居民飲用水微生物檢測中快速測試板的應(yīng)用探討

吳雙

（樂陵市生態(tài)環(huán)境監(jiān)控中心，山東 樂陵 253600）

1 微生物快速測試板的基本原理

1.1 檢測原理

微生物快速測試板是預(yù)制的培養(yǎng)基，為一次性使用，主要成分是營養(yǎng)培養(yǎng)基、吸水凝膠（可溶性好）以及能反應(yīng)生物菌落顏色與特征的可觀察顯色信息[1]?？焖贉y試板應(yīng)用較為廣泛，可以直接在自然環(huán)境中對微生物進(jìn)行檢測或鑒定，對混合的微生物也具有較好的檢測效果。

培養(yǎng)基是通過微生物新陳代謝的酶和對應(yīng)的顯色底物產(chǎn)生反應(yīng)，即顯色底物融合了產(chǎn)色基因和微生物的新陳代謝物質(zhì)，通過酶化作用顯示出顏色，以供觀察、鑒定。作為新型的培養(yǎng)基，其可以有效對微生物進(jìn)行篩選、分離，靈敏度更高、特異性更優(yōu)，而且能很快獲得檢測結(jié)果。

1.2 檢測步驟

快速檢測板使用便捷，不需要處理水樣、無需對設(shè)備消毒且無需準(zhǔn)備制作培養(yǎng)基。在檢測時，將采集的水樣靜置于無菌的器皿和環(huán)境中，將測試板放置到試驗(yàn)臺，打開上層膜，吸取1 毫升的水樣，滴落到測試板紙片上，再將上層膜蓋好，靜候10 秒以上，待培養(yǎng)基凝固的同時，做一片空白陰性實(shí)驗(yàn)比對。將測試板整理疊加好，放置到密封袋中，做好封口處理，再放置到（透明部分向上）保持恒溫的培養(yǎng)箱中，根據(jù)需檢測的項目要求，調(diào)節(jié)溫濕度做好培養(yǎng)，最后按照測試板顯示的顏色、菌落情況對比分析，以獲得水樣檢測數(shù)據(jù)。如果水樣中菌落含量較少，可以直接測試原液，以提高檢測的準(zhǔn)確度。[2]

2 微生物快速測試板的具體應(yīng)用

2.1 菌落總數(shù)檢測

菌落總數(shù)是關(guān)系居民飲用水安全的重要指標(biāo)，也是飲用水監(jiān)測最常用的指標(biāo)。通常使用平皿計數(shù)法檢測菌落總數(shù)，采集的水樣使用營養(yǎng)瓊脂在37℃有氧環(huán)境下培養(yǎng)48 小時，取1 毫升水樣，肉眼直接觀測菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測試板檢測原理與國標(biāo)法相同，吸取1mL 水樣，在測試板上提前涂刷營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，添加TTC 溶劑，培養(yǎng)24 小時，菌落呈現(xiàn)紅色，該檢測方法可以有效節(jié)約計數(shù)時間、提升計數(shù)效果。

2.2 總大腸菌群檢測

大腸菌群是食品衛(wèi)生安全檢驗(yàn)的重要指標(biāo)，主要存在于人類和動物糞便等有污染的場所，具有較強(qiáng)的傳染性。大腸菌群指標(biāo)高，則意味著食品和食品加工時受到污染程度高?？偞竽c菌群是在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時，能夠發(fā)酵產(chǎn)生乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽孢桿菌。[3]在居民飲用水安全檢測中，檢測總大腸菌群可以采用多管發(fā)酵法、濾膜法和酶底物法等三種方式，其中，供水行業(yè)中較為常用的兩種檢測方式分別為濾膜法、大腸菌群測試板（基于酶底物法原理），這兩種檢測方式有一定的區(qū)別與聯(lián)系，具體如下：

2.2.1 濾膜法

將水樣通過0.45 微米孔徑的微孔濾膜過濾后，再將含有菌群的濾膜貼在已含有乳糖的培養(yǎng)基上，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時，即可以形成有一定特征性菌落的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。這種檢測方式較為簡單，但檢測結(jié)果比較復(fù)雜，對這些特征性菌落還要進(jìn)一步進(jìn)行染色、鏡檢，再對呈現(xiàn)陰性的染色菌接種LPB 培養(yǎng)液，繼續(xù)在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時，直到出現(xiàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這時可以判斷總大腸菌群為陽性。

2.2.2 大腸菌群測試板

其主要成分是選擇性培養(yǎng)基、腸菌群特異性顯色指示劑和吸水凝膠，檢測技術(shù)專業(yè)、速度較快，將以前的幾步檢測變成一步檢測，將3 天的檢測時間減少至24 小時，同時還減去提前制作培養(yǎng)基、清洗器材器皿的費(fèi)時環(huán)節(jié)，在自來水的安全檢測中有著較好的適用性。具體檢測步驟為：首先，檢測時將制備好的飲用水樣品加入無菌稀釋液，按照1～2 個稀釋度進(jìn)行檢測，對于飲用純凈水或礦泉水等含菌量較低的水樣樣品，可直接吸收水樣原液進(jìn)行檢測。其次，將大腸菌群測試板放置于平整的實(shí)驗(yàn)臺上，輕輕揭開上層薄膜，用無菌吸管吸取均勻混合的水樣樣品約1mL，然后垂直滴至測試板中央，然后緩慢將上層膜蓋好，覆蓋時應(yīng)防止產(chǎn)生氣泡。然后，使用平面壓板在上層膜中央輕輕壓下，使樣品液體均勻覆蓋在圓形測試版的培養(yǎng)面積上，切忌覆蓋時不得扭轉(zhuǎn)壓板，靜置至少1min 至培養(yǎng)基凝固。最后，將大腸菌群測試板的透明面朝上，放置于36℃±1℃恒溫的培養(yǎng)箱中，堆疊放置片數(shù)應(yīng)≤20 片，培養(yǎng)24±2h。培養(yǎng)完成后觀察測試板顏色，大腸菌群呈紅色（如圖1），可通過目視、放大鏡或菌落計數(shù)器判斷大腸菌群的污染情況。

圖1 大腸菌群測試板圖樣

2.3 耐熱大腸菌群檢測

耐熱大腸菌群，顧名思義，就是具有一定的抗熱性。一般大腸菌群在超過44.5℃時就不能繼續(xù)生長，但耐熱大腸菌群則是不然。在居民飲用水檢測中，耐熱大腸菌群檢測可采用下列方式：

2.3.1 濾膜法

耐熱大腸菌群濾膜法和上文的總大腸菌群濾膜法一樣，將水樣通過0.45 微米孔徑的微孔濾膜過濾后，將菌群阻留到濾膜上，再將濾膜貼在已含有乳糖的培養(yǎng)基上，在44.5℃環(huán)境下培養(yǎng)24 小時，就能形成一定的特征性菌落。選擇MFC 作為耐熱大腸菌群的培養(yǎng)基，耐熱菌群的菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，不耐熱菌群的菌落呈現(xiàn)灰白或奶油色。在檢測中，有時因顏色特征性不明顯，可能會出現(xiàn)結(jié)果偏差，如假陽性。這時還需要對可疑的菌落采用EC 培養(yǎng)基二次培養(yǎng)，如果出現(xiàn)氣體則為耐熱大腸菌群。

2.3.2 耐熱大腸菌群測試板

其主要成分是一定量的乳糖、溴甲酚紫和TTC 指示劑以及其他營養(yǎng)成分，共同吸附在無菌濾紙上。當(dāng)具備一定的條件，細(xì)菌能迅速生長和繁殖后，會產(chǎn)生一定的酸度，使pH 值降低，溴甲酚紫就會由紫變黃。在產(chǎn)氣過程中，還有一定的脫氫酶會催化底物還原TTC，進(jìn)而產(chǎn)生難溶的TTF，在黃色背景下，會呈現(xiàn)紅色點(diǎn)狀或者塊狀現(xiàn)象。觀察指示劑的顏色，就可以判斷耐熱大腸菌群是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，進(jìn)而確定其存在的情況，根據(jù)菌落分布，可以確定其特性和數(shù)量。

2.4 大腸埃希氏菌檢測

大腸埃希氏菌通常是指大腸桿菌，其是一種較為常見的菌體，具有一定的傳染性、病原性，在一定環(huán)境下，對人類、動物的腸胃等消化器官、尿道等泌尿系統(tǒng)造成感染，對嬰幼兒和幼年的家禽、牲畜影響更為直接，常常導(dǎo)致腹瀉、敗血癥，嚴(yán)重時會危及生命安全[4]。根據(jù)要求，當(dāng)居民飲用水中檢測出總大腸菌群后，要深入檢測耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌，如沒有檢測出大腸埃希氏菌，則不需要做進(jìn)一步檢測。大腸埃希氏菌檢測方式有：

2.4.1 濾膜法

在無菌的環(huán)境下，將檢測出總大腸菌群呈陽性的菌落樣本由濾膜轉(zhuǎn)到NA-MUC 培養(yǎng)基板上，細(xì)菌面向上，在36℃環(huán)境下培養(yǎng)4 小時，再使用366 納米波長、6 瓦功率的紫外線直接照射樣本，如果菌落邊緣、背部呈現(xiàn)藍(lán)光物質(zhì)，則表示水樣中有大腸桿菌（如圖2所示）。

圖2 大腸埃希氏菌檢測

2.4.2 大腸埃希氏菌測試板

大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，其中β-半乳糖苷酶在培養(yǎng)基中，能催化底物，釋放一定的色原體；β-葡萄糖醛酸酶在培養(yǎng)基中，能分解底物，釋放一定的熒光物，兩者經(jīng)過44.5℃培養(yǎng)后，能使培養(yǎng)基的顏色出現(xiàn)變化，在紫外線燈照射下，菌落呈現(xiàn)熒光特征。通過這種方式，可以很快檢測出大腸埃希氏菌是否存在。其中，大腸埃希氏菌呈藍(lán)色，耐熱大腸菌群呈紫紅色或藍(lán)色菌斑（如圖3）。

圖3 大腸埃希氏菌耐熱大腸菌群測試板

3 效果對比

3.1 檢測結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)室中，對居民飲用水的500 份水樣，隨機(jī)抽取30 份水樣，對菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸桿菌這四類指標(biāo)，分別采用國標(biāo)法和測試板兩種方式進(jìn)行檢測，并對比有關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。其中，采用測試板方式檢測的水樣，都進(jìn)行了5 次平行試驗(yàn)。根據(jù)檢測結(jié)果，兩種檢測方式中陰性結(jié)果完全一致；測試板方式的陽性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差很小，不超過1%。取5 次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值和國標(biāo)法試驗(yàn)結(jié)果的平行雙樣值進(jìn)行對比分析，結(jié)果都不超過2.5%，計算公式如下：

式中：η 為相對偏差；X1為測試板方法的5 次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值；X2為國標(biāo)方法試驗(yàn)結(jié)果[5-6]。

3.2 檢測成本

對居民飲用水微生物檢測采用國標(biāo)法方式，其耗材不多、較為低廉，成本主要包括培養(yǎng)基、濾膜和其他輔助性能的藥品，在每份水樣測試時，四個微生物指標(biāo)耗費(fèi)約5～10 元。而采用快速測試板方式，因其是一次性消耗產(chǎn)品，不能回收利用，在每份水樣測試時，四個微生物指標(biāo)耗費(fèi)25～40 元。因此，相比國標(biāo)法，快速測試板的成本較高。[7]

3.3 檢測效率

快速測試板使用非常簡單，程序不復(fù)雜，準(zhǔn)確度較高，測試較為靈敏，對操作人員專業(yè)要求不高。在檢測時不用增加菌量，可以隨時進(jìn)行檢測，甚至可以在普通環(huán)境下直接測試，并且能夠直接反映樣品的污染情況、具體程度。在幾組對比測試中，測試板的效率比國標(biāo)法效率高一倍以上。[8]

綜合以上對比分析，在對成本關(guān)注不高時，可多應(yīng)用快速測試板開展相應(yīng)檢測。

4 結(jié)語

水乃生命之源，故居民飲用水的安全檢測至關(guān)重要。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與實(shí)際應(yīng)用檢驗(yàn)，微生物快速測試板能夠有效改善傳統(tǒng)檢測方式的不足與弊端、優(yōu)化檢測程序、節(jié)約檢測時間，還可提高檢測的有效性與精準(zhǔn)性，特別適用于檢測水樣較多、專業(yè)檢測人員不足的情況。因此，快速測試板必將在居民飲用水的微生物檢測中得到愈發(fā)廣泛的實(shí)踐應(yīng)用。