四種不同生境條件下外來植物長芒莧入侵對土壤細菌群落組成和多樣性的影響

石福臣，張梅

（南開大學 生命科學學院，天津 300071）

0 引言

長芒莧（Amaranthus palmeri）屬莧科（Ama?ranthaceae）、莧屬植物，原產(chǎn)美洲，長芒莧的一些特性使其成為全球性惡性雜草并難以防除，例如光合C4途徑，其光合速率是大豆和棉花的3～4倍［1-2］；極高的繁殖能力和生長速率，自然狀態(tài)下每株長芒莧可產(chǎn)生60萬粒種子，株高可達2 m～3 m；極強的極端環(huán)境的耐受能力和遺傳變異能力［3］。此外，長芒莧對多種除草劑產(chǎn)生抗藥性更使其成為世界頭等惡性雜草［4］。

長芒莧于1985年首次發(fā)現(xiàn)于中國北京市豐臺區(qū)，經(jīng)過近30年的潛伏傳播后，近幾年在京津冀地區(qū)呈現(xiàn)爆發(fā)性入侵與擴散趨勢，迅速入侵至農(nóng)田、果園等經(jīng)濟作物生長區(qū)，與經(jīng)濟作物進行養(yǎng)分競爭，搶奪水分、光照資源，有的甚至比經(jīng)濟作物（玉米、果樹）還高，這對當?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性安全造成巨大的威脅和破壞。國內(nèi)對于長芒莧的研究較少，主要包括：李慧琪等預測了長芒莧在中國的潛在分布區(qū)，長芒莧在中國的潛在分布集中在華北平原地區(qū)［5］；曹晶晶等研究表明：表型變異（如高緯度種群開花時間提前）可提高長芒莧環(huán)境適應性進化，拓展其在中國的適生性分布區(qū)，增強其向原產(chǎn)地適應環(huán)境梯度之外地區(qū)入侵和擴散蔓延的潛力［6］；本研究組前期進行了關于長芒莧表型可塑性的研究［7］。

外來植物的入侵機制十分復雜，包括增強競爭能力、化感作用、根際理化性質(zhì)改變以及微生物區(qū)系的變化等［8-10］。近年來，從植物-土壤-微生物群落組成研究外來植物的入侵機制已成為新的研究思路和重要的發(fā)展趨勢。紫莖澤蘭入侵會改變土壤微生物的多樣性和群落結構，引起有益功能菌聚集和土壤酶活性的改變，形成有利于紫莖澤蘭入侵擴張的微生態(tài)環(huán)境［11］；Smooth brome入侵增加了土壤細菌的豐富度和均勻度，最重要的作用是選擇性抑制優(yōu)勢菌種，使較少見的細菌相對豐度增加［12］；Robinia pseudoacacia入侵主要改變了土壤細菌的豐富度，這種改變主要是由放線菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門等細菌門類所驅動［13］；薇甘菊（Mikania micrantha）通過改變土壤微生物群落豐度，從而調(diào)節(jié)土壤碳的循環(huán)利用實現(xiàn)入侵［14］；加拿大薊（Cirsium arvense）通過改變土壤微生物降低一些本地植物的性能，但自身的性能并沒有因此而改變，進而使加拿大薊形成競爭優(yōu)勢［15］。Cheng等對于入侵植物歐洲千里光（Senecio vulgaris）根際和內(nèi)生細菌群落的研究發(fā)現(xiàn)了許多和解磷（Brevundimonas diminu?ta）、固氮（Rhizobium leguminosarum）、耐受極端環(huán) 境（Exiguobacterium sibiricum）相 關 的 細菌［16］。因此，從土壤微生物角度揭示長芒莧的入侵機制，從而抑制其進一步的擴散和蔓延，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

本研究通過野外調(diào)查取樣，結合三代高通量測序技術，研究四種典型生境下有無長芒莧入侵對土壤微生物多樣性和種類的影響。旨在探討以下問題：（1）不同生境下長芒莧入侵是否會影響土壤細菌群落組成和多樣性；（2）不同生境下是否存在有助于長芒莧入侵的不同類型的核心微生物。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及樣品采集

本研究采樣點位于天津市武清區(qū)（117°16ˊE，39°59ˊN），該地區(qū)屬溫帶半濕潤大陸性季風氣候，海拔年均氣溫11.6℃，年降水量606 mm（圖1）。該地區(qū)為長芒莧重度入侵區(qū)域，并且在多種生境下形成單優(yōu)群落，是進行長芒莧土壤細菌群落多樣性研究的理想取樣點。其主要伴生草本植物有狗尾草（Setaria Viridis）、藜（Chenopodium album）、虎尾草（Chloris virga?ta）、玉米（Zea mays）等。

圖1 采樣點及生境設置。A，河岸生境、B，路邊生境、C，荒地生境、D，農(nóng)田生境Fig.1 Location of research site and four types of sampling habitats:riverbank(A),roadside(B),wasteland(C)and farmland(D)habitats

本研究選擇河岸（A）、路旁（B）荒地（C）和農(nóng)田（D）等4種典型生境類型，每種生境設置3個采樣點，每個采樣點間隔30 m～50 m。每個采樣點分為長芒莧入侵區(qū)（蓋度大于70%）和非入侵區(qū)，每個區(qū)域設置面積為2 m×2 m的樣方，兩個區(qū)域間隔3 m～5 m。每個樣方土壤采集采用五點取樣法，去除表面的枯枝落葉后，用土鉆收集0～10 cm處的土壤，混合為一個樣品。共采集4（生境）×2（土壤類型）×3（重復）=24份土壤樣品。所有土壤樣品放入液氮罐中迅速帶回實驗室，剔除可見根系和石塊并混勻后過4 mm篩，在?20℃冰箱中保存暫存，通過北京百邁客公司高通量測序平臺進行微生物測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤DNA提取、PCR擴增和高通量測序

使用MN NucleoSpin 96 Soil試劑盒對土壤樣品基因組DNA進行提取。選用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對 細 菌16S全長進行擴增。PCR擴增體系（50 μL）包括：基因組 DNA 40 ng～60 ng，2.5 μL*Vn F（5′端引物）（10 μmol·L-1），2.5 μL*Vn R（3′端引物）（10 μmol·L-1），1 μL KOD FX Neo（TOYO?BO），25 μL KOD FX Neo Buf（2X）。 10 μL 2 mmol?L-1dNTP，補 ddH2O 至總體系 50 μL。反應程序為：95℃預變性5 min，30個循環(huán)包括（95℃，30；50℃，30；72℃，1 min/1 kb）；72℃延伸5 min。PCR結束后，對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物經(jīng)磁珠法回收后，純化后的產(chǎn)物進行Nanodrop 2000定量后，按照質(zhì)量比1∶1進行混樣。由北京百邁客生物科技有限公司進行后續(xù)的樣品建庫，上PacBio測序平臺進行高通量測序，利用單分子實時測序（SMRT Cell）的方法對marker基因進行測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

對原始下機subreads進行校正得到CCS（Circular Consensus Sequencing）序 列（SMRT Link，version8.0），然后使用 lima（v1.7.0）軟件，通過barcode序列識別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體（version 8.1），得到高質(zhì)量的CCS序列。在相似性97%的水平上對序列進行聚類，以測序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾 OTU（Operational Taxonomic Unit）。通過Venn圖呈現(xiàn)各樣本所共有和獨有OTU所占的比例，應用Mothur versionv.1.30軟件對Alpha多樣性指數(shù)進行分析，計算ACE、Chao1、Shan?non和Simpson等物種多樣性指數(shù)。采用SPSS 20.0軟件進行雙因素方差分析，評價入侵、生境及其交互作用對細菌群落alpha多樣性指數(shù)的影響。為了將不同生境的聚類可視化，基于binary-jaccard構建非度量多維尺度圖（NMDS）。此外，利用線性判別分析（LDA）和LEfSe方法探究不同生境下的生物標志物。運用R軟件進行各種分析圖的繪制與結果輸出。

2 結果與分析

2.1 測序結果

24個樣品測序后通過Barcode識別后共獲得180 441條CCS序列，平均產(chǎn)生7 518條CCS序列。利用Mothur軟件進行rarefaction分析，繪制稀疏性曲線（圖2）。隨著序列數(shù)目增加，各處理的稀疏性曲線趨于平緩。說明擴增序列可以真實反映各個土壤樣品的細菌群落結構，測序深度足夠。

2.2 異質(zhì)生境下入侵區(qū)和未入侵區(qū)OTU分析

Venn圖可以直觀的體現(xiàn)土壤細菌群落OTU組成的差異性及重疊情況（圖3）。在河岸（A）、路邊（B）、荒地（C）和農(nóng)田（D）4種生境中，入侵樣地分別檢測到1 814、1 647、1 593和1 608個細菌OTUs，未入侵樣地分別檢測到2 105、1 615、1 909和1 448個細菌OTUs。其中入侵樣地，A、B、C、D四種生境各自獨有314、145、117和240個OTUs，而在非入侵樣地分別獨有 213（A）、201（B）、127（C）和 104（D）個OTUs（圖 2）。

圖3 四種生境有無長芒莧入侵的Veen圖。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.3 Venn diagrams of shared OTUs(number of OTUs)of invaded(left)and non-invaded(right)byA.palmeri plants under four sampling habitats.Letters in the figure,A:riverbank,B:roadside C:wasteland D:farmland

2.3 土壤細菌群落Alpha多樣性分析

用Chao1和ACE指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。由表1可知，河岸生境和荒地生境土壤細菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)較高，ACE指數(shù)在生境C和D間存在顯著差異（P<0.05）。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高。由表1可知，荒地生境土壤細菌的Shannon指數(shù)值最高，且顯著高于河岸生境（P<0.05），河岸生境土壤細菌的Simpson指數(shù)最高，且顯著高于生境荒地和農(nóng)田生境（P<0.05）。這表明土壤細菌群落的物種豐富度和多樣性因環(huán)境的不同而存在較大差異。

表1 異質(zhì)生境下入侵和非入侵樣地細菌群落的Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity of bacterial community in the invasive and non-invasive plots under four habitats

長芒莧入侵區(qū)和未入侵區(qū)土壤細菌的Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)均不存在顯著差異（P>0.05）。雙因素方差分析表明：除生境對Simpson指數(shù)具有顯著影響（P<0.05）外，入侵、生境及二者的相互作用均未對Alpha多樣性產(chǎn)生顯著影響（P>0.05），表明長芒莧入侵對土壤細菌群落的物種豐富度和多樣性未造成較大的影響。

2.4 土壤細菌群落在門水平上的組成差異

細菌門分類水平的組成表明，4種生境中的主要優(yōu)勢門類為變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門和酸桿菌門（圖4）。變形菌門是豐度最高的類群，A、B、C、D四種生境下未入侵區(qū)的相對豐度為37.91%、29.71%、27.15%和27.42%，入侵區(qū)的相對豐度為42.75%、26.08%、30.35%和28.41%。浮霉菌門是第大二優(yōu)勢門類，非入侵樣地的相對豐度分別為7.61%（A）、13.41%（B）、19.24%（C）、20.57%（D），入侵樣地的相對豐度分別為5.38%（A）、21.79%（B）、19.78%（C）、21.34%（D）。

圖4 4種生境下長芒莧入侵區(qū)和未入侵區(qū)土壤細菌群落在門水平的分類組成。圖例顯示了按物種數(shù)量分類的前10個物種。其他的分類為“Others”，未注釋的物種分類“Unclassified”。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.4 Phylum-level taxonomic composition of the bacterial community in the soil ofA.palmeri invaded and non-invaded plots under four habitats.The legend at the top right shows the top 10 species classified by species abundance.The others are classified as "Others",and the unannotated species are classified as "Unclassified"

與非入侵區(qū)相比，河岸和荒地生境下長芒莧土壤中變形菌門的相對豐度分別增加了12.77%和11.79%，路邊生境下浮霉菌門的豐度增加了62.49%，而河岸生境下浮霉菌門的豐度減少了41.45%。更重要的是，與非入侵區(qū)相比，長芒莧入侵區(qū)土壤細菌的第三大細菌門由芽單胞菌門轉變?yōu)閿M桿菌門。這些變化主要與河岸、荒地和農(nóng)田三種生境中擬桿菌門豐度的明顯增加以及芽單胞菌門的豐度明顯降低有關。

2.5 長芒莧入侵四種生境下指示微生物的篩選

采用LEfSe（線性判別分析效應量）分析方法，鑒定4種生境中有顯著差異的細菌類群（LDA>4.0）。從內(nèi)到外的分類圖代表了從門到種的分類水平（圖5）。與非入侵區(qū)相比，河岸生境下長芒莧土壤細菌中的差異微生物為β-變形菌目、伯克氏菌科、Saccharimonadaceae科、黃單胞 菌 科、Flavisolibacter屬、Candida?tus_Saccharimonas種和Flavisolibacter_sp種；荒地生境下長芒莧入侵區(qū)的核心類群為芽單胞菌綱和芽單胞菌科；同時，亞硝化單胞菌科和Phycisphaeraceae科在農(nóng)田入侵生境中的相對豐度較高；路邊生境下僅Sphingomonas_sediminic?ola種被鑒定為關鍵的土壤微生物類群（表2）。

圖5 采用線性判別分析（LDA）對不同生境下長芒莧入侵區(qū)（上）和無入侵區(qū)（下）的LEfSe分析。不同生境中不同類群的微生物豐度差異顯著，用彩色圓點表示，圓圈表示從門到種的系統(tǒng)發(fā)育水平。A、B、C、D分別表示河岸、路邊、荒地和農(nóng)田生境Fig.5 Cladograms via linear discriminate analysis(LDA)of effect size(LEfSe)with an LDAscore higher than 4.0 ofA.palmeri invasive(top)and non-invasive(bottom)treatments under heterogeneous habitats.Significant differences in microbial abundances according to taxa among habitats are represented by colored dots.Circles represent phylogenetic levels from kingdom to genus

表2 異質(zhì)生境下入侵和非入侵樣地Biomarker差異分析Table 2 Variation analysis of Biomarker in the invasive and non-invasive plots under four habitats

3 討論

大量研究證實土壤微生物群落在外來植物入侵過程中扮演了十分重要的角色［13，17-18］，研究長芒莧入侵對土壤微生物多樣性的影響是揭示其入侵機制的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，長芒莧入侵區(qū)土壤細菌OTU數(shù)量、微生物多樣性指標（Chao1、ACE、Shan?non、Simpson）均略低于未入侵區(qū)，但均未呈現(xiàn)顯著差異（P>0.05）（表1）。這與大多數(shù)的研究不同，但該結果與Kamutando等對于Acacia dealbata的研究有相似的結論，并且Kamutando認為微生物群落分析方法不能準確地估計微生物的豐富度，在微生物群落生態(tài)學和生物多樣性研究中應慎重地應用多樣性指數(shù)［19-20］，因此，多種方法的結合可能會使信息獲得存在一個最佳的平衡點［19，21］。

在細菌門分類水平上，變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門是相對豐度較高的門類，這些菌群在其他植物入侵區(qū)也有大量報道，包括日本藍莓［22］，Acacia dealbata［20］和Cir?sium arvense［23］等。變形菌門是豐度最高的優(yōu)勢類群，我們的研究結果也進一步證實了變形菌門是陸地土壤生態(tài)系統(tǒng)細菌群落的優(yōu)勢菌群［24］。與非入侵樣地相比，長芒莧入侵河岸生境通過聚集生長速度較快的細菌門類，如變形菌門，減少生長速度較慢細菌門類的累積（如酸桿菌門和浮霉菌門），形成對自身有利的生長環(huán)境，以在該生境中占據(jù)優(yōu)勢地位［24-26］。浮霉菌門可能在長芒莧入侵路邊生境中具有重要意義，其在該生境具有極高的富集比例，這可能是因為浮霉菌門在生態(tài)系統(tǒng)氮和碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用［14，27］。

LEfSe分析表明，長芒莧入侵河岸生境下的土壤優(yōu)勢細菌類群為伯克氏菌科和β-變形菌目。芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）在長芒莧入侵荒地生境過程中發(fā)揮重要作用，長芒莧入侵路邊生境和農(nóng)田生境的核心細菌類群分別為Sphin?gomonas_sediminicola和亞硝化單胞菌科。β-變形菌目、伯克氏菌科和亞硝化單胞菌科均隸屬于變形菌門，前人研究表明這些微生物類群在生態(tài)系統(tǒng)化學循環(huán)過程中發(fā)揮著積極的生態(tài)作用［28-30］。例如菌類在固氮，氨氧化以及保護植物免受土壤病原體侵害等作用［31-32］。Sphin?gomonas_sediminicola于2013年首次從淡水沉積物中分離出來［33］，Sphingomonasspp.已顯示出促進植物生長的積極作用［34］。長芒莧入侵土壤中鞘氨醇單胞菌的顯著增加，一方面加速土壤碳氮循環(huán)，另一方面減輕農(nóng)藥、除草劑等污染物對自身的毒害作用，形成對自身有利的環(huán)境，加速其入侵［35］。值得注意的是，盡管與非入侵樣地相比，長芒莧入侵的荒地土壤中芽單胞菌門的豐度呈下降趨勢，但芽單胞菌綱和芽單胞菌科仍是該生境的優(yōu)勢類群。表明這些微生物在長芒莧入侵荒地過程中發(fā)揮了重要作用。

4 結論

本文探討了在異質(zhì)性生境下，長芒莧入侵對土壤細菌群落組成及多樣性的影響。結果表明：長芒莧入侵雖然對土壤細菌α多樣性未產(chǎn)生較大的影響，但對細菌群落的組成和結構影響較大。本研究在不同生境條件下篩選出了一種到幾種可作為長芒莧土壤細菌群落結構變化的指示種。未來研究可以結合土壤酶、分泌物、功能基因等方面分析，進一步探究導致微生物群落改變的內(nèi)在機制。