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    一種基于苯并噻唑的比色比率熒光探針識(shí)別檢測(cè)HSO3-

    2022-06-09 07:38:32王煜高文英
    關(guān)鍵詞:噻唑孵育探針

    王煜,高文英

    (山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

    0 引言

    亞硫酸氫鹽(HSO3?)作為主要的大氣污染物SO2的衍生物,對(duì)人體健康及生態(tài)系統(tǒng)都有較大的影響[1-3]。研究表明,體內(nèi)過量的亞硫酸氫鹽會(huì)對(duì)組織和細(xì)胞造成不可逆的損傷,誘發(fā)呼吸道疾病、心腦血管疾病和多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4-7]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織共同提出人體內(nèi)亞硫酸氫鹽水平應(yīng)低于0.7 mg/kg[8]。鑒于亞硫酸氫鹽被廣泛用作漂白劑,染料、造紙、皮革制造中的還原劑以及食品防腐劑和植物生長調(diào)節(jié)劑[9-12],開發(fā)有效的分析方法對(duì)食品和環(huán)境中HSO3?的檢測(cè)至關(guān)重要。

    在對(duì)亞硫酸氫鹽的檢測(cè)中,傳統(tǒng)的電化學(xué)法[13-14]、高效液相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳[16]、化學(xué)發(fā)光法[17]等方法存在操作復(fù)雜、靈敏度低以及費(fèi)用較高等問題。相比之下,熒光探針因具有響應(yīng)速度快、操作簡單、靈敏度高、生物成像應(yīng)用方便、可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[18-20]而受到廣泛關(guān)注。近年來文獻(xiàn)報(bào)道了不少基于配位作用[21]、對(duì)醛的親核加成[22]、邁克爾加成[23-26]、乙酰丙酸酯分解[27-28]等反應(yīng)機(jī)理的HSO3?熒光探針,但仍然存在探針結(jié)構(gòu)復(fù)雜、水溶液中無法檢測(cè)、響應(yīng)時(shí)間長、靈敏度低以及無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)生物成像等問題。因此,開發(fā)性能優(yōu)良的熒光探針用于HSO3?的檢測(cè)仍具有很大的發(fā)展空間。

    本文以3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽和3,4-二羥基苯甲醛為原料合成了熒光探針BDT,其中鄰苯二酚基團(tuán)和苯并噻唑鹽通過C=C雙鍵共軛連接成一個(gè)大的π-共軛體系,且具有分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)特性。帶正電荷的苯并噻唑部分作為邁克爾加成的反應(yīng)位點(diǎn),還可以增加探針的水溶性。HSO3?與BDT發(fā)生加成反應(yīng),破壞了探針分子的π-共軛體系,阻斷ICT過程,引起溶液顏色及熒光發(fā)射波長的顯著改變,從而可實(shí)現(xiàn)在水體系中比色/比率檢測(cè)HSO3?。探針BDT對(duì)HSO3?表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度。此外,BDT對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性HSO3?具有良好的熒光成像能力。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450,島津,日本);熒光分光光度計(jì)(F-4600,日立,日本),激發(fā)波長分別為300 nm和533 nm,Ex/Em狹縫寬度為10 nm;核磁共振儀(AVANCEIIIHD-600,Bruker,德 國 );高 分 辨 質(zhì) 譜 儀(Bruker mi?crOTOF-Q III);酸度計(jì)(pH-FE20,梅特勒-托利多,上海精密儀器公司);共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM-880,德國)。

    2-甲基苯并咪唑、3,4-二羥基苯甲醛(98%,上海阿拉丁生化科技有限公司),溴化芐(98%,上海麥克林生化科技有限公司),實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。所用其他試劑均為分析純。

    1.2 探針BDT的合成及結(jié)構(gòu)表征

    探針BDT的合成路線如圖1所示。3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽按照文獻(xiàn)[29]報(bào)道方法合成。將 0.5 mmol(0.16 g)3-芐基-2甲基苯并噻唑溴化鹽與 0.5 mmol(0.069 g)3,4-二羥基苯甲醛溶于7 mL乙醇中,固體充分溶解后加入2滴哌啶,在N2保護(hù)下加熱回流10 h,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫并放入冰箱冷凍24 h,抽濾得到紅褐色固體產(chǎn)物(BDT)。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):10.445 7(1H,s),9.381 4(1H,s),7.473 2(1H,s),8.109 7(1H,d),6.889 8(1H,d),7.881 2(1H,d),8.164 5(1H,d),7.779 6(1H,t),7.731 8(1H,t),8.421 1(1H,d),6.224 9(2H,s),7.395 5(6H,m)。13C NMR(600 MHz,DMSO-d6):173.38,152.16, 151.63, 146.53, 141.71, 134.52,129.85, 129.61, 128.89, 128.58, 128.19,127.30, 126.37, 125.41, 124.87, 117.09,116.94,116.48,109.85,56.48,51.51,19.03。HRMS(ESI):calcd.for C22H18NO2S+(M-Br?)360.105 3,found 360.104 6。

    圖1 BDT的合成路線圖Fig.1 Synthesis of BDT

    1.3 光譜研究方法

    探針 BDT(1×10?3mol·L?1)和陰離子儲(chǔ)備液(1×10?2mol·L?1)分別用DMSO和二次蒸餾水配制。在比色管中加入一定量的探針儲(chǔ)備液和一定量的陰離子儲(chǔ)備液,而后加入100 μL HEPES緩沖溶液(pH=7.4),使用二次蒸餾水定容至5 mL,混合均勻,進(jìn)行相應(yīng)的紫外或熒光光譜測(cè)定。紫外及熒光測(cè)定中探針的濃度分別為 20 μmol·L?1及 8 μmol·L?1。

    1.4 實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)

    白糖、白酒均購自山西大學(xué)文瀛超市,于比色管中分別加入0.5 g白糖和100 μL白酒,用二次蒸餾水定容至5 mL作為待測(cè)溶液,加入探針 BDT(8 μmol·L?1)后測(cè)定熒光發(fā)射光譜,并采用標(biāo)準(zhǔn)加入回收法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.5 細(xì)胞成像

    將HeLa細(xì)胞在37℃,含5% CO2的環(huán)境中用 10%(V/V)胎 牛 血 清(FBS,Gibco)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在成像實(shí)驗(yàn)中,首先將細(xì)胞與 BDT(10 μmol·L?1)在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育20 min,然后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次,以消除未進(jìn)入細(xì)胞的探針BDT。在共聚焦顯微鏡下成像。之后,繼續(xù)加入HSO3?(20 μmol·L?1)共同孵育,PBS 沖洗 3 次后,使用63倍物鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。在內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,兩組HeLa細(xì)胞分別用BDT和BDT+Cys共同孵育30 min,用PBS洗滌3次后進(jìn)行成像。激發(fā)波長為405 nm和488 nm,發(fā)射光譜波長范圍分別為410 nm~481 nm和500 nm~601 nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 HSO3?對(duì)BDT紫外吸收光譜的影響

    BDT的光譜測(cè)試在H2O體系(25 mmol·L?1HEPES緩沖溶液,pH 7.4)中進(jìn)行。圖 2(a)為BDT在水體系中加入HSO3?前后紫外吸收光譜的變化。BDT本身在534 nm處有較強(qiáng)的吸收,該吸收峰由鄰苯二酚基團(tuán)到苯并噻唑鹽的ICT過程產(chǎn)生。隨著HSO3?的逐量加入,由于二者發(fā)生親核加成反應(yīng)后,阻礙了分子的π-π共軛及ICT效應(yīng),使534 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸減弱,279 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增加,且在305 nm處出現(xiàn)了一個(gè)等吸收點(diǎn),表明反應(yīng)中形成了新的穩(wěn)定化合物。同時(shí),溶液的顏色由紫紅色變?yōu)闊o色。圖2(b)表明,吸光度比A534nm/A279nm與HSO3?濃度在0~1×10?5mol·L?1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,可用于對(duì)HSO3?濃度的定量檢測(cè)。

    圖2 (a)不同濃度HSO3?(0~2 equiv)存在下BDT(2×10?5mol·L?1)的紫外吸收光譜。插圖:日光燈下BDT溶液的顏色變化;(b)BDT的吸光度比A534 nm/A279 nm隨[HSO3?]的變化Fig.2 (a)Uv-vis absorption spectra of BDT(2×10?5mol·L?1)with the incremental concentration of HSO3? (0-2 equiv.).Inset:The color change of BDT solution under daylight;(b)Curve of absorbance ratio(A534 nm/A279 nm)vs[HSO3?]

    圖 3(a)為常見陰離子(F?,Cl?,Br?,I?,HSO4?,SO42?,AcO?,NO3?,H2PO4?,HSO3?,CN?,S2?,HCO3?,CO32?,ClO?,H2O2,C2O42?,S2O32?,Cys,Hcy,GSH)與 BDT 作用后紫外吸收光譜的變化情況,結(jié)果顯示,只有HSO3?能夠使BDT的吸收光譜和溶液顏色發(fā)生顯著變化。此外,共存離子不會(huì)對(duì)BDT-HSO3?的吸光度值造成影響(圖3(b))。表明BDT對(duì)HSO3?具有高選擇性識(shí)別能力,可用于對(duì)HSO3-的可視化識(shí)別檢測(cè)。

    圖3 (a)不同陰離子(1×10?4mol·L?1)對(duì)探針BDT(2×10?5mol·L?1)紫外吸收光譜的影響;(b)在HSO3? 存在下添加干擾離子后,BDT(2×10?5mol·L?1)的吸光度比(A534 nm/A279 nm)Fig.3 (a)Uv-vis absorption spectra of BDT(2×10?5mol·L?1)after addition of various anions(1×10?4mol·L?1);(b)The absorbance ratio(A534 nm/A279 nm)of BDT(2×10?5mol·L?1)after adding interfering ions in the presence of HSO3?

    2.2 HSO3?對(duì)BDT熒光光譜的影響

    通過熒光發(fā)射光譜考察了探針與HSO3?的相互作用。如圖4所示,分別以300 nm和533 nm作為激發(fā)波長,探針BDT的熒光光譜在337 nm和590 nm處呈現(xiàn)發(fā)射峰。隨著HSO3?濃度的增加,337 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),而590 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低,顯示出良好的比率檢測(cè)性能。圖 4(c)顯示,在 0~1.2×10?5mol·L?1范圍內(nèi),BDT檢測(cè)HSO3?顯示出良好的線性關(guān)系,根據(jù)方程3σ/S,計(jì)算得到檢出限為2.86×10?7mol·L?1,低于我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的食品中HSO3?的最大允許值(1.56×10?3mol·L?1)[30]。此外,對(duì)濃度為 4×10?5mol·L-1的 HSO3?進(jìn)行 6次平行測(cè)定,計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.94%,表明探針BDT對(duì)HSO3?的熒光響應(yīng)重復(fù)性和精密度良好。

    圖4 BDT熒光光譜隨HSO3?濃度的變化,(a)λex=533 nm;(b)λex=300 nm;(c)校準(zhǔn)曲線Fig.4 Change in fluorescence spectrum of BDT with HSO3? concentration,(a)λex=533 nm;(b)λex=300 nm;(c)Calibration curve

    實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了BDT對(duì)HSO3?的選擇性及抗干擾能力。如圖5(a)所示,除HSO3?外,其他陰離子均不能使探針BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度降低。此外,共存離子(4×10?5mol·L?1)的加入并不會(huì)對(duì) BDT 檢測(cè) HSO3?的熒光響應(yīng)產(chǎn)生影響(圖5(b))。以上結(jié)果表明,探針BDT在水體系中能夠?qū)SO3?進(jìn)行特異性識(shí)別檢測(cè),是一種在復(fù)雜環(huán)境中具有潛在應(yīng)用價(jià)值的HSO3?熒光探針。

    圖5 (a)不同陰離子(4×10?5mol·L?1)對(duì)探針BDT(8×10?6mol·L?1)熒光光譜的影響;(b)在HSO3?存在下添加干擾離子(4×10?5mol·L?1)后,BDT(8×10?5mol·L?1)的熒光強(qiáng)度比(F590 nm/F337 nm)Fig.5 (a)Fluorescence spectra of BDT(8×10?6mol·L?1)after addition of various anions(4×10?5mol·L?1);(b)the fluorescence intensity ratio(F590 nm/F337 nm)of BDT(8×10?5mol·L?1)after adding interfering ions(4×10?5mol·L?1)in the presence of HSO3?

    為了探究探針BDT檢測(cè)HSO3?的實(shí)用性,考察了pH對(duì)BDT及BDT-HSO3?熒光光譜的影響。如圖6(a)所示,當(dāng)pH為7~8時(shí),BDT對(duì)HSO3?有較好的光譜響應(yīng),因此選擇pH 7.4進(jìn)行光譜測(cè)試。隨后,探究了BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況(圖6(b)),可以發(fā)現(xiàn),HSO3?的加入使BDT在590 nm處的熒光強(qiáng)度迅速降低,180 s達(dá)到平衡。上述結(jié)果表明,探針BDT能夠?qū)崿F(xiàn)在生理pH值下快速檢測(cè)HSO3?。

    圖6 (a)pH對(duì)BDT和BDT-HSO3? 處熒光強(qiáng)度的影響;(b)BDT-HSO3?熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。([BDT]=8×10?6 mol·L?1,[HSO3?]=4×10?5mol·L?1)Fig.6 (a)Effect of pH on the fluorescence intensity of BDT and BDT+HSO3?;(b)Time dependent fluorescence intensity of BDT-HSO3?.([BDT]=8×10?6mol·L?1,[HSO3-]=4×10?5mol·L?1)

    2.3 響應(yīng)機(jī)理

    為了考察響應(yīng)機(jī)理,利用等摩爾連續(xù)變化法測(cè)得BDT與HSO3?以1∶1化學(xué)計(jì)量比相互作用(圖7)。高分辨質(zhì)譜中m/z440.062 62[計(jì)算值,m/z440.070 46]的峰對(duì)應(yīng)于[BDT+HSO3--H],進(jìn)一步證明BDT與HSO3-形成1∶1的加成產(chǎn)物(圖8)。

    圖7 BDT-HSO3? 的結(jié)合比測(cè)定,([BDT]+[HSO3?]=20 μmol/L)Fig.7 Determination of BDT-HSO3? binding ratio,([BDT]+[HSO3?]=20 μmol/L)

    圖8 在CH3CN中BDT加入HSO3?后的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectrum after adding HSO3?to BDT in CH3CN

    以d6-DMSO為溶劑,通過1H NMR進(jìn)一步研究了BDT與HSO3?的反應(yīng)模式(圖9)。加入 HSO3?后 ,乙 烯 基 質(zhì) 子 Hb(8.19)和 Hc(7.88)的質(zhì)子峰信號(hào)分別向高場(chǎng)方向移動(dòng)至4.98和4.81,此外,噻唑N原子鄰位的亞甲基Ha從6.23移動(dòng)至4.05。這些結(jié)果表明,探針BDT與HSO3?在不飽和C=C雙鍵處進(jìn)行作用,使整個(gè)分子的共軛程度降低,ICT效應(yīng)受阻,參與電子離域的質(zhì)子周圍電荷密度增大,進(jìn)而導(dǎo)致質(zhì)子向高場(chǎng)方向移動(dòng)。因此,我們推測(cè)HSO3?與BDT以1,4-加成的方式發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。

    圖9 d6-DMSO中BDT和BDT+HSO3?的1H NMR譜及其傳感機(jī)理Fig.9 1H NMR spectra of BDT and BDT+HSO3?in d6-DMSO and the sensing mechanism

    2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

    HSO3?是一種重要的食品添加劑,已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),但食品中過量的HSO3?可能會(huì)導(dǎo)致一些健康問題。為了評(píng)估探針BDT對(duì)實(shí)際樣品中HSO3?的檢測(cè)能力,將BDT應(yīng)用于白糖和白酒中3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次后取平均值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到該實(shí)驗(yàn)的回收率,結(jié)果如表1所示,白糖和白酒中HSO3?的回收率在90.6%~107.5%之間,精確度良好。說明探針BDT在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有可靠的應(yīng)用價(jià)值。

    表1 探針BDT對(duì)食品樣品中HSO3?濃度的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of HSO3?in food samples using BDT probe

    2.5 細(xì)胞熒光成像

    采用MTT法檢測(cè)了探針的細(xì)胞毒性。如圖10所示,HeLa細(xì)胞與不同濃度的BDT溶液(0~30 μmol·L?1)共同孵育 12 h,細(xì)胞存活率大于90%,表明探針BDT具有良好的生物相容性和低細(xì)胞毒性。

    圖10 BDT對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of BDT to HeLa cells

    為了進(jìn)一步研究探針BDT在生物體內(nèi)的潛在應(yīng)用能力,首先對(duì)HeLa細(xì)胞中的HSO3?進(jìn)行了體外熒光成像實(shí)驗(yàn)。如圖11所示,將探針BDT(10 μmol·L?1)與 HeLa 細(xì) 胞 共 同 孵 育 20 min 后,加入 20 μmol·L?1HSO3?繼續(xù)孵育,隨著孵育時(shí)間的增加,橙色通道中熒光信號(hào)減弱,而藍(lán)色通道中熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),這與該探針在溶液中的光學(xué)行為表現(xiàn)一致。且在此過程中,細(xì)胞形態(tài)較好,表明探針BDT能夠檢測(cè)活細(xì)胞中的外源性HSO3?。

    圖11 探針BDT與HSO3?共同孵育的共聚焦圖像Fig.11 Confocal images of BDT(10 μmol·L?1)treated with HSO3?(20 μmol·L?1)in HeLa cells

    隨后,我們對(duì)HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性HSO3?的檢測(cè)進(jìn)行了評(píng)估,使用Cys作為刺激產(chǎn)生SO2的興奮劑,如圖 12 所示,HeLa細(xì)胞與 10 μmol·L?1探針共同孵育時(shí)只能觀察到橙色通道熒光信號(hào),而加入 250 μmol·L?1Cys后,藍(lán)色通道出現(xiàn)熒光信號(hào),橙色通道熒光減弱。表明Cys刺激產(chǎn)生的SO2與探針BDT產(chǎn)生作用。以上結(jié)果表明,探針BDT具有良好的細(xì)胞膜通透性,在活細(xì)胞中監(jiān)測(cè)內(nèi)源性以及外源性HSO3?均具有良好的應(yīng)用潛力。

    圖12 HeLa細(xì)胞的共聚焦圖像,(a)用10 μmol·L?1BDT孵育;(b)用10 μmol·L?1BDT和250 μmol·L?1Cys共同孵育Fig.12 Confocal images of HeLa cells,(a)incubated with 10 μmol·L?1BDT;(b)incubated with 10 μmol·L?1BDT and 250 μmol·L?1Cys

    3 結(jié)論

    本文以苯并噻唑?yàn)闊晒鈭F(tuán),設(shè)計(jì)合成了一種比率檢測(cè)HSO3?的熒光探針BDT。在接近100%的水體系中,探針BDT與HSO3?發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),引起熒光光譜及溶液顏色的顯著變化,實(shí)現(xiàn)了對(duì)HSO3?的熒光傳感及裸眼識(shí)別。在實(shí)際應(yīng)用中,探針BDT能夠有效檢測(cè)食品樣品白糖和白酒中HSO3?的含量,并可用于對(duì)活體細(xì)胞中HSO3?的熒光成像。因此,該探針在傳感、生物樣品信號(hào)傳導(dǎo)及檢測(cè)方面均具有良好的應(yīng)用前景。

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