微生物法測(cè)定功能性飲料中維生素B12含量研究

晏 濤， 劉 萍， 酈 娟， 陳 瓊， 陳 哲， 鄭 楠， 曾慧君*

(1.武漢食品化妝品檢驗(yàn)所, 武漢 430040；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食用油質(zhì)量與安全), 武漢 430040；3.武漢職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 武漢 430072)

維生素B12作為一種常見(jiàn)的食品添加劑，主要用于保健食品、谷物、飲料、乳品及孕嬰食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[1-3].隨著現(xiàn)代生活水平的提高和全民保健意識(shí)的加強(qiáng)，人們更多地希望從日常飲食中補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)元素，因此許多種類(lèi)的功能性維生素飲料應(yīng)運(yùn)而生.

維生素B12的檢測(cè)至今是國(guó)際食品分析的難題之一，主要是由于維生素B12的結(jié)構(gòu)形式多樣，至少有5種相似結(jié)構(gòu)包括氰鈷胺、甲鈷胺、腺苷鈷胺、羥鈷胺等，且不同鈷胺素對(duì)維生素B12的缺陷菌——ATCC 7830敏感性不同[4-6].化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)維生素B12存在檢測(cè)限低，容易受到基質(zhì)中金屬離子干擾等問(wèn)題[7-8].液相色譜法測(cè)定維生素B12存在靈敏度相對(duì)較差、特異性不高，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中維生素B12的測(cè)定存在很多困難等缺陷[9-10].因此美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)標(biāo)準(zhǔn)和中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.14—2010都將微生物法作為檢測(cè)維生素B12的首選方法和仲裁法[11-13].

目前許多市售功能性飲料企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中維生素B12的檢測(cè)方法均指向GB 5413.14—2010(以下簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)標(biāo)法)，而國(guó)標(biāo)法中明確規(guī)定該標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法只適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定[14].本研究旨在建立一種快速準(zhǔn)確測(cè)定功能性飲料中維生素B12含量的方法，從而確保市售功能性飲料添加量符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求，避免消費(fèi)者因?yàn)轱嬘貌缓细耧嬃峡赡芤鸬纳眢w損傷.

本研究以功能性飲料為研究對(duì)象，參考國(guó)標(biāo)法，對(duì)樣品前處理進(jìn)行了優(yōu)化改良，極大縮減了檢驗(yàn)時(shí)間，并準(zhǔn)確測(cè)定出功能性飲料中維生素B12的含量.本研究為功能性飲料中維生素B12的準(zhǔn)確測(cè)定提供方法依據(jù)，為監(jiān)管部門(mén)對(duì)功能性飲料中B12的監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐.

1材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

材料：5種不同標(biāo)示值市售功能性維生素飲料均購(gòu)于武漢市內(nèi)零售超市，為避免廣告嫌疑，編號(hào)1～5，詳細(xì)信息見(jiàn)表1.

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

菌種：萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)ATCC 7830(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心).

試劑：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基和維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基(美國(guó) BD 公司)；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品(99.2%，美國(guó)Sigma-aldrich公司)；無(wú)水磷酸氫二鈉、無(wú)水偏重亞硫酸鈉、一水合檸檬酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)).

1.2儀器和設(shè)備

測(cè)定過(guò)程中用到的儀器設(shè)備如下：電子天平(ME204/02，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(LBI-300，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(SX-700，日本TOMY數(shù)字生物有限公司)；渦旋振蕩器(vortex-genie2，美國(guó)SI儀器公司)；離心機(jī)(H1850R，湖南湘儀儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-2700，島津公司)；超凈工作臺(tái)(BSC-1600ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(iMark，美國(guó)BIO RAD公司).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品稱(chēng)(量)取、處理和稀釋 第一組(國(guó)標(biāo)處理組)，取適量試樣，轉(zhuǎn)入250 mL錐形瓶中，加入10 mL緩沖液(每100 mL含無(wú)水磷酸氫二鈉1.3 g、無(wú)水偏重亞硫酸鈉1.0 g、一水合檸檬酸1.2 g)，加入少量水，121 ℃水解10 min，冷卻.用鹽酸(0.1 mol·L-1)調(diào)pH至4.5±0.2，轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中用水定容.過(guò)濾，吸取適當(dāng)體積上述液體，加入適量水，用氫氧化鈉(0.1 mol·L-1)調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶用水定容至刻度(使稀釋液中維生素B12濃度在0.01 ng·mL-1～0.02 ng·mL-1范圍內(nèi)).第二組(改良國(guó)標(biāo)處理組)，取適量試樣，加入10 mL緩沖液，充分混勻加熱煮沸10 min后調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容至刻度.每種飲料做6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性.

1.3.2實(shí)驗(yàn)用菌懸液的制備 將凍干保存的萊士曼氏乳桿菌轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，連續(xù)傳種2～3次以活化菌株.將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，離心棄上清用生理鹽水稀釋反復(fù)洗滌3次以去掉乳酸桿菌培養(yǎng)基，然后用紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液濃度.使其透光率在70%左右.

1.3.3維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱(chēng)取10.0 mg維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，加25%乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.準(zhǔn)確吸取上述溶液5.0 mL維生素B12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)中間液.準(zhǔn)確吸取5.0 mL維生素B12標(biāo)準(zhǔn)中間液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液.臨用前分別吸取兩個(gè)5.0 mL維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作溶液到250 mL和500 mL容量瓶中，用水定容至刻度備用.

按表2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系，每根標(biāo)準(zhǔn)系列管制作了3個(gè)重復(fù).

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作Tab.2 Preparation of the standard curve

1.3.4樣品待測(cè)液的制備 取4支試管分別加入1.00 mL、2.00 mL 、3.00 mL、4.00 mL試樣提取液，補(bǔ)水至5.00 mL，加入5.00 mL維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻，一式三份.

1.3.5接種培養(yǎng) 將所有測(cè)定管封閉，于121 ℃高壓滅菌5 min后迅速冷卻，在無(wú)菌操作條件下向每支試管滴加1.3.2中接種液50 μL，蓋好塞子置于36±1 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19～20 h，直到達(dá)到最大渾濁度，其中S1管不加菌液做空白對(duì)照.

1.3.6吸光度測(cè)定 在550 nm處，使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)UV-2700以未接種的S1對(duì)照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，讀出S2管的數(shù)值.再以S2管為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0，依次讀出其他每支試管的吸光度.

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析

以標(biāo)準(zhǔn)系列管中維生素B12含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).紫外分光光度計(jì)測(cè)得維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=5.5976x+0.0357，相關(guān)系數(shù)R2為0.993 8，在0～0.1 ng范圍內(nèi)，吸光度值與維生素B12含量之間的線(xiàn)性關(guān)系良好.

2.2樣品檢測(cè)結(jié)果分析

2.2.1樣品前處理優(yōu)化及精密度結(jié)果 根據(jù)1.3.1中測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和測(cè)得的樣品試管的吸光度值計(jì)算所測(cè)5種不同標(biāo)示值的功能性維生素飲料中的維生素B12含量，結(jié)果如表3所示.

圖1 維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of vitamin B12

表3 微生物法測(cè)得功能性飲料中維生素B12結(jié)果Tab.3 Results of vitamin B12 in functional beverage by microbiological method

由表3可知，5種功能性維生素飲料6次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2～0.5之間，RSD在1.55%～3.68%之間，說(shuō)明各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之間的檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性較好.對(duì)比5種功能性維生素飲料的實(shí)際測(cè)定值和標(biāo)簽值發(fā)現(xiàn)，5種功能性維生素飲料的維生素B12檢測(cè)含量均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求.第一組和第二組的測(cè)定結(jié)果用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異不顯著(p值大于0.05)，提示改良優(yōu)化的樣品前處理方法即改良國(guó)標(biāo)處理法，也能準(zhǔn)確測(cè)定出功能性飲料中B12的含量，可作為微生物法的首選樣品處理方式.

2.2.2質(zhì)量控制檢測(cè)結(jié)果

1) 試劑盒法檢測(cè)結(jié)果.使用德國(guó)拜發(fā)商品化試劑盒測(cè)定了5種功能性維生素飲料的維生素B12含量，結(jié)果如表4，將該結(jié)果與微生物法的測(cè)定結(jié)果用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值大于0.05).

表4 試劑盒法測(cè)得功能性飲料中維生素B12結(jié)果Tab.4 Results of vitamin B12 in functional beverage by kit method

2) 加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果.為確保微生物法測(cè)定功能性飲料中維生素B12含量的準(zhǔn)確性和結(jié)果的有效性，對(duì)試樣3進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，取1 mL試樣3進(jìn)行試驗(yàn)，其本底值為11.4 ng，進(jìn)行三個(gè)梯度加標(biāo)試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為5.0、10.0、20.0 ng，使用上述改良國(guó)標(biāo)處理組的方法進(jìn)行試樣處理，做3次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)平均值計(jì)算回收率，回收率(%)=(實(shí)測(cè)值-本底值)/加標(biāo)量×100.結(jié)果如表5，平均回收率在92%～104%，符合要求.

表5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Rate of standard recovery

2.3方法比較

雖然微生物法(國(guó)標(biāo)法及改良國(guó)標(biāo)法)與試劑盒法在檢測(cè)功能性飲料中維生素B12的含量無(wú)顯著差異，但這三種方法有其各自特點(diǎn)，見(jiàn)表6.

表6 三種檢測(cè)方法的比較Tab.6 Comparison of three methods

試劑盒法不需要準(zhǔn)備菌懸液，可適用于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)菌株無(wú)法制備菌懸液的實(shí)驗(yàn)室，但試劑盒法價(jià)格昂貴，且是非標(biāo)方法，不利于在檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)推廣.國(guó)標(biāo)法一直是維生素B12檢測(cè)的指定方法，我們建立的改良國(guó)標(biāo)法為功能性飲料中維生素B12含量檢測(cè)的微生物方法標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了技術(shù)參考.

3討論

國(guó)標(biāo)GB 5413.14—2010適用范圍為嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定，而諸多功能性飲料生產(chǎn)企業(yè)都在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中將其作為維生素B12的指定檢測(cè)方法，探討國(guó)標(biāo)法對(duì)功能性飲料中B12的檢測(cè)顯得尤為重要.國(guó)標(biāo)法樣品前處理針對(duì)的是嬰幼兒食品和乳品，食品基底是固體物質(zhì)且含有大量蛋白質(zhì)，需要變性和過(guò)濾過(guò)程去除，而維生素功能性飲料是液體基底且不含蛋白質(zhì)成分.基于此，本研究對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行了改良優(yōu)化，在樣品前處理中直接加入含有偏重亞硫酸鈉的緩沖液經(jīng)加熱煮沸將功能性飲料中不穩(wěn)定形式的鈷胺素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定狀態(tài)的亞硫酸合鈷胺素[15]，冷卻后直接調(diào)pH定容進(jìn)行檢測(cè)，省去了國(guó)標(biāo)法中繁瑣的變性、過(guò)濾等步驟，并將樣品處理過(guò)程中的2次調(diào)節(jié)pH直接縮減為1次，操作更為便捷，將單個(gè)樣品處理時(shí)間直接由原來(lái)的2 h縮短至0.5 h.此外，與試劑盒法相比，本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)成本更低，試劑盒法單個(gè)樣品的成本在500元左右，本實(shí)驗(yàn)方法單個(gè)樣品的檢測(cè)成本在220元左右，且試劑盒法不是主流的維生素B12檢測(cè)技術(shù)，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)和中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均將微生物法作為首先方法和仲裁法，試劑盒法為非標(biāo)方法只能作為輔助檢測(cè)方法.本實(shí)驗(yàn)使用微生物法準(zhǔn)確測(cè)定出功能性飲料中維生素B12的含量，測(cè)定結(jié)果靈敏性好、準(zhǔn)確度高，為功能性飲料中維生素B12的檢測(cè)提供了可靠方法，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)指導(dǎo).

綜上，本研究有效建立了一種基于國(guó)標(biāo)改良法的功能性飲料中維生素B12含量的微生物檢測(cè)方法，且相較于國(guó)標(biāo)法具有檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，相較于試劑盒法具有檢測(cè)成本低廉的優(yōu)勢(shì).由于微生物法的方法優(yōu)勢(shì)，已有研究組將微生物法應(yīng)用于發(fā)酵食品中維生素B12的測(cè)定[16-17]，隨著實(shí)驗(yàn)方法的不斷優(yōu)化和創(chuàng)新，微生物法將被應(yīng)用到更多食品中維生素B12的測(cè)定.