光療對(duì)于黃疸新生兒腸道菌群及耐藥基因的影響分析

張 坤 樊賽男 鄭 芳 張佳慧 吳志敏 呂安平 馬亞男 方曉慧 張金萍

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院(上海 201306)

新生兒黃疸分生理性和病理性，當(dāng)未結(jié)合膽紅素水平過高時(shí)，則考慮病理性黃疸，即新生兒高膽紅素血癥。新生兒高膽紅素血癥是新生兒時(shí)期常見臨床問題，是由于體內(nèi)膽紅素生成過多、肝臟攝取和結(jié)合膽紅素能力不足、腸肝循環(huán)增加及膽紅素排泄異常等原因所致的膽紅素增高，臨床表現(xiàn)為黃疸[1]。過高的血清膽紅素透過血腦屏障可引起膽紅素腦病，若不治療，會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成永久性的損傷[2]。光療是目前病理性黃疸的最常規(guī)療法，近年來光療對(duì)新生兒的一些近期和遠(yuǎn)期不良反應(yīng)也日益被臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)[3-4]，但光療對(duì)于腸道菌群的影響鮮有報(bào)道。本研究采用宏基因組測序的方法，研究接受光療后新生兒腸道菌群的變化，同時(shí)分析其菌群攜帶耐藥基因的改變，從菌群的角度揭示光療對(duì)于新生兒腸道的影響，為深入探討光療可能造成的不良反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2018年6月至2020年6月于上海市第六人民醫(yī)院接受光療的住院足月新生兒的臨床資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合美國兒科協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)[5]以及2014 年中國新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識(shí)[6]，生后24 小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)黃疸；血清總膽紅素值達(dá)到相應(yīng)日齡及相應(yīng)危險(xiǎn)因素下光療干預(yù)標(biāo)準(zhǔn)，或每日上升達(dá)到85 μmol/L（5 mg/dL）或每小時(shí)＞0.85 μmol/L（0.5 mg/dL）；黃疸退而復(fù)現(xiàn)；血清結(jié)合膽紅素＞3 485 μmol/L（2 mg/dL）。②日齡≤2周。③足月兒，胎齡37～41+6周，出生體質(zhì)量2 500～3 999 g。④采集標(biāo)本前后未使用抗生素及微生態(tài)制劑；⑤母孕期身體健康，未服用抗生素及微生態(tài)制劑；⑥入院前為純?nèi)斯の桂B(yǎng)患兒；⑦自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡<37 周或≥42 周；②膽紅素水平高達(dá)換血標(biāo)準(zhǔn)，直接膽紅素升高者；③合并肺炎、敗血癥等疾病者；④有嚴(yán)重免疫缺陷病者；⑤有遺傳代謝性疾病者；⑥有先天性膽道畸形或其他臟器畸形者；⑦出生時(shí)有嚴(yán)重窒息病史；⑧因喂養(yǎng)不當(dāng)導(dǎo)致黃疸，如嚴(yán)重體質(zhì)量下跌超過10%患兒；⑨根據(jù)研究者判斷，具有中途退組可能者，如監(jiān)護(hù)者具有精神類疾病，生活或工作環(huán)境經(jīng)常變化容易造成失訪的情況。

本研究已獲得上海市第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.2017-004）。所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療干預(yù) 將患兒置于藍(lán)光治療箱（XHZ型號(hào)，寧波戴維醫(yī)療器械股份有限公司），用波長425～475 nm、雙面LED藍(lán)光持續(xù)式照射，所有患兒均采用連續(xù)光療24 h后休息6～8 h，再繼續(xù)光療24 h，然后根據(jù)患兒黃疸的變化情況決定是否再繼續(xù)下一個(gè)24 h治療。

1.2.2 標(biāo)本留取 留取所有入組的黃疸患兒光療前、光療后24 h、光療后48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大便標(biāo)本（每份標(biāo)本≥500 mg），留取后立即于－80 ℃條件下冷凍。

1.2.3 宏基因組測序 DNA 提取及檢測：參照QIAamp PowerFecal DNA Kit（QIAGEN，德國）說明書進(jìn)行糞便DNA的提取操作。文庫構(gòu)建及質(zhì)檢：檢測合格的DNA 樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度約350 bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、3’端加A、加測序接頭、純化、片段選擇、PCR 擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，先用電泳及Nanodrop進(jìn)行初步定量，再進(jìn)行Qubit 定量，使用qPCR 方法對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫上機(jī)質(zhì)量。上機(jī)測序：建庫質(zhì)檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求混合后進(jìn)行Illumina HiSeq測序。生物信息分析：測序數(shù)據(jù)預(yù)處理，從各樣品質(zhì)控后再分析讀數(shù)出發(fā)，使用軟件宏基因組組裝，最后行物種注釋及豐度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，兩組比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。菌群豐度的α 多樣性比較采用ANOSIM 非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。菌群豐度的β多樣性比較采用非度量多維尺度（NMDS）分析，Stress<0.2時(shí)，表示NMDS分析結(jié)果具有一定的可靠性；Stress<0.05 則認(rèn)為結(jié)果很好；Stress<0.01則認(rèn)為結(jié)果極好。變量間的相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行評(píng)估。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

參與研究的黃疸新生兒共32 例，所有患兒入院前后均未使用抗生素和益生菌?；純浩骄g為（38.0±7.0）周，出生體質(zhì)量為（3.4±0.6）kg。生后黃疸開始出現(xiàn)時(shí)的日齡為2.6（1.9～3.2）天，患兒光療時(shí)的日齡為3.5（2.4～8.9）天，患兒光療時(shí)間為（51.0±15.0）h，入院時(shí)經(jīng)皮測量膽紅素值為（21.0±5.0）mg/dL。

2.2 黃疸新生兒接受光療前后腸道菌群豐度α多樣性變化

對(duì)黃疸新生兒接受光療前后組間腸道菌群豐度的差異性進(jìn)行分析，光療前、后各組間黃疸新生兒腸道菌群豐度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=－0.003，P=0.526），但光療48 h有降低的趨勢。見圖1。

圖1 光療前、后菌群整體菌落豐度α 多樣性變化分析

2.3 黃疸新生兒接受光療前后腸道菌群β多樣性分析

采用NMDS 分析對(duì)黃疸新生兒接受光療前后腸道菌群豐度進(jìn)行排序圖分析，發(fā)現(xiàn)光療前后菌群在坐標(biāo)圖上呈現(xiàn)出分散的分布模式，但相似度接近，從縱軸和橫軸都很難把3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分開（Stress=0.175），菌群的排序在光療48 h時(shí)也有范圍減小的趨勢。見圖2。

圖2 光療前、后菌群β 多樣性分析

2.4 黃疸新生兒接受光療前后腸道菌種變化分析

患兒光療前后菌群種水平的相對(duì)OUT 豐度柱狀圖改變見圖3。光療前，光療后24 h和48 h之間梭狀芽孢桿菌、糞腸球菌、嗜熱鏈球菌、類桿菌、陰溝腸桿菌、巴氏鏈球菌、不動(dòng)桿菌屬未分類、丙酸棒桿菌、直腸真桿菌、痤瘡丙酸桿菌種水平的相對(duì)豐度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著光療時(shí)間的延長，梭狀芽孢桿菌、糞腸球菌、類桿菌、陰溝腸桿菌、巴氏鏈球菌、不動(dòng)桿菌屬未分類、直腸真桿菌的相對(duì)豐度在種水平上呈增加趨勢，而丙酸棒桿菌、痤瘡丙酸桿菌呈下降趨勢。見表1。

表1 黃疸新生兒光療后腸道菌群相對(duì)豐度在種水平的差異性[n=32，M(P25～P75)]

圖3 光療前、后菌群在種水平OUT 物種注釋分類

2.5 黃疸新生兒接受光療前后腸道菌群耐藥基因變化

黃疸新生兒接受光療前檢測其腸道菌群攜帶的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)共有242種耐藥基因，其中相對(duì)豐度>10的共79種；相對(duì)豐度>50的耐藥基因共13種，主要為四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、氨基糖苷類耐藥基因，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了較多大腸桿菌耐藥基因。

光療后腸道菌群攜帶的耐藥基因豐度發(fā)生顯著改變，豐度顯著增加的主要耐藥基因是β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（CTX-M-14）、氨基糖苷類耐藥基因（aadA2）、四環(huán)素類耐藥基因[tet（59）]、外排泵基因（efmA）、喹諾酮類耐藥基因（QnrS2）、碳青霉烯酶基因（OXA-347）和磺胺類耐藥基因（dfrA 1），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中只有金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)耐藥基因（mgrA）光療后降低（P<0.05）。見表2。

表2 黃疸新生兒光療后腸道菌群耐藥基因變化[n=32，M(P25～P75)]

2.6 黃疸新生兒接受光療48 h 后腸道菌種與耐藥基因的相關(guān)性分析

光療48 h 后，腸道菌群菌種水平的豐度與耐藥基因豐度呈顯著正相關(guān)的有：梭狀芽孢桿菌與氨基糖苷類耐藥基因[APH(3')-Ia]，單形擬桿菌與β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（CfxA 6），陰溝腸桿菌與耐磷霉素基因（UhpT），副血鏈球菌與大環(huán)內(nèi)脂類耐藥基因（mefA）（P<0.01）；呈顯著負(fù)相關(guān)的為，糞腸球菌與氨基糖苷類耐藥基因[ANT(2'')-Ia]（P<0.01）。見表3。

表3 光療48 h后菌種與耐藥基因豐度相關(guān)性分析

3 討論

黃疸新生兒接受光療是臨床最常用的治療措施。目前認(rèn)為光療是一種安全、有效和經(jīng)濟(jì)的治療手段。隨著對(duì)光療深入的研究，發(fā)現(xiàn)光療可對(duì)患兒造成影響，如光療會(huì)造成新生兒發(fā)熱、腹瀉、皮疹、低鈣血癥及青銅癥等一些短期不良反應(yīng)，但這些不良反應(yīng)會(huì)隨著光療停止而消失。光療導(dǎo)致超低出生體質(zhì)量兒病死率增加，及其潛在的臨床致癌風(fēng)險(xiǎn)等，引發(fā)了對(duì)于光療遠(yuǎn)期不良反應(yīng)的思考[7]。本研究從光療對(duì)于腸道菌群的影響方面進(jìn)行研究，探討光療后腸道菌群以及其耐藥菌的變化，為深入研究光療對(duì)人體造成的影響提供理論依據(jù)。

菌群參與膽紅素的代謝[8-9]，主要通過兩種途徑：一種是直接把排入腸道中的膽紅素轉(zhuǎn)化為膽素原，促進(jìn)膽紅素的排泄；另外一種通過菌群間相互作用或者其代謝產(chǎn)物，改變腸道內(nèi)滲透壓和pH 值，抑制β-葡萄糖醛酸苷酶水解結(jié)合膽紅素，刺激腸道蠕動(dòng)，加速膽紅素的排泄，減輕膽紅素的肝腸循環(huán)[10]。本研究表明光療后腸道的部分菌種會(huì)發(fā)生顯著改變，可能會(huì)影響到膽紅素的代謝。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)比糞便菌群混合液與細(xì)菌提取純化物，在轉(zhuǎn)化膽紅素的效率實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)糞便菌群混合液轉(zhuǎn)化膽紅素效率高，菌群越豐富，對(duì)于黃疸的消退越有利[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃疸新生兒接受不同時(shí)間的光療后，菌群的相似度及多樣性分析均無顯著差異。取樣的時(shí)間段最長是光療后48 h，腸道菌群整體豐度的變化小，有下降的趨勢，這是否會(huì)影響菌群對(duì)于膽紅素的代謝需要進(jìn)一步研究。腸道能將結(jié)合膽紅素轉(zhuǎn)化為糞膽原的菌屬有[12-13]：產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、另支梭菌、脆弱擬桿菌。這些腸道菌群可以通過降低腸道pH值和β-葡萄糖醛酸苷酶活性；參與膽汁酸代謝，調(diào)節(jié)肝腸循環(huán)；增強(qiáng)肝臟的攝取能力等參與膽紅素的排泄，降低血清膽紅素[14]。菌群改變可顯著影響黃疸的消退[15]。從菌種的層面分析，發(fā)現(xiàn)隨著光療時(shí)間的延長，部分腸道菌種相對(duì)豐度顯著增多，如擬桿菌，這種菌種的增加有助于加強(qiáng)膽紅素的轉(zhuǎn)化。光療會(huì)導(dǎo)致兒童后期的過敏性疾病顯著增加，很多過敏性疾病與菌群的紊亂有關(guān)[16-17]。本研究也發(fā)現(xiàn)光療后某些菌株如糞腸球菌、陰溝腸桿菌、巴氏鏈球菌、梭狀芽孢桿菌菌種增加，這些增加的菌種對(duì)于機(jī)體的影響還需要深入探討。菌群的改變影響機(jī)體的功能，菌群攜帶的耐藥基因也會(huì)對(duì)機(jī)體造成顯著影響，本研究還發(fā)現(xiàn)光療影響了部分菌種，同時(shí)也會(huì)影響耐藥基因的變化。

研究發(fā)現(xiàn)，新生兒在光療前就攜帶了大量的耐藥基因，隨著光療的變化，部分耐藥基因的豐度也發(fā)生顯著改變。納入本研究的黃疸新生兒均未用抗生素和益生菌，減少了這些藥物的干擾因素。隨著光療時(shí)間的延長，光療后腸道菌群攜帶的耐藥基因豐度發(fā)生顯著改變，豐度顯著增加的主要耐藥基因?yàn)榘被擒疹惸退幓颍╝adA2），四環(huán)素基因[tet(59)]，外排泵基因（efmA）、喹諾酮類耐藥基因（QnrS2）、碳青霉烯酶基因（OXA-347）、磺胺類耐藥基因（dfrA1）等。其中光療后上升最明顯的是β-內(nèi)酰胺類耐藥基因中CTX-M型，是否增加患兒后期對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，增加抗感染治療難度等不良后果需要進(jìn)一步研究[18]。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素類抗生素耐藥基因，氨基糖苷類耐藥基因，這些耐藥基因在成人中也普遍存在，目前我們攝入的很多食物中也含有這些類型的抗生素[19]，是否與此有關(guān)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。中國人群腸道內(nèi)相比西方人有更多種類的耐藥基因存在，這與抗生素使用種類多和頻率高密切相關(guān)[20]。腸道是人體最大的消化器官，具有復(fù)雜的微生物菌群體系，對(duì)人的營養(yǎng)吸收和生理功能有重要影響。隨著抗生素的濫用，人體腸道產(chǎn)生了很多不同種類的耐藥菌以及耐藥基因，這些耐藥菌不僅包括正常在腸道內(nèi)定植的共生菌，也包括一些致病菌，特別是多重耐藥致病菌，給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)[21]。新生兒糞便中大量存在耐藥菌和耐藥基因[22]，即使未使用抗生素，也能在糞便中檢測到多種類的耐藥菌，這與本研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)光療后部分耐藥基因豐度會(huì)增多，原因可能與菌種的變化有關(guān)，但也不排除是因?yàn)楣獐熤苯釉斐傻膿p傷有關(guān)[23-24]。

臨床使用光療以降低因膽紅素升高造成的腦損傷風(fēng)險(xiǎn)，是目前針對(duì)黃疸的一個(gè)非常重要的常規(guī)治療手段。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)了部分不良反應(yīng)[25]，其中很多原因不明。本研究發(fā)現(xiàn)光療對(duì)于機(jī)體腸道的的部分菌種影響很大，部分菌種和耐藥基因豐度顯著增多，可能會(huì)導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)被破壞，提示任何一項(xiàng)治療都可能會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)出現(xiàn)，需要從不同層面深入了解其出現(xiàn)的原因，以助于更好實(shí)施臨床治療。

本研究是臨床研究對(duì)象自身對(duì)照，存在以下局限性：黃疸新生兒腸道菌群是光療治療前后的自身對(duì)照，沒有同期的未光療新生兒對(duì)照；沒有把腸道菌群隨著日齡變化而變化的因素考慮進(jìn)來；檢測到耐藥基因，不代表臨床耐藥，而且目前研究不能區(qū)分具體哪一種菌落攜帶哪一種具體的耐藥基因，這需要體外培養(yǎng)等其他實(shí)驗(yàn)方法，本次研究沒有涉及，需要后期的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。