地龍膠囊聯(lián)合放療對喉鱗癌裸鼠移植瘤血管生成的抑制作用

張瑞芳，侯繼崇，張玲娟

（1.衡水市人民醫(yī)院，河北衡水 053000；2.衡水市第七人民醫(yī)院，河北衡水 053000；3.邢臺市第三醫(yī)院，河北邢臺 054000）

喉鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分喉鱗癌患者在進行手術(shù)聯(lián)合放療輔助治療后都面臨著復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，這是因為喉鱗癌中晚期患者的癌細胞對放療的抵抗能力上升，使放療的治療效果降低所致，呈現(xiàn)喉鱗癌5年生存率持續(xù)下降，并且伴隨著喉鱗癌患者年輕化的現(xiàn)狀[1]。因此，尋找一種有效藥物輔助放療來提高喉鱗癌患者的生存率至關(guān)重要。地龍膠囊由地龍、川芎、黃芪、牛膝等多種中藥組成，具有增強免疫功能、抑制腫瘤細胞生長等功效[2]。相關(guān)文獻研究[3]發(fā)現(xiàn)，地龍膠囊能夠有效抵抗腫瘤侵襲，其作用機制可能與其加快血流速度、改變血液黏稠度等有關(guān)。本研究觀察地龍膠囊聯(lián)合放療對人喉鱗癌荷瘤裸鼠瘤體生長的影響及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級純系裸鼠40只，雌雄各半，4.8周齡，購自上海斯萊克實驗動物公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（滬）2017-0036。本實驗在衡水學院動物學實驗室完成。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24℃左右，濕度為65%左右，自由飲食。

1.2 細胞來源及培養(yǎng)人喉鱗癌Hep-2細胞株，購自上?；鄯f生物公司。以含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物、試劑與儀器地龍膠囊（南京恒生制藥公司生產(chǎn)，批號：國藥準字Z19991007，規(guī)格：0.28 g/粒）。血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1（PECAM-1，CD31）試劑盒（武漢菲恩生物科技公司）；生存素（survivin）抗體（上海瓦蘭生物公司）；缺氧誘導因子1α（HIF-1α）抗體（上海極威生物公司）；生存素免疫組織化學檢測試劑盒（上海莼試生物公司）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（自北京伊塔生物）。組織切片機（湖北孝感闊海醫(yī)療科技）；CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BY-600C離心機（北京白洋生物公司）；COGZ-250型CO2培養(yǎng)箱（常州金壇良友儀器公司）；電泳儀（北京柏奧易杰科技公司）。

1.4 喉鱗癌裸鼠模型的建立與分組將裸鼠背部用不同顏料做好標記，用醫(yī)用酒精對裸鼠背部進行消毒處理，將濃度為1×108個/mL的人喉鱗癌hep-2細胞注射于裸鼠背部皮下，每只裸鼠注射0.18 mL，注射完畢后，按壓注射部位10 s。7 d后成瘤。將40只成瘤裸鼠隨機分為4組，即模型組、放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組，每組10只。

1.5 治療方法放療組：采用γ射線局部照射裸鼠移植瘤（225倫/min，周一到周六每天照射2 Gy，周日休息，共進行12 d，共24 Gy；地龍膠囊組：給予地龍膠囊混懸液50 mg·kg-1·d-1[4]灌胃，連續(xù)干預2周；聯(lián)合組：地龍膠囊聯(lián)合放療共同進行治療，方法同地龍膠囊組和放療組。模型組：給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)干預2周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 瘤體質(zhì)量與體積 用擊打法處死實驗裸鼠，并在其背部取瘤。在5 mL注射器中加入3 mL滅菌注射用水，取瘤稱質(zhì)量后快速轉(zhuǎn)移到注射器內(nèi)，運用阿基米德定律，液面上升的高度就是取出的瘤體的體積。利用注射器數(shù)值及刻度尺進行讀數(shù)，進行拍照存檔。

1.6.2 免疫熒光染色法測定喉鱗癌細胞移植瘤CD31表達及微血管密度（MVD）將移植瘤組織冷凍制成5μm厚的切片，滴加血清封閉，25℃孵育30 min。滴加1%熒光標記的CD31抗體，25℃孵育2 h，緩沖液沖洗3次（共30 min）。加入山羊抗兔IgG二抗，避光孵育1 h。PBS沖洗3次后，顯色，封片。顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)單位面積的毛細血管數(shù)或單位體積的毛細血管數(shù)，即MVD。CD31抗體免疫熒光染色將血管內(nèi)皮細胞染成紅色。

1.6.3 免疫組織化學法檢測移植瘤組織生存素（survivin）的表達 將瘤體取出后，脫水、石蠟包埋和制片，脫蠟和水化，抗原修復，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復染、脫水、透明和封片。生存素陽性染色位于細胞核和細胞漿，顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)生存素陽性細胞率。

1.6.4 蛋白免疫印跡法檢測移植瘤組織中HIF-1α表達 稱取移植瘤組織，充分裂解提取總蛋白，按照二喹啉甲酸（BCA）試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，根據(jù)所測定的蛋白濃度決定上樣量。依次按配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉的順序，使提取的蛋白與目的蛋白抗體結(jié)合并免疫雜交，最后將雜交產(chǎn)物條帶放入Tanon 5200 Multi成像系統(tǒng)中進行顯影成像，分析目的蛋白條帶灰度值，以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參，計算目標蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值比值。重復實驗4次。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析或重復測量分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠移植瘤質(zhì)量、體積比較圖1結(jié)果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠瘤體質(zhì)量和體積均有所降低，其中，聯(lián)合組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明地龍膠囊聯(lián)合放療對裸鼠喉鱗癌移植瘤生長有明顯抑制作用，優(yōu)于單用放療或地龍膠囊。

圖1 各組裸鼠移植瘤質(zhì)量、體積比較Figure 1 Comparison of mass and volume of transplanted tumor between various groups of nude mice

2.2 各組裸鼠移植瘤組織CD31表達及微血管密度（MVD）比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤CD31陽性細胞數(shù)分別為（167±21）、（133±16）、（119±17）、（84±13）個。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤CD31陽性表達水平均降低（P＜0.05），其中，放療組與地龍膠囊組CD31水平無明顯差異（P＞0.05），聯(lián)合組裸鼠移植瘤CD31水平低于放療組和地龍膠囊組（P＜0.05）。

模型組、放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組MVD分別為（50.9±5.4）、（34.6±3.8）、（37.4±4.6）、（26.2±2.9）個。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤MVD均降低（P＜0.05），其中，放療組MVD與地龍膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），聯(lián)合組MVD水平低于放療組和地龍膠囊組（均P＜0.05）。免疫熒光染色結(jié)果見圖2。

2.3 各組裸鼠移植瘤組織生存素表達比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞率分別為（83.76±15.73）%、（60.14±7.71）%、（63.11±9.21）%、（20.01±4.28）%。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠生存素陽性細胞率均降低（P＜0.05）；放療組、地龍膠囊組生存素陽性細胞率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；聯(lián)合組裸鼠生存素陽性細胞率明顯低于放療組、地龍膠囊組（P＜0.05）。生存素陽性表達情況見圖3。

圖2 各組裸鼠移植瘤CD31表達及微血管密度（MVD）比較（免疫熒光法，×400）Figure 2 Comparison of CD31 expression and microvascular density（MVD）in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice（by immumofluorescence method，×400）

圖3 各組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞分布情況比較（SP免疫組織化學法，×400）Figure 3 Comparison of distribution of survivin-positive cells in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice（by SP immunohistochemistry，×400）

2.4 各組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達比較模型組、放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白相對表達量分別為（1.56±0.19）、（1.23±0.15）、（1.19±0.12）、（0.85±0.09）。與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠HIF-1α蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；放療組、地龍膠囊組HIF-1α蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；聯(lián)合組裸鼠HIF-1α蛋白表達水平低于放療組、地龍膠囊組（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

3 討論

喉鱗癌可歸屬于中醫(yī)學“喉蕈”“喉痹”“鎖喉瘡”范圍。喉位居五臟之上，內(nèi)通于肺，聯(lián)于胃，參與司呼吸，主受納，巧發(fā)聲的功能活動。喉鱗癌的發(fā)生主要與邪毒外犯、年老體虛、肺胃熱盛等因素有關(guān)。地龍膠囊方中，地龍清肺熱、通絡平喘，川芎活血化瘀，黃芪可益氣固表、托毒，牛膝逐瘀通經(jīng)，共奏清熱毒、活血化瘀的功效。本研究應用地龍膠囊聯(lián)合放療治療喉鱗癌裸鼠，觀察其對喉鱗癌裸鼠腫瘤生長情況的影響，結(jié)果顯示：模型組裸鼠瘤體質(zhì)量和體積最大；與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠瘤體質(zhì)量和體積均有所降低；地龍膠囊組裸鼠瘤體質(zhì)量及體積與放療組比較，差異無統(tǒng)計學意義；聯(lián)合組裸鼠瘤體質(zhì)量和體積較放療組和地龍膠囊組均顯著降低。表明地龍膠囊聯(lián)合放療進行干預能夠抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤的進一步擴大，而單純依靠放療和單純灌胃地龍膠囊抑瘤效果較差。

圖4 各組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達比較Figure 4 Comparison of HIF-1αprotein expression in transplanted tumor tissues between various groups of nude mice

抑制瘤體內(nèi)皮細胞血管生成，可有效控制癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[5]。本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合組喉鱗癌裸鼠移植瘤CD31表達水平及MVD低于模型組、放療組和地龍膠囊組。本研究通過體內(nèi)實驗進一步證實了地龍膠囊能夠抑制喉鱗癌裸鼠內(nèi)皮細胞的血管生成。

生存素是一種僅在腫瘤和胚胎組織中表達的凋亡抑制蛋白，其在腫瘤細胞中呈現(xiàn)特異性的表達。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，生存素在喉鱗癌中呈現(xiàn)異常的高表達。生存素的過量表達能夠幫助腫瘤細胞躲避細胞周期檢測，促使喉鱗癌細胞增殖，減少凋亡率[7]。而生存素在健康人體內(nèi)組織中呈低表達，則被認為是腫瘤基因療法的重要靶基因[8]。喉癌組織中生存素表達水平較高，生存素表達與喉癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，對喉癌的早期診斷，預后判斷具有意義[9]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤組織生存素陽性細胞率均降低，其中，聯(lián)合組生存素的陽性表達率較放療組、地龍膠囊組下降幅度更明顯，表明地龍膠囊聯(lián)合放療能夠降低喉鱗癌裸鼠移植瘤組織生存素的陽性高表達，進而促進喉癌細胞凋亡，抑制其增殖，從而減緩瘤體的增長。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，HIF-lα在喉癌中呈高表達。HIF-1α是缺氧環(huán)境中血管生成的重要調(diào)控因子。腫瘤細胞的快速生長往往使機體處于低氧環(huán)境，從而誘導HIF-1α高表達。多項研究證實，HIF-1α可介導血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的上調(diào)，VEGF可以促進腫瘤的侵襲和遷移，同時，HIF-1α還可調(diào)控血小板源生長因子B、促血管生成因子等多種因子[11-14]。HIF-1α的高表達可促進血管形成和腫瘤的生長、凋亡。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，放療組、地龍膠囊組、聯(lián)合組裸鼠移植瘤組織HIF-1α蛋白表達水平均降低，其中，聯(lián)合組HIF-1α蛋白表達低于放療組、地龍膠囊組，表明地龍膠囊聯(lián)合放療可通過抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤HIF-1α的表達，抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，地龍膠囊聯(lián)合放療對喉鱗癌裸鼠瘤體生長具有明顯的抑制作用，其機制可能與抑制腫瘤血管生成，促進細胞凋亡有關(guān)。提示地龍膠囊具有輻射增敏的效果，能夠有效降低HIF-1α對放療的抵抗作用。