古代常用顏料的微生物生長差異性研究

王麗琴，郭金沂，馬彥妮，趙 星

(西北大學 文化遺產(chǎn)學院，陜西 西安 710127)

我國擁有大量珍貴的彩繪文物，如秦始皇兵馬俑彩繪陶器、敦煌壁畫等，它們擁有重要的文化、藝術和科學價值。然而，微生物的生長會引起彩繪變色、褪色，彩繪層脫落等病害[1-2]。影響微生物病害的主要因素有外界環(huán)境、自身材質(zhì)等。環(huán)境濕度對微生物生長影響遠大于溫度[3]，真菌很少能在<55% RH下存活，>75% RH真菌將生長繁殖[4]。從文物材質(zhì)來看，彩繪層主要由顏料和膠料組成，不同顏料因其組成成分、理化性質(zhì)和生產(chǎn)工藝不同，一定程度上對微生物生長起著抑制作用，使微生物生長存在差異性。

從20世紀90年代起，敦煌壁畫紅色顏料的變色現(xiàn)象引起了人們關注，實驗結果表明，土紅、鉛丹、朱砂顏料上微生物生長程度和變色程度不同，變色最嚴重的是鉛丹[5]。近年課題組發(fā)現(xiàn)大足石刻臥佛表面紅、藍、白、綠色顏料中，藍色顏料群青極易滋生微生物，而綠色顏料氯砷鈉銅石和白色顏料砷鉛礦表面幾乎不長霉[6]。ALI研究發(fā)現(xiàn)埃及藍、朱砂、雌黃和金箔在接種黑曲霉、青霉和芽孢桿菌后，除雌黃外其他顏料均出現(xiàn)明顯變色[7]。即使顏料濃度很高、營養(yǎng)條件較差，真菌和細菌仍具有繁殖能力，特別是黑曲霉對顏料的變色影響十分嚴重[8]。但以往的研究中，顏料種類較少，且多采用在混合有特定顏料的培養(yǎng)基中添加提純的真菌或細菌的方法進行模擬實驗，忽略了顏料-膠料體系與傳統(tǒng)生物學培養(yǎng)基的差異和濕度環(huán)境因素的影響，無法觀察多種微生物共存時不同彩繪微生物生長的差異性。因此，本文擴大顏料種類至石青、石綠等10種古代常見顏料，以常用膠料明膠制成顏料體系，在>75% RH的高濕環(huán)境下進行微生物培養(yǎng)，鑒定優(yōu)勢菌種，探討微生物生長的差異性，該研究對彩繪文物濕度環(huán)境選擇和微生物防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Tsingke DNA提取試劑盒(西安擎科生物有限公司)；PDA馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基(南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司)。實驗選擇 Φ90 mm一次性無菌培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制好后，在37℃真空中培養(yǎng)48 h，確定無污染后方可采樣。明膠、土紅、赭石(北京金源陽光礦物顏料公司)；群青、石青、石綠(北京金碧齋顏料廠)；朱砂、雄黃、雌黃、鉛丹、鉛白(蘇州姜思序堂顏料公司)；密封箱；載玻片。

1.2 儀器

LEICA S8 APO體視顯微鏡(德國徠卡公司)；恒溫恒濕箱(廣東宏展科技有限公司)；VEGA 3XM鎢燈絲型掃描電鏡(捷克泰思肯公司)。

1.3 實驗樣品制備及微生物培養(yǎng)方法

實驗樣品制備方法如下：分別取相同體積的3號粒徑的10種顏料于研缽中，邊滴加3%明膠水溶液邊研磨，研細后涂刷在載玻片上，每種顏料刷涂12片(每組平行樣3個)作為實驗樣品。將上述樣品置于西安大氣環(huán)境中，放置3 d后轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕箱中，調(diào)節(jié)溫度30℃、相對濕度分別為75% RH、84% RH、93% RH和100% RH進行微生物培養(yǎng)。

1.4 微生物生長表征方法

在微生物培養(yǎng)過程中，每隔一段時間用體視顯微鏡觀察實驗樣品表面，并拍照記錄微生物開始生長的時間。培養(yǎng)30 d或70 d時，觀察記錄樣品表面微生物生長的面積，根據(jù)國標GBT24128-2009確定實驗樣品的微生物生長等級。

1.5 微生物種屬鑒別方法

1.5.1 SEM分析 實驗使用VEGA 3XM鎢燈絲型掃描電鏡，保持實驗電壓為15 kV，分析電壓為20 kV，工作距離為20 mm，將生長微生物的實驗樣品固定于導電膠上，觀察并研究菌體的微觀形貌特征，初步判斷微生物類別。

1.5.2 微生物的分離與純化 在無菌操作臺中，使用接種環(huán)挑取實驗樣品上肉眼可見的菌落，接種在空白培養(yǎng)皿上，經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)48 h后挑出微生物菌落于NA平板上用劃線法純化。

1.5.3 微生物基因組總DNA提取及目標片段擴增 使用DNA提取試劑盒對上述分離提純后的微生物進行基因組總DNA提取。以總DNA為擴增模板，細菌選擇通用引物27F和1492R、真菌選擇通用引物ITS1和ITS4進行鏈式聚合酶反應(PCR)擴增。擴增條件：98℃預變性2 min，98℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，完成35個擴增循環(huán)，72℃終延伸5 min。

1.5.4 電泳檢測 將擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)，300 V電 壓下12 min以獲取鑒定膠圖，并將其送至擎科生物有限公司測序。

1.5.5 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 將拼接序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，下載最相似的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。通過軟件ClustalX 2.1進行多序列聯(lián)配，使用Jukes & Cantor法計算進化距離，用鄰位相連法分析后通過軟件MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrap法對樹進行分析[9]。

2 結果與討論

2.1 微生物生長模擬實驗分析與定級

根據(jù)國標GBT24128-2009， 微生物生長分為5個等級(見表1)。 由模擬實驗結果可得到10種顏料上微生物生長達到1級的時間(見表2)和70 d達到的等級(見圖1)?？梢园l(fā)現(xiàn)：

圖1 10種顏料上微生物生長70 d達到的等級Fig.1 The grades reached by the microbial growth of 10 kinds of pigments for 70 days

表1 微生物生長等級評價方法Tab.1 Evaluation method of microbial growth grades

表2 10種顏料上微生物生長達到1級所需時間Tab.2 Time of the microbial growth to reach level 1 on 10 kinds of pigments

1)各種顏料上微生物生長存在明顯的差異性。相同濕度下，在30 C°培養(yǎng)30 d時，顏料上出現(xiàn)微生物的順序依次為群青、朱砂、赭石/土紅、石青/石綠和鉛白，而雌黃、雄黃、鉛丹上沒有觀察到微生物痕跡，微生物生長面積為群青>朱砂≈赭石≈土紅>石青≈石綠>鉛白>雌黃>雄黃>鉛丹(僅93% RH條件下朱砂上微生物生長面積略大，其他3組濕度條件，朱砂、赭石和土紅微生物生長面積基本相同)；延長培養(yǎng)時間至70 d，雌黃和雄黃上微生物生長等級分別達到2級和1級，鉛丹仍為0級。綜上所述，各種顏料上微生物生長順序為群青>朱砂>赭石≈土紅>石青≈石綠>鉛白>雌黃>雄黃>鉛丹。換句話說，顏料對微生物的抑制作用(毒性)順序與此相反。

2)相對濕度對微生物生長的影響。75%RH環(huán)境培養(yǎng)30 d，只有群青樣品上微生物生長達到2級，肉眼可觀察到明顯的微生物菌落；84% RH和93% RH環(huán)境中，在朱砂、土紅、赭石樣品上也可觀察到明顯的微生物菌落；100% RH環(huán)境中，石綠、石青樣品上微生物生長等級達到2級。同時，群青樣品上微生物重度生長，幾乎完全覆蓋顏料層。因此，相對濕度越大，微生物越易生長。

2.2 微生物種屬鑒別

2.2.1 SEM分析 通過對彩繪樣品進行SEM分析，初步判定大量存在、且具有微生物特征的結構有4種(見圖2)，其中圖2A和圖2B結構廣泛存在于群青、朱砂、土紅、赭石、石青和石綠樣品中。圖2A可觀察到網(wǎng)狀的菌絲結構，其直徑為2～3 μm，與霉菌直徑接近，遠大于放線菌菌絲(直徑0.2～1.2 μm)，推測是霉菌。同時，由圖2A還觀察到直徑為4～5 μm的鏈狀卵圓形孢子，推測可能是青霉或曲霉的分生孢子[10-11]；圖2B中亦出現(xiàn)大量鏈狀卵圓形孢子，但直徑僅為1～3 μm，推測為枝孢霉分生孢子[12]。由此，群青、朱砂、土紅、赭石、石青和石綠樣品中有大量霉菌生長，且霉菌可能為曲霉、青霉和枝孢霉等。鉛白、雌黃和雄黃樣品中，除出現(xiàn)少量上述圖2A和圖2B的結構外，還有圖2C所示直徑0.5～5 μm橢圓狀和桿狀結構，應為原核微生物，推測可能是桿菌。

A、B 為群青樣品; C 為鉛白樣品圖2 彩繪樣品上微生物的SEM照片(×1000)Fig.2 SEM photos of microorganisms in the polychromy samples(×1000)

2.2.2 微生物種屬鑒別 將測序所得的18S rRNA和16S rRNA基因序列，通過NCBI網(wǎng)站提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析對比，以鑒定微生物種屬，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3、圖4，分析結果見表3。

表3 彩繪樣品微生物序列對比分析結果Tab.3 Comparative analysis results of microbial sequence of the polychromy samples

圖3 彩繪樣品基于 18S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the polychromy samples based on 18S rRNA gene sequence

圖4 彩繪樣品基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the polychromy samples based on 16S rRNA gene sequence

結合顯微觀察和分子生物學測序分析結果，鑒定出群青、朱砂、土紅、赭石、石青和石綠樣品上主要微生物為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)和枝孢霉(Cladosporiumsp.)，鉛白、雌黃、雄黃樣品上除以上3種真菌外，還有霍馬氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)。

結合以上SEM分析和微生物種屬鑒別實驗發(fā)現(xiàn)，群青、朱砂、土紅、赭石、石青和石綠等毒性較小的顏料，其上大面積生長的微生物是青霉屬、曲霉屬和枝孢霉等真菌，菌絲生長茂盛且殖入彩繪層。但腸桿菌無菌絲，菌落面積小于真菌，其競爭力遠低于真菌，無法獲取到足夠的生存空間，難以生長出肉眼可見的菌落。鉛白、雌黃、雄黃毒性強的重金屬顏料，對微生物代謝活動的抑制作用大，真菌難以大面積生長，為腸桿菌的生存留出了足夠空間。且真菌代謝產(chǎn)生的檸檬酸鹽還是霍馬氏腸桿菌的碳源和能源。因此，霍馬氏腸桿菌可以在真菌難以大量生長的鉛砷顏料樣品上生長出肉眼可見的菌落。

本模擬實驗中檢測到的青霉屬、曲霉屬和枝孢霉屬是破壞彩繪文物的主要真菌，3個菌屬對應的產(chǎn)黃青霉、雜色曲霉和枝孢霉菌是彩繪文物上的優(yōu)勢菌種，在世界多處文化遺產(chǎn)中常有發(fā)現(xiàn)。對于露天彩繪文物，LIIES發(fā)現(xiàn)羅馬尼亞的一座木質(zhì)教堂繪畫受到青霉和曲霉的嚴重破壞[13]；Lutsenko檢測到圣·索菲亞大教堂中世紀壁畫上主要的真菌是青霉，其中優(yōu)勢菌種為產(chǎn)黃青霉[14]。日本高松冢古墳微生物病害嚴重，雖然進行過多次防治，但微生物優(yōu)勢類群不斷變遷，直至當今青霉、曲霉和枝孢霉仍作為優(yōu)勢類群出現(xiàn)。因此，這個曾一度是原址保護的國際典范，正是由于逐漸失控的微生物病害導致古墳解體搬遷至異地保護[15]。國內(nèi)敦煌莫高窟壁畫表面普遍存在著枝孢霉[16]；西安韓休墓壁畫檢測出青霉和曲霉[17]；太原、酒泉和嘉峪關墓室壁畫都存在枝孢霉、曲霉和青霉，且占據(jù)優(yōu)勢地位[18]。對于館藏彩繪文物，葡萄牙Machado de Castro國際博物館繪畫和彩繪雕塑作品上發(fā)現(xiàn)了曲霉和青霉屬微生物的生長，其中雜色曲霉是優(yōu)勢菌種。同時，在博物館空氣環(huán)境中[19]，青霉屬、曲霉屬和枝孢霉屬是最常見的真菌。考古發(fā)掘現(xiàn)場遺址微生物繁殖嚴重，較高的溫度、濕度以及較低的空氣交換速率是造成微生物大面積污染的主要環(huán)境因素[20]。

鉛白、雌黃和雄黃樣品上還發(fā)現(xiàn)了原核微生物霍馬氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei)，該菌種在文物上比較少見，在葡萄牙Escoural洞窟中被發(fā)現(xiàn)[21]。但該菌種隸屬的腸桿菌屬較為常見，在莫高窟壁畫表面白色污染物中腸桿菌屬是主要的細菌類群之一[22]。

2.3 微生物生長差異性的影響因素及機制

各種顏料上微生物生長存在差異性的主要影響因素有顏料的化學組成、理化性質(zhì)、生產(chǎn)工藝以及微生物種類等。

1)群青，為復雜的鋁鈉的硫硅酸鹽。色相不同，化學組成亦不同，如深色群青為Na8Al6Si6O24S4，群青具有良好的親水性，高濕環(huán)境吸收的水分為微生物生長提供有利條件。群青耐酸性差，微生物代謝產(chǎn)生的有機酸會進一步破壞其結構。同時，Si、Al、O、Na等土壤常見元素，對微生物活性幾乎沒有抑制作用，大部分空氣微生物能無阻礙地迅速生長。因此，在所研究的10種顏料中，群青顏料上微生物生長最茂盛，這是大足石刻臥佛上群青顏料微生物滋生最嚴重的原因[7]。

2)朱砂，本實驗發(fā)現(xiàn)朱砂(HgS)對微生物生長的影響較小。汞化物的毒性中，有機汞>汞>無機汞，有機汞可以直接被有機汞裂解酶分解為細胞吸收，有劇毒[23]；汞單質(zhì)和無機汞需要進行甲基化/乙基化等有機化反應后才能被細胞吸收毒害微生物。朱砂為無機汞，難溶于水游離出Hg2+，毒性較小。

朱砂對微生物的破壞主要是Hg2+在細胞內(nèi)積累產(chǎn)生毒性。研究表明，青霉和曲霉能吸收轉(zhuǎn)化Hg2+，尤其是雜色曲霉[24-25]。雜色曲霉上汞的吸附主要是胞外積累，氨基、羧基和羥基的絡合作用使其定位于細胞壁上，從而隔絕汞進入胞內(nèi)，雜色曲霉胞外積累的特性使其幾乎無損地吸收Hg2+。因此，朱砂對微生物的毒性與Hosfall提出的金屬陽離子毒性排序中Hg2+的強毒性有較大差異[23]。

3)土紅、赭石、石青、石綠，土紅和赭石富含氧化鐵，石青和石綠含碳酸銅。Cu2+是重金屬離子，其毒性大于Fe3+。因此，土紅和赭石上微生物生長速度和面積要大于石青和石綠。

4)雌黃、雄黃、鉛丹、鉛白，雄黃(As2S2)和雌黃(As2S3)為砷的硫化物，鉛丹和鉛白為含鉛的氧化物和碳酸鹽。砷和鉛為重金屬，顏料毒性強，會嚴重抑制微生物生長，這與大足石刻臥佛上含砷、鉛的綠色和白色顏料表面幾乎不長霉相吻合。然而，含砷、鉛顏料對微生物生長的抑制作用存在差異。這種差異除與顏料化學組成有關外，還與顏料生產(chǎn)工藝、微生物種類等因素有關。

據(jù)現(xiàn)有研究，雄黃含有一定量砒霜，其毒性強于雌黃，因而微生物在雄黃上比雌黃上更難以生長[26]。鉛白的原礦是白鉛礦，常與磷氯鉛礦共生，共生礦導致鉛白對微生物的毒性降低。相比而言，鉛丹多為人工合成，純度高、雜質(zhì)少，毒性強于鉛白。鄧新輝研究表明，產(chǎn)黃青霉菌代謝產(chǎn)生的草酸和檸檬酸等有機酸能促進鉛白轉(zhuǎn)換成殘渣態(tài)鉛,間接削弱其毒性[27]。因此，鉛白上微生物生長速度快于雌黃、雄黃和鉛丹等其他砷、鉛重金屬顏料。

微生物在顏料上的生長與環(huán)境、樣品制作工藝等多種因素有關，即便是同一種顏料，這些因素的不同也會導致顏料上徽生物生長有所差異。本研究的10種顏料中，鉛丹對微生物的抑制作用最強，微生物最難生長。古人將防蠹紙裝潢在書籍的扉頁或封底以保護書籍不受蟲蝕?，F(xiàn)收藏于國家博物館的《夢溪筆談》(明代崇禎4年，1631年)和《羊城古鈔》(清代嘉慶11年，1806年)2本書都襯有這種“萬年紅紙”，至今仍完好無損，而沒有萬年紅紙之處，卻遭到蠹蛀。

3 結語

10種古代常見顏料上微生物生長存在差異性，微生物生長順序依次為群青>朱砂>赭石≈土紅>石青≈石綠>鉛白>雌黃>雄黃>鉛丹。 在75%～100% RH范圍，濕度越高，微生物生長越快，對顏料的侵蝕越嚴重。高濕環(huán)境中彩繪文物上滋生的主要微生物菌屬有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、枝孢菌屬(Cladosporium)和腸桿菌(Enterobacter)。建議在含群青顏料的彩繪文物上，特別應控制環(huán)境濕度，以減少微生物的生長；而雄黃、鉛丹等含砷、鉛顏料毒性強，可適度放寬濕度范圍。應根據(jù)彩繪文物顏料的種類，針對性地控制環(huán)境濕度，并采取有效的治理措施。