• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一種基于苯并噻唑的比色比率熒光探針識(shí)別檢測(cè)HSO3-

    2022-06-09 07:38:32王煜高文英
    關(guān)鍵詞:噻唑孵育探針

    王煜,高文英

    (山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

    0 引言

    亞硫酸氫鹽(HSO3?)作為主要的大氣污染物SO2的衍生物,對(duì)人體健康及生態(tài)系統(tǒng)都有較大的影響[1-3]。研究表明,體內(nèi)過量的亞硫酸氫鹽會(huì)對(duì)組織和細(xì)胞造成不可逆的損傷,誘發(fā)呼吸道疾病、心腦血管疾病和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4-7]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織共同提出人體內(nèi)亞硫酸氫鹽水平應(yīng)低于0.7 mg/kg[8]。鑒于亞硫酸氫鹽被廣泛用作漂白劑,染料、造紙、皮革制造中的還原劑以及食品防腐劑和植物生長調(diào)節(jié)劑[9-12],開發(fā)有效的分析方法對(duì)食品和環(huán)境中HSO3?的檢測(cè)至關(guān)重要。

    在對(duì)亞硫酸氫鹽的檢測(cè)中,傳統(tǒng)的電化學(xué)法[13-14]、高效液相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳[16]、化學(xué)發(fā)光法[17]等方法存在操作復(fù)雜、靈敏度低以及費(fèi)用較高等問題。相比之下,熒光探針因具有響應(yīng)速度快、操作簡單、靈敏度高、生物成像應(yīng)用方便、可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[18-20]而受到廣泛關(guān)注。近年來文獻(xiàn)報(bào)道了不少基于配位作用[21]、對(duì)醛的親核加成[22]、邁克爾加成[23-26]、乙酰丙酸酯分解[27-28]等反應(yīng)機(jī)理的HSO3?熒光探針,但仍然存在探針結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶液中無法檢測(cè)、響應(yīng)時(shí)間長、靈敏度低以及無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)生物成像等問題。因此,開發(fā)性能優(yōu)良的熒光探針用于HSO3?的檢測(cè)仍具有很大的發(fā)展空間。

    本文以3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽和3,4-二羥基苯甲醛為原料合成了熒光探針BDT,其中鄰苯二酚基團(tuán)和苯并噻唑鹽通過C=C雙鍵共軛連接成一個(gè)大的π-共軛體系,且具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)特性。帶正電荷的苯并噻唑部分作為邁克爾加成的反應(yīng)位點(diǎn),還可以增加探針的水溶性。HSO3?與BDT發(fā)生加成反應(yīng),破壞了探針分子的π-共軛體系,阻斷ICT過程,引起溶液顏色及熒光發(fā)射波長的顯著改變,從而可實(shí)現(xiàn)在水體系中比色/比率檢測(cè)HSO3?。探針BDT對(duì)HSO3?表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度。此外,BDT對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性HSO3?具有良好的熒光成像能力。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450,島津,日本);熒光分光光度計(jì)(F-4600,日立,日本),激發(fā)波長分別為300 nm和533 nm,Ex/Em狹縫寬度為10 nm;核磁共振儀(AVANCEIIIHD-600,Bruker,德 國 );高 分 辨 質(zhì) 譜 儀(Bruker mi?crOTOF-Q III);酸度計(jì)(pH-FE20,梅特勒-托利多,上海精密儀器公司);共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-880,德國)。

    2-甲基苯并咪唑、3,4-二羥基苯甲醛(98%,上海阿拉丁生化科技有限公司),溴化芐(98%,上海麥克林生化科技有限公司),實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所用其他試劑均為分析純。

    1.2 探針BDT的合成及結(jié)構(gòu)表征

    探針BDT的合成路線如圖1所示。3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽按照文獻(xiàn)[29]報(bào)道方法合成。將 0.5 mmol(0.16 g)3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽與 0.5 mmol(0.069 g)3,4-二羥基苯甲醛溶于7 mL乙醇中,固體充分溶解后加入2滴哌啶,在N2保護(hù)下加熱回流10 h,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫并放入冰箱冷凍24 h,抽濾得到紅褐色固體產(chǎn)物(BDT)。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.445 7(1H,s),9.381 4(1H,s),7.473 2(1H,s),8.109 7(1H,d),6.889 8(1H,d),7.881 2(1H,d),8.164 5(1H,d),7.779 6(1H,t),7.731 8(1H,t),8.421 1(1H,d),6.224 9(2H,s),7.395 5(6H,m)。13C NMR(600 MHz,DMSO-d6):173.38,152.16, 151.63, 146.53, 141.71, 134.52,129.85, 129.61, 128.89, 128.58, 128.19,127.30, 126.37, 125.41, 124.87, 117.09,116.94,116.48,109.85,56.48,51.51,19.03。HRMS(ESI):calcd.for C22H18NO2S+(M-Br?)360.105 3,found 360.104 6。

    圖1 BDT的合成路線圖Fig.1 Synthesis of BDT

    1.3 光譜研究方法

    探針 BDT(1×10?3mol·L?1)和陰離子儲(chǔ)備液(1×10?2mol·L?1)分別用DMSO和二次蒸餾水配制。在比色管中加入一定量的探針儲(chǔ)備液和一定量的陰離子儲(chǔ)備液,而后加入100 μL HEPES緩沖溶液(pH=7.4),使用二次蒸餾水定容至5 mL,混合均勻,進(jìn)行相應(yīng)的紫外或熒光光譜測(cè)定。紫外及熒光測(cè)定中探針的濃度分別為 20 μmol·L?1及 8 μmol·L?1。

    1.4 實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)

    白糖、白酒均購自山西大學(xué)文瀛超市,于比色管中分別加入0.5 g白糖和100 μL白酒,用二次蒸餾水定容至5 mL作為待測(cè)溶液,加入探針 BDT(8 μmol·L?1)后測(cè)定熒光發(fā)射光譜,并采用標(biāo)準(zhǔn)加入回收法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.5 細(xì)胞成像

    將HeLa細(xì)胞在37℃,含5% CO2的環(huán)境中用 10%(V/V)胎 牛 血 清(FBS,Gibco)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在成像實(shí)驗(yàn)中,首先將細(xì)胞與 BDT(10 μmol·L?1)在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育20 min,然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次,以消除未進(jìn)入細(xì)胞的探針BDT。在共聚焦顯微鏡下成像。之后,繼續(xù)加入HSO3?(20 μmol·L?1)共同孵育,PBS 沖洗 3 次后,使用63倍物鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。在內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,兩組HeLa細(xì)胞分別用BDT和BDT+Cys共同孵育30 min,用PBS洗滌3次后進(jìn)行成像。激發(fā)波長為405 nm和488 nm,發(fā)射光譜波長范圍分別為410 nm~481 nm和500 nm~601 nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 HSO3?對(duì)BDT紫外吸收光譜的影響

    BDT的光譜測(cè)試在H2O體系(25 mmol·L?1HEPES緩沖溶液,pH 7.4)中進(jìn)行。圖 2(a)為BDT在水體系中加入HSO3?前后紫外吸收光譜的變化。BDT本身在534 nm處有較強(qiáng)的吸收,該吸收峰由鄰苯二酚基團(tuán)到苯并噻唑鹽的ICT過程產(chǎn)生。隨著HSO3?的逐量加入,由于二者發(fā)生親核加成反應(yīng)后,阻礙了分子的π-π共軛及ICT效應(yīng),使534 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸減弱,279 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增加,且在305 nm處出現(xiàn)了一個(gè)等吸收點(diǎn),表明反應(yīng)中形成了新的穩(wěn)定化合物。同時(shí),溶液的顏色由紫紅色變?yōu)闊o色。圖2(b)表明,吸光度比A534nm/A279nm與HSO3?濃度在0~1×10?5mol·L?1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可用于對(duì)HSO3?濃度的定量檢測(cè)。

    圖2 (a)不同濃度HSO3?(0~2 equiv)存在下BDT(2×10?5mol·L?1)的紫外吸收光譜。插圖:日光燈下BDT溶液的顏色變化;(b)BDT的吸光度比A534 nm/A279 nm隨[HSO3?]的變化Fig.2 (a)Uv-vis absorption spectra of BDT(2×10?5mol·L?1)with the incremental concentration of HSO3? (0-2 equiv.).Inset:The color change of BDT solution under daylight;(b)Curve of absorbance ratio(A534 nm/A279 nm)vs[HSO3?]

    圖 3(a)為常見陰離子(F?,Cl?,Br?,I?,HSO4?,SO42?,AcO?,NO3?,H2PO4?,HSO3?,CN?,S2?,HCO3?,CO32?,ClO?,H2O2,C2O42?,S2O32?,Cys,Hcy,GSH)與 BDT 作用后紫外吸收光譜的變化情況,結(jié)果顯示,只有HSO3?能夠使BDT的吸收光譜和溶液顏色發(fā)生顯著變化。此外,共存離子不會(huì)對(duì)BDT-HSO3?的吸光度值造成影響(圖3(b))。表明BDT對(duì)HSO3?具有高選擇性識(shí)別能力,可用于對(duì)HSO3-的可視化識(shí)別檢測(cè)。

    圖3 (a)不同陰離子(1×10?4mol·L?1)對(duì)探針BDT(2×10?5mol·L?1)紫外吸收光譜的影響;(b)在HSO3? 存在下添加干擾離子后,BDT(2×10?5mol·L?1)的吸光度比(A534 nm/A279 nm)Fig.3 (a)Uv-vis absorption spectra of BDT(2×10?5mol·L?1)after addition of various anions(1×10?4mol·L?1);(b)The absorbance ratio(A534 nm/A279 nm)of BDT(2×10?5mol·L?1)after adding interfering ions in the presence of HSO3?

    2.2 HSO3?對(duì)BDT熒光光譜的影響

    通過熒光發(fā)射光譜考察了探針與HSO3?的相互作用。如圖4所示,分別以300 nm和533 nm作為激發(fā)波長,探針BDT的熒光光譜在337 nm和590 nm處呈現(xiàn)發(fā)射峰。隨著HSO3?濃度的增加,337 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),而590 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低,顯示出良好的比率檢測(cè)性能。圖 4(c)顯示,在 0~1.2×10?5mol·L?1范圍內(nèi),BDT檢測(cè)HSO3?顯示出良好的線性關(guān)系,根據(jù)方程3σ/S,計(jì)算得到檢出限為2.86×10?7mol·L?1,低于我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的食品中HSO3?的最大允許值(1.56×10?3mol·L?1)[30]。此外,對(duì)濃度為 4×10?5mol·L-1的 HSO3?進(jìn)行 6次平行測(cè)定,計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.94%,表明探針BDT對(duì)HSO3?的熒光響應(yīng)重復(fù)性和精密度良好。

    圖4 BDT熒光光譜隨HSO3?濃度的變化,(a)λex=533 nm;(b)λex=300 nm;(c)校準(zhǔn)曲線Fig.4 Change in fluorescence spectrum of BDT with HSO3? concentration,(a)λex=533 nm;(b)λex=300 nm;(c)Calibration curve

    實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了BDT對(duì)HSO3?的選擇性及抗干擾能力。如圖5(a)所示,除HSO3?外,其他陰離子均不能使探針BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度降低。此外,共存離子(4×10?5mol·L?1)的加入并不會(huì)對(duì) BDT 檢測(cè) HSO3?的熒光響應(yīng)產(chǎn)生影響(圖5(b))。以上結(jié)果表明,探針BDT在水體系中能夠?qū)SO3?進(jìn)行特異性識(shí)別檢測(cè),是一種在復(fù)雜環(huán)境中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的HSO3?熒光探針。

    圖5 (a)不同陰離子(4×10?5mol·L?1)對(duì)探針BDT(8×10?6mol·L?1)熒光光譜的影響;(b)在HSO3?存在下添加干擾離子(4×10?5mol·L?1)后,BDT(8×10?5mol·L?1)的熒光強(qiáng)度比(F590 nm/F337 nm)Fig.5 (a)Fluorescence spectra of BDT(8×10?6mol·L?1)after addition of various anions(4×10?5mol·L?1);(b)the fluorescence intensity ratio(F590 nm/F337 nm)of BDT(8×10?5mol·L?1)after adding interfering ions(4×10?5mol·L?1)in the presence of HSO3?

    為了探究探針BDT檢測(cè)HSO3?的實(shí)用性,考察了pH對(duì)BDT及BDT-HSO3?熒光光譜的影響。如圖6(a)所示,當(dāng)pH為7~8時(shí),BDT對(duì)HSO3?有較好的光譜響應(yīng),因此選擇pH 7.4進(jìn)行光譜測(cè)試。隨后,探究了BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況(圖6(b)),可以發(fā)現(xiàn),HSO3?的加入使BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度迅速降低,180 s達(dá)到平衡。上述結(jié)果表明,探針BDT能夠?qū)崿F(xiàn)在生理pH值下快速檢測(cè)HSO3?。

    圖6 (a)pH對(duì)BDT和BDT-HSO3? 處熒光強(qiáng)度的影響;(b)BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。([BDT]=8×10?6 mol·L?1,[HSO3?]=4×10?5mol·L?1)Fig.6 (a)Effect of pH on the fluorescence intensity of BDT and BDT+HSO3?;(b)Time dependent fluorescence intensity of BDT-HSO3?.([BDT]=8×10?6mol·L?1,[HSO3-]=4×10?5mol·L?1)

    2.3 響應(yīng)機(jī)理

    為了考察響應(yīng)機(jī)理,利用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)得BDT與HSO3?以1∶1化學(xué)計(jì)量比相互作用(圖7)。高分辨質(zhì)譜中m/z440.062 62[計(jì)算值,m/z440.070 46]的峰對(duì)應(yīng)于[BDT+HSO3--H],進(jìn)一步證明BDT與HSO3-形成1∶1的加成產(chǎn)物(圖8)。

    圖7 BDT-HSO3? 的結(jié)合比測(cè)定,([BDT]+[HSO3?]=20 μmol/L)Fig.7 Determination of BDT-HSO3? binding ratio,([BDT]+[HSO3?]=20 μmol/L)

    圖8 在CH3CN中BDT加入HSO3?后的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum after adding HSO3?to BDT in CH3CN

    以d6-DMSO為溶劑,通過1H NMR進(jìn)一步研究了BDT與HSO3?的反應(yīng)模式(圖9)。加入 HSO3?后 ,乙 烯 基 質(zhì) 子 Hb(8.19)和 Hc(7.88)的質(zhì)子峰信號(hào)分別向高場(chǎng)方向移動(dòng)至4.98和4.81,此外,噻唑N原子鄰位的亞甲基Ha從6.23移動(dòng)至4.05。這些結(jié)果表明,探針BDT與HSO3?在不飽和C=C雙鍵處進(jìn)行作用,使整個(gè)分子的共軛程度降低,ICT效應(yīng)受阻,參與電子離域的質(zhì)子周圍電荷密度增大,進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)子向高場(chǎng)方向移動(dòng)。因此,我們推測(cè)HSO3?與BDT以1,4-加成的方式發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。

    圖9 d6-DMSO中BDT和BDT+HSO3?的1H NMR譜及其傳感機(jī)理Fig.9 1H NMR spectra of BDT and BDT+HSO3?in d6-DMSO and the sensing mechanism

    2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

    HSO3?是一種重要的食品添加劑,已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),但食品中過量的HSO3?可能會(huì)導(dǎo)致一些健康問題。為了評(píng)估探針BDT對(duì)實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)能力,將BDT應(yīng)用于白糖和白酒中3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次后取平均值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到該實(shí)驗(yàn)的回收率,結(jié)果如表1所示,白糖和白酒中HSO3?的回收率在90.6%~107.5%之間,精確度良好。說明探針BDT在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有可靠的應(yīng)用價(jià)值。

    表1 探針BDT對(duì)食品樣品中HSO3?濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of HSO3?in food samples using BDT probe

    2.5 細(xì)胞熒光成像

    采用MTT法檢測(cè)了探針的細(xì)胞毒性。如圖10所示,HeLa細(xì)胞與不同濃度的BDT溶液(0~30 μmol·L?1)共同孵育 12 h,細(xì)胞存活率大于90%,表明探針BDT具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性。

    圖10 BDT對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of BDT to HeLa cells

    為了進(jìn)一步研究探針BDT在生物體內(nèi)的潛在應(yīng)用能力,首先對(duì)HeLa細(xì)胞中的HSO3?進(jìn)行了體外熒光成像實(shí)驗(yàn)。如圖11所示,將探針BDT(10 μmol·L?1)與 HeLa 細(xì) 胞 共 同 孵 育 20 min 后,加入 20 μmol·L?1HSO3?繼續(xù)孵育,隨著孵育時(shí)間的增加,橙色通道中熒光信號(hào)減弱,而藍(lán)色通道中熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),這與該探針在溶液中的光學(xué)行為表現(xiàn)一致。且在此過程中,細(xì)胞形態(tài)較好,表明探針BDT能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的外源性HSO3?。

    圖11 探針BDT與HSO3?共同孵育的共聚焦圖像Fig.11 Confocal images of BDT(10 μmol·L?1)treated with HSO3?(20 μmol·L?1)in HeLa cells

    隨后,我們對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)進(jìn)行了評(píng)估,使用Cys作為刺激產(chǎn)生SO2的興奮劑,如圖 12 所示,HeLa細(xì)胞與 10 μmol·L?1探針共同孵育時(shí)只能觀察到橙色通道熒光信號(hào),而加入 250 μmol·L?1Cys后,藍(lán)色通道出現(xiàn)熒光信號(hào),橙色通道熒光減弱。表明Cys刺激產(chǎn)生的SO2與探針BDT產(chǎn)生作用。以上結(jié)果表明,探針BDT具有良好的細(xì)胞膜通透性,在活細(xì)胞中監(jiān)測(cè)內(nèi)源性以及外源性HSO3?均具有良好的應(yīng)用潛力。

    圖12 HeLa細(xì)胞的共聚焦圖像,(a)用10 μmol·L?1BDT孵育;(b)用10 μmol·L?1BDT和250 μmol·L?1Cys共同孵育Fig.12 Confocal images of HeLa cells,(a)incubated with 10 μmol·L?1BDT;(b)incubated with 10 μmol·L?1BDT and 250 μmol·L?1Cys

    3 結(jié)論

    本文以苯并噻唑?yàn)闊晒鈭F(tuán),設(shè)計(jì)合成了一種比率檢測(cè)HSO3?的熒光探針BDT。在接近100%的水體系中,探針BDT與HSO3?發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),引起熒光光譜及溶液顏色的顯著變化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)HSO3?的熒光傳感及裸眼識(shí)別。在實(shí)際應(yīng)用中,探針BDT能夠有效檢測(cè)食品樣品白糖和白酒中HSO3?的含量,并可用于對(duì)活體細(xì)胞中HSO3?的熒光成像。因此,該探針在傳感、生物樣品信號(hào)傳導(dǎo)及檢測(cè)方面均具有良好的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    噻唑孵育探針
    基于苯并噻唑用作分析物檢測(cè)的小分子熒光探針
    云南化工(2021年7期)2021-12-21 07:27:22
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測(cè)定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定反應(yīng)液中的苯并噻唑和2-巰基苯并噻唑
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    掃描近場(chǎng)光電多功能探針系統(tǒng)
    含噻唑環(huán)的磺胺母核合成與鑒定
    av女优亚洲男人天堂 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 久久热在线av| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久亚洲av毛片大全| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕久久专区| 韩国av一区二区三区四区| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av天堂在线播放| 丁香欧美五月| 99久久精品热视频| 九色成人免费人妻av| 欧美日韩乱码在线| 日韩av在线大香蕉| 国产精品久久视频播放| 久久久久九九精品影院| 成人av在线播放网站| 99久久国产精品久久久| 亚洲欧美激情综合另类| 中出人妻视频一区二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产欧美网| 中文字幕高清在线视频| 在线观看舔阴道视频| 超碰成人久久| 女同久久另类99精品国产91| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品影院久久| 亚洲国产精品999在线| 香蕉av资源在线| 美女黄网站色视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 免费观看人在逋| 夜夜爽天天搞| 成年人黄色毛片网站| 国产淫片久久久久久久久 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产视频一区二区在线看| 在线观看66精品国产| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日韩欧美国产一区二区入口| avwww免费| 国产私拍福利视频在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 舔av片在线| 成人午夜高清在线视频| 老鸭窝网址在线观看| tocl精华| 99久久精品国产亚洲精品| 婷婷丁香在线五月| 男女那种视频在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲欧美日韩东京热| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲片人在线观看| 久久久成人免费电影| 亚洲精品色激情综合| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 偷拍熟女少妇极品色| 69av精品久久久久久| 久久久色成人| 免费在线观看亚洲国产| 国产人伦9x9x在线观看| 麻豆一二三区av精品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看免费视频日本深夜| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜影院日韩av| 亚洲美女视频黄频| 久久久国产精品麻豆| 哪里可以看免费的av片| 亚洲中文av在线| а√天堂www在线а√下载| 18美女黄网站色大片免费观看| 麻豆国产av国片精品| 久久久国产成人精品二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 日本五十路高清| 在线观看一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 免费观看人在逋| 日本一二三区视频观看| 国产单亲对白刺激| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美高清成人免费视频www| 国产毛片a区久久久久| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品影院久久| 国产精品av视频在线免费观看| 天堂√8在线中文| 岛国在线免费视频观看| 麻豆国产av国片精品| 人妻久久中文字幕网| 怎么达到女性高潮| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成人午夜高清在线视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 女人被狂操c到高潮| 国产成人av激情在线播放| 看片在线看免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 97碰自拍视频| 国产精品久久久久久精品电影| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久精品91无色码中文字幕| 三级毛片av免费| 午夜久久久久精精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 手机成人av网站| 波多野结衣高清无吗| 美女黄网站色视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文在线观看免费www的网站| 一区二区三区国产精品乱码| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成年人精品一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美色视频一区免费| 欧美中文综合在线视频| 在线观看舔阴道视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 黄色视频,在线免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 女人被狂操c到高潮| 国产精品电影一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产真人三级小视频在线观看| 免费高清视频大片| 成人午夜高清在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 91字幕亚洲| 黄片小视频在线播放| 国产成人精品无人区| e午夜精品久久久久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 免费看十八禁软件| 午夜精品久久久久久毛片777| 日韩欧美在线二视频| 无限看片的www在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| av国产免费在线观看| 成在线人永久免费视频| 国产视频一区二区在线看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜a级毛片| a级毛片a级免费在线| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 听说在线观看完整版免费高清| 青草久久国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲电影在线观看av| 亚洲国产看品久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线观看日韩欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 特级一级黄色大片| 91字幕亚洲| av天堂在线播放| 亚洲精品美女久久av网站| 日本 欧美在线| 女人被狂操c到高潮| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人特级黄色片久久久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| а√天堂www在线а√下载| 黄色片一级片一级黄色片| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美日韩精品网址| 国产成人系列免费观看| 舔av片在线| 午夜激情欧美在线| 久久久精品大字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一a级毛片在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 操出白浆在线播放| 成人欧美大片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲国产精品sss在线观看| 舔av片在线| 精品无人区乱码1区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久国产精品影院| 久久亚洲精品不卡| 国产成人精品无人区| 成年女人毛片免费观看观看9| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| ponron亚洲| 宅男免费午夜| 两个人视频免费观看高清| 欧美3d第一页| 无限看片的www在线观看| 波多野结衣高清无吗| 成人特级av手机在线观看| 日韩有码中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 久久99热这里只有精品18| 欧美在线一区亚洲| 成人鲁丝片一二三区免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产高清视频在线播放一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 天天一区二区日本电影三级| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av电影在线进入| 国产美女午夜福利| 丁香六月欧美| 亚洲精品在线美女| 美女黄网站色视频| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美乱色亚洲激情| 999久久久国产精品视频| 天堂动漫精品| 欧美乱妇无乱码| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| а√天堂www在线а√下载| 人妻久久中文字幕网| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| av欧美777| 黄色女人牲交| 亚洲国产看品久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 丁香六月欧美| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜激情福利司机影院| 中文字幕久久专区| 黄色 视频免费看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲人与动物交配视频| 窝窝影院91人妻| 日本五十路高清| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 在线a可以看的网站| 18禁国产床啪视频网站| 日本 欧美在线| 制服人妻中文乱码| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久久久午夜电影| 国产亚洲欧美98| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲片人在线观看| 又大又爽又粗| 国产激情欧美一区二区| 久久久久久人人人人人| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 真人一进一出gif抽搐免费| 九色国产91popny在线| 久久久久久九九精品二区国产| 一级作爱视频免费观看| 很黄的视频免费| 欧美乱色亚洲激情| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 黄色成人免费大全| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天天躁日日操中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜两性在线视频| 亚洲av成人av| 国产成人aa在线观看| 国产熟女xx| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91在线精品国自产拍蜜月 | 最新在线观看一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 啦啦啦免费观看视频1| 免费大片18禁| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲中文日韩欧美视频| 91字幕亚洲| 精品免费久久久久久久清纯| 高清在线国产一区| 99视频精品全部免费 在线 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一进一出好大好爽视频| 久久午夜亚洲精品久久| 少妇的逼水好多| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一个人观看的视频www高清免费观看 | aaaaa片日本免费| 特级一级黄色大片| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久久国内视频| 看免费av毛片| 午夜福利在线在线| 51午夜福利影视在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| av福利片在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜激情欧美在线| 日本熟妇午夜| 免费电影在线观看免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久人人精品亚洲av| a级毛片在线看网站| 最新美女视频免费是黄的| 国产午夜福利久久久久久| 成年女人永久免费观看视频| 国产69精品久久久久777片 | 嫩草影院精品99| 色综合欧美亚洲国产小说| 一二三四在线观看免费中文在| 黄片小视频在线播放| 1024手机看黄色片| 亚洲国产欧美网| 美女午夜性视频免费| a在线观看视频网站| 国产精品一区二区免费欧美| 男人舔女人的私密视频| 午夜亚洲福利在线播放| 级片在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 91av网站免费观看| 精品日产1卡2卡| 中文亚洲av片在线观看爽| 变态另类丝袜制服| 亚洲成a人片在线一区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av欧美777| 久久久国产成人免费| 中文资源天堂在线| 午夜福利欧美成人| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 99re在线观看精品视频| 99riav亚洲国产免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 校园春色视频在线观看| 精品国产亚洲在线| 久久久久久大精品| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线a可以看的网站| 国产高清视频在线观看网站| 日韩有码中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费 | 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品 欧美亚洲| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 制服丝袜大香蕉在线| www.熟女人妻精品国产| 两个人的视频大全免费| 男女之事视频高清在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 老熟妇仑乱视频hdxx| 男女之事视频高清在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最近视频中文字幕2019在线8| 人妻久久中文字幕网| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费观看精品视频网站| 丁香欧美五月| 国产真实乱freesex| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产三级黄色录像| 国产久久久一区二区三区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲激情在线av| 国产97色在线日韩免费| 久久香蕉精品热| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 两个人看的免费小视频| 亚洲真实伦在线观看| 久久久久九九精品影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费人成视频x8x8入口观看| 中文字幕高清在线视频| 亚洲激情在线av| 国产单亲对白刺激| 999久久久精品免费观看国产| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲熟女毛片儿| 黄色视频,在线免费观看| 国产高清三级在线| av国产免费在线观看| 女警被强在线播放| 老司机在亚洲福利影院| 噜噜噜噜噜久久久久久91| xxx96com| 国产主播在线观看一区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人av一区二区三区在线看| a级毛片在线看网站| 国产熟女xx| 亚洲熟妇熟女久久| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 99精品久久久久人妻精品| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品综合一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 啦啦啦免费观看视频1| 三级毛片av免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费人成视频x8x8入口观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品影院6| 国产高清videossex| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 色播亚洲综合网| 色综合婷婷激情| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久伊人香网站| 欧美日韩一级在线毛片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品不卡国产一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲av成人精品一区久久| 成人三级黄色视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲专区国产一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月 | 麻豆一二三区av精品| 97超视频在线观看视频| 欧美中文日本在线观看视频| 悠悠久久av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品亚洲美女久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产真实乱freesex| av福利片在线观看| 一夜夜www| 午夜日韩欧美国产| 97超视频在线观看视频| www.精华液| 久久人人精品亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 精品不卡国产一区二区三区| av视频在线观看入口| 国产亚洲精品av在线| 床上黄色一级片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 不卡av一区二区三区| 88av欧美| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 哪里可以看免费的av片| 国产 一区 欧美 日韩| 午夜a级毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 一a级毛片在线观看| 国产亚洲欧美98| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 18美女黄网站色大片免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲性夜色夜夜综合| 看黄色毛片网站| 国产av不卡久久| 亚洲在线观看片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 色尼玛亚洲综合影院| 男女下面进入的视频免费午夜| 成年女人毛片免费观看观看9| 人人妻人人澡欧美一区二区| x7x7x7水蜜桃| 国产高潮美女av| 国产精华一区二区三区| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 搞女人的毛片| 天天添夜夜摸| 久久精品国产综合久久久| 露出奶头的视频| 黑人操中国人逼视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产伦精品一区二区三区四那| АⅤ资源中文在线天堂| 99热这里只有是精品50| 午夜免费观看网址| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品国产三级普通话版| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 精品久久久久久,| 欧美黄色淫秽网站| 午夜影院日韩av| av片东京热男人的天堂| 日本与韩国留学比较| 欧美3d第一页| 日韩欧美精品v在线| 国产单亲对白刺激| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久伊人香网站| 午夜免费观看网址| 一本精品99久久精品77| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产视频内射| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品久久久av美女十八| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品久久久久久,| 国产v大片淫在线免费观看| 国产不卡一卡二| 国产久久久一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 桃红色精品国产亚洲av| 精品不卡国产一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产午夜福利久久久久久| 欧美色视频一区免费| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 岛国在线免费视频观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩欧美三级三区| 在线播放国产精品三级| 久久久久久久久久黄片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久香蕉国产精品| 久久亚洲真实| 婷婷精品国产亚洲av| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人国产综合亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 午夜日韩欧美国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 两个人视频免费观看高清| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久九九热精品免费| 不卡一级毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美丝袜亚洲另类 | www.999成人在线观看| 国产精品野战在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产免费男女视频| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | xxx96com| 国产精品日韩av在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 精品福利观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 老汉色∧v一级毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产欧美网| 免费观看人在逋| 国产精品99久久99久久久不卡| 两性夫妻黄色片| 97碰自拍视频|