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    基于納米金/石墨烯修飾電極的免疫傳感器檢測(cè)噻蟲啉

    2022-06-09 07:47:12趙國(guó)政張晉華
    關(guān)鍵詞:噻蟲啉孵育石墨

    姚 軍,毛 慧,張 芹,趙國(guó)政,張晉華

    (1.南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院,江蘇 南京 210094;2.泰州市生態(tài)環(huán)境局,江蘇 泰州 225300;3.江蘇省泰州環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,江蘇 泰州 225300;4.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023;5.山西師范大學(xué) 磁性分子與磁信息材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 臨汾 041004)

    噻蟲啉(Thiacloprid)是在吡蟲啉基礎(chǔ)上,Bayer公司開發(fā)的具有廣譜、內(nèi)吸性新型煙堿類殺蟲劑[1,2]。噻蟲啉是目前優(yōu)良的殺蟲劑品種之一,其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示,在我國(guó)應(yīng)用廣泛,前景良好[3,4]。近年來,農(nóng)藥管理監(jiān)督力度不夠,農(nóng)藥過度濫用,導(dǎo)致所種植的農(nóng)作物藥害,環(huán)境被嚴(yán)重污染,食品中毒事件頻發(fā)[5-7]。因此,尋找快速準(zhǔn)確的噻蟲啉檢測(cè)技術(shù)是人們的迫切希望,研究意義重大[8,9]。

    圖1 噻蟲啉的分子結(jié)構(gòu)

    目前用于噻蟲啉殘留檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法[11]和固相萃取-高效液相色譜法[12]。但這些檢測(cè)方法對(duì)儀器的操作性要求較高,需要一定的專業(yè)技術(shù)背景,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。以抗原/抗體作為生物識(shí)別物質(zhì)的納米電化學(xué)免疫傳感器,具有很好的選擇性、較多的種類、較低的測(cè)試費(fèi)用和適合聯(lián)機(jī)化的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)不受樣品顏色、濁度的影響,以及所需儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單,具有簡(jiǎn)便、快速、體積小的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域。目前,石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)性能受到廣泛關(guān)注[13,14],石墨烯復(fù)合物研究引起了新的熱潮[15-17],由納米金修飾石墨烯的復(fù)合材料便是其中之一[18]。Yang等[19]利用納米金-石墨烯復(fù)合材料,檢測(cè)一種模型農(nóng)藥對(duì)氧磷,表現(xiàn)出較高的靈敏度、較低檢出限和較好穩(wěn)定性。Han等[20]利用納米金-石墨烯復(fù)合材料檢測(cè)癌胚抗原,線性范圍0.01~80 ng·mL-1,最低檢測(cè)限達(dá)到3.4 pg·mL-1。

    本文建構(gòu)了納米金/石墨烯復(fù)合納米材料修飾電極的免疫傳感器,基于循環(huán)伏安法(Cyclic voltammetry,CV)表征了電極表面的電化學(xué)性質(zhì),通過間接競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)現(xiàn)了體系中噻蟲啉的高靈敏檢測(cè),并對(duì)香蕉、西紅柿、蘋果和大米實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    CHI852C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);噻蟲啉(Sigma-Aldrich公司);殼聚糖(Sigma-Aldrich公司);噻蟲啉抗體(南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院);牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA,南京生興生物技術(shù)有限公司);磷酸緩沖溶液(Phosphate buffer solution,PBS,ThermoFisher公司)。試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

    1.2 免疫傳感器的制備

    噻蟲啉溶液的制備:準(zhǔn)確稱取0.05 g噻蟲啉,溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)中,配得0.5 mg·mL-1噻蟲啉溶液。蒸餾水對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)液稀釋,得到0.2 mg·mL-1噻蟲啉溶液。

    石墨烯分散液的制備:準(zhǔn)確稱取0.05 g石墨烯[21],溶于2 mL蒸餾水,超聲分散得石墨烯分散液。

    玻碳電極(Glassy carbon electrode,GCE)的處理:將電極依次在直徑為0.3μm和0.05μm的Al2O3拋光粉上打磨,分別在無水乙醇-蒸餾水、蒸餾水中各超聲清洗5 min,蒸餾水沖洗,在2 mM K3Fe(CN)6中掃CV圖,以電勢(shì)差在100 mV以內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn),衡量電極是否打磨完好。將打磨好的電極放在室溫下,晾干。

    通過電化學(xué)沉積將納米金修飾在玻碳電極上,再將4μL石墨烯分散液滴涂于電極上,最后將2μL濃度為0.2 mg·mL-1的噻蟲啉溶液滴涂于電極表面,40℃烘干。修飾過的電極浸泡在5%的BSA溶液中,37℃烘箱中孵育30 min,以封閉剩余的活性位點(diǎn)。

    1.3 香蕉/西紅柿/蘋果樣品的前處理

    稱取2±0.005 0 g香蕉/西紅柿/蘋果于10 mL樣品管中,加入噻蟲啉溶液和3 mL乙腈,超聲30 min,離心10 min(2 000 r·m-1),將上清液轉(zhuǎn)移至樣品管,50℃氮?dú)獯蹈桑瑢? mL pH=7.4的PBS加入樣品管,溶解濃縮物。

    1.4 大米樣品的前處理

    稱取1±0.005 0 g大米于10 mL樣品管,加入噻蟲啉溶液,2 mL蒸餾水浸泡15 min,再加入2 mL乙腈,超聲30min,離心10min(2 000 r·m-1),將上清液轉(zhuǎn)移至樣品管,50℃氮?dú)獯蹈桑? mL pH=7.4的PBS加入樣品管,溶解濃縮物。

    1.5 電化學(xué)檢測(cè)

    工作電極、參比電極與輔助電極分別為納米金/石墨烯/噻蟲啉修飾的玻碳電極、Ag/AgCl電極與鉑絲電極,通過CV研究不同修飾電極的電化學(xué)行為,運(yùn)用差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)對(duì)殺蟲劑噻蟲啉進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 免疫傳感器檢測(cè)噻蟲啉的原理

    納米金/石墨烯修飾電極的免疫傳感器檢測(cè)噻蟲啉的原理如圖2所示。(1)納米金/石墨烯/噻蟲啉電極浸入噻蟲啉抗體和游離噻蟲啉的孵育液時(shí),固定在電極上的噻蟲啉、溶液中游離的噻蟲啉分別競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合噻蟲啉抗體;(2)噻蟲啉和噻蟲啉抗體之間存在特定的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),從而使抗體在電極上發(fā)生吸附;(3)所形成的抗體-抗原復(fù)合物致使電極產(chǎn)生位阻,降低峰值電流?;陔娀瘜W(xué)信號(hào)的差異,實(shí)現(xiàn)噻蟲啉的定量檢測(cè)。

    2.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

    孵育時(shí)間的優(yōu)化由DPV確定。首先,用一定體積的抗體依次孵育0、10、15、20、25和30 min。納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的DPV峰電流隨孵育時(shí)間的變化趨勢(shì),如圖3(a)所示,前25 min電流值快速下降,到25~30 min電流值增加。所以,選擇25 min作為免疫反應(yīng)時(shí)間為宜。

    圖2 納米金/石墨烯修飾電極的免疫傳感器檢測(cè)噻蟲啉的原理

    孵育溶液中噻蟲啉抗體含量的優(yōu)化由DPV確定。在不同抗體濃度的50μL溶液中,浸入納米金/石墨烯/噻蟲啉電極,孵育25 min,如圖3(b)所示。噻蟲啉抗體含量從0μL變化至10μL時(shí),DPV峰值電流明顯降低。噻蟲啉抗體體積從10μL增至20μL時(shí),峰值電流變化不大,表示電極上的結(jié)合位點(diǎn)基本達(dá)到飽和。因此,選擇10μL作為反應(yīng)中抗體體積。

    圖3 孵育時(shí)間和抗體含量與DPV峰值電流關(guān)系圖

    2.3 免疫傳感器的循環(huán)伏安分析

    不同階段修飾電極的CV曲線如圖4所示。裸電極a的CV曲線存在一對(duì)明顯的氧化還原峰。修飾了納米金/石墨烯/噻蟲啉之后的電極b,由于石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)活性,CV峰值電流顯著增大,電子傳遞明顯增強(qiáng)。放入孵育液之后的電極c,由于特異性免疫反應(yīng),電子傳遞受到阻礙,CV峰值電流下降,表明噻蟲啉已修飾到電極上。

    圖4 不同修飾電極在2 mM K3[Fe(CN)6]PBS溶液中的CV曲線

    2.4 噻蟲啉的檢測(cè)

    孵育液中游離的噻蟲啉、固定在電極表面的噻蟲啉競(jìng)爭(zhēng)分別與溶液中噻蟲啉抗體反應(yīng),如圖5所示,孵育液濃度分別為(a)5 000 ng·mL-1;(b)4 000 ng·mL-1;(c)3 000 ng·mL-1;(d)2 000 ng·mL-1;(e)1 000 ng·mL-1;(f)500 ng·mL-1;(g)100 ng·mL-1;(h)50 ng·mL-1;(i)10 ng·mL-1。從圖5可看出,孵育液中,噻蟲啉濃度的增加,導(dǎo)致DPV峰值電流逐漸增加。定義在僅含5μL抗體的PBS溶液中,納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的響應(yīng)電流為I0,在含有游離噻蟲啉的孵育液中,電極的響應(yīng)電流為I x,響應(yīng)電流的差值ΔI與噻蟲啉濃度在10~5 000 ng·mL-1范圍內(nèi)成正比,檢出限為0.7 ng·mL-1,低于文獻(xiàn)中超高效液相色譜法對(duì)噻蟲啉的殘留檢測(cè)[22]。

    圖5 不同濃度孵育液中,納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的DPV曲線

    2.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性

    對(duì)納米金/石墨烯/噻蟲啉修飾電極進(jìn)行5次DPV掃描,峰值電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.5%,表明修飾電極重復(fù)性較好。

    將納米金/石墨烯/噻蟲啉電極存放在空氣中,每隔一天進(jìn)行DPV掃描,峰值電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.5%,表明修飾電極穩(wěn)定性較好。

    2.6 香蕉樣品的分析

    對(duì)3種加入不同量噻蟲啉溶液的香蕉樣品進(jìn)行DPV測(cè)定,平行測(cè)定3次,見表1。如表1所示,噻蟲啉的回收率在88.2%~101.1%之間,平均為95.0%。

    表1 香蕉樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲啉試驗(yàn)結(jié)果

    2.7 西紅柿樣品的分析

    對(duì)3種加入不同量噻蟲啉溶液的西紅柿樣品進(jìn)行DPV測(cè)定,平行測(cè)定3次,見表2。如表2所示,噻蟲啉的回收率在95.8%~98.6%之間,平均為97.1%。

    表2 西紅柿樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲啉試驗(yàn)結(jié)果

    2.8 蘋果樣品的分析

    對(duì)3種加入不同量噻蟲啉溶液的蘋果樣品進(jìn)行試驗(yàn)前處理并測(cè)定,每個(gè)濃度測(cè)定3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,噻蟲啉的回收率在87.1%~113.4%之間,平均為102.9%,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

    表3 蘋果樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲啉試驗(yàn)結(jié)果

    2.9 大米樣品的分析

    對(duì)3種加入不同量噻蟲啉溶液的大米樣品進(jìn)行DPV測(cè)定,平行測(cè)定3次,見表4。如表4所示,噻蟲啉的回收率在92.8%~103.2%之間,平均為98.5%。

    表4 大米樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲啉試驗(yàn)結(jié)果

    3 結(jié)束語

    本文構(gòu)建了一種新型納米金/石墨烯/噻蟲啉電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)噻蟲啉,結(jié)合石墨烯優(yōu)異的導(dǎo)電性能,以及納米金優(yōu)良的導(dǎo)電性能和生物相容性,使納米金、石墨烯與噻蟲啉抗原共同固定于玻碳電極上檢測(cè)噻蟲啉。響應(yīng)電流的增加ΔI與噻蟲啉濃度在10~5 000 ng·mL-1范圍內(nèi)成正比,檢出限為0.7 ng·mL-1。這一新型免疫傳感器具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性,將其應(yīng)用于香蕉、西紅柿、蘋果與大米等實(shí)際樣品的檢測(cè),取得了滿意的結(jié)果。

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