丸與腎臟等[25-26]。可見，細(xì)胞自噬在氟、砷致病機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。自噬體的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，主要分為起始階段、延伸階段及成熟與降解階段[27-28]，在此過程中，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)均可能打亂體內(nèi)細(xì)胞自噬的平衡[29]。在起始階段，Beclin1招募自噬相關(guān)蛋白形成復(fù)合物，啟動(dòng)自噬蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞自噬水平[30]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露促進(jìn)了腎小球與腎小管中Beclin1蛋白的表達(dá)，提示腎臟組織中細(xì)胞自噬流已經(jīng)啟動(dòng)。而在延伸階段，LC3 泛素樣連接系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，促進(jìn)了自噬囊泡的形成，LC3 是自噬小體生成的標(biāo)志因子之一[31]。此外，自噬小體的成熟與降解階段是自噬發(fā)生過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，其中p62 水平的高低是評(píng)估細(xì)胞自噬流中自噬小體正常降解的重要指標(biāo)，報(bào)道顯示p62的蓄積預(yù)示著自噬流末端阻遏現(xiàn)象的發(fā)生[32]。我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)延伸階段中LC3在腎小球與腎小管中的表達(dá)升高，且氟、砷暴露后可增加自噬下游調(diào)控蛋白p62 的表達(dá)水平。近期的多項(xiàng)研究表明，在腎小管上皮細(xì)胞中，單獨(dú)的氟或砷暴露后可誘導(dǎo)Beclin1、LC3 與p62 等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)上升，促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[33-36]，與我們的結(jié)果相一致。

此外，為闡明氟與砷的聯(lián)合效應(yīng)，在細(xì)胞自噬指標(biāo)中，我們發(fā)現(xiàn)氟與砷之間存在交互作用。雖然從地球化學(xué)角度考慮，氟、砷兩種元素不存在相似性或耦合，但是有多項(xiàng)研究報(bào)道氟、砷之間存在明顯的相關(guān)性，并且這種相似性可能源于二者在堿性的地下水中均呈現(xiàn)負(fù)離子的形式[37-38]。此外，近年來多項(xiàng)研究試圖闡明氟與砷在機(jī)體中的聯(lián)合毒性效應(yīng)，但尚未有明確的定論，Mittal等[39]在氧化應(yīng)激指標(biāo)中發(fā)現(xiàn)氟與砷聯(lián)合暴露減弱了單獨(dú)的氟與砷暴露的毒性作用；但是在發(fā)育神經(jīng)毒性研究中發(fā)現(xiàn)，氟與砷聯(lián)合暴露體現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性作用[40]；除此之外，本課題組前期建立的氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)睪丸自噬[41]、心臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[42]以及腎臟氧化應(yīng)激[43]的研究中，均發(fā)現(xiàn)氟與砷之間的交互作用。因此，本研究得出在腎臟組織細(xì)胞自噬水平中氟與砷之間呈現(xiàn)出拮抗作用，進(jìn)一步結(jié)合上述已報(bào)道的文獻(xiàn)得出氟與砷對(duì)機(jī)體多器官毒性中可能存在聯(lián)合作用的初步結(jié)論，但是未來仍需進(jìn)一步的探索。

總而言之，本研究表明妊娠期至成年期氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合暴露可造成腎臟組織腎小管、腎小球及其內(nèi)部細(xì)胞器病變，并首次在腎小管與腎小球中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，并進(jìn)一步在細(xì)胞自噬水平中發(fā)現(xiàn)氟與砷的聯(lián)合效應(yīng)，為完善氟與砷聯(lián)合中毒的分子機(jī)制及預(yù)防干預(yù)提供了理論基礎(chǔ)。