泄瀉患者膩苔與平人薄白苔舌面菌群差異性研究*

李 琪，孫 悅，丁成華，潘華平，齊城成，石國(guó)棟，董艷玉，李石林，袁麗霞

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004)

舌苔是覆蓋于舌背上的一層苔狀物,因其可隨病因病位及病勢(shì)等的不同在顏色、厚薄、部位、質(zhì)地等方面發(fā)生改變而成為中醫(yī)望診的重要內(nèi)容，但對(duì)于這一現(xiàn)象形成的具體機(jī)制目前尚不明朗。有研究認(rèn)為，舌苔類型與舌背黏膜上皮細(xì)胞的新陳代謝關(guān)系密切，而舌背菌群與舌背黏膜上皮細(xì)胞相互作用又可對(duì)舌背黏膜上皮細(xì)胞的新陳代謝產(chǎn)生重要影響，不同病證又對(duì)應(yīng)不同的舌面菌群[1]。因而，不同病證所表現(xiàn)的特征性舌苔可能與其舌面菌群差異相關(guān)。為印證這一觀點(diǎn)，本研究以泄瀉病為例，以其臨床常見黃膩苔和白膩苔為研究對(duì)象，利用目前運(yùn)用較前沿的Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，深入探究其舌面菌群物種及豐度的變化規(guī)律及與舌苔的相關(guān)性,為舌苔形成與變化機(jī)制的深入研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 樣本來(lái)源及分組

選取2018年4月至2019年5月在江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院就診，由2位有經(jīng)驗(yàn)的中醫(yī)師采用盲法觀察舌象診斷一致性程度較高且符合黃膩苔、白膩苔診斷標(biāo)準(zhǔn)的泄瀉患者各60例，分別納入YF組和WF組，同時(shí)選取符合正常薄白苔診斷標(biāo)準(zhǔn)的60名在校師生志愿者納入NF組,均進(jìn)行舌苔樣本采集。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

泄瀉患者參照《泄瀉中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(2017)》[2]診斷標(biāo)準(zhǔn)；舌苔均符合國(guó)家規(guī)劃教材《中醫(yī)診斷學(xué)》[3]與《中醫(yī)舌診圖譜(中英對(duì)照)》[4]中黃膩苔、白膩苔和薄白苔的舌苔診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；近1個(gè)月內(nèi)未服用益生菌、益生元、抗生素或中草藥等可能對(duì)菌群有影響的藥物；自愿參與并配合該研究并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

孕期或哺乳期婦女；過敏體質(zhì)者；口腔炎癥或牙周疾病者[5]。

1.5 標(biāo)本采集

采樣前2名采樣人員經(jīng)導(dǎo)師培訓(xùn)統(tǒng)一采樣標(biāo)準(zhǔn)。在受試者早間未刷牙和未進(jìn)食水的情況下，囑咐其用0.9%氯化鈉溶液漱口后，利用醫(yī)用一次性木質(zhì)壓舌板由舌根處往舌尖方向力度適中刮取舌苔，并收集于裝有3 mL 0.9%氯化鈉溶液的無(wú)菌管中，置于冰盒短時(shí)間內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆肹6]。每例受試者1次采集2份樣品。

1.6 舌面菌群DNA的提取

本研究使用 GV-Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒，按照說明書提取樣本總DNA，利用 1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)對(duì)抽提的基因組 DNA 進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)，篩選出優(yōu)質(zhì)樣本并使用通用引物 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)與806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)樣本 16 S rRNA 的V3-V4 區(qū)域進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括 5 × Fast Pfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，F(xiàn)ast Pfu Polymerase 0.4 μL，模板基因 10 ng并補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性 3 min，再95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)后，72 ℃穩(wěn)定10 min ,最后4 ℃保存。每個(gè)樣本重復(fù)3次，并構(gòu)建PE 擴(kuò)增文庫(kù)。使用 Illumina Miseq PE 300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，再根據(jù)97%的相似度對(duì)優(yōu)化后的序列進(jìn)行OTU聚類、剔除嵌合體，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)得到各樣本的物種分類與注釋信息。并基于美吉生物云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com/)對(duì)樣本進(jìn)行多樣性、物種組成、組間差異顯著性檢驗(yàn)及LEfSe 多級(jí)物種差異分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序序列信息統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢和篩選后，3組樣本共得到120份優(yōu)質(zhì)序列，每組40份。表1示，3組樣本在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙和酗酒等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在這120份樣本中有效序列數(shù)目為6 614 653條，平均55 122條，長(zhǎng)度主要為401～440bp，平均423.49bp(圖1)?；贠TU聚類結(jié)果的稀釋性曲線隨樣本序列數(shù)目增加趨于平坦(圖2)，表明測(cè)序深度合理，可以進(jìn)行下一步分析。

表1 3組樣本一般資料比較

注：x軸為長(zhǎng)度區(qū)間，y軸為序列的數(shù)目圖1 所有樣本序列長(zhǎng)度分布

注:一條稀釋性曲線代表一個(gè)樣本，其中紅色代表黃膩苔組,藍(lán)色代表白膩苔組,綠色代表薄白苔組圖2 3組樣本基于OTU水平的稀釋性曲線

2.2 α多樣性分析

α多樣性分析是反映每組樣品內(nèi)的物種菌群豐富度和均勻性的一種分析方法，常見的評(píng)估指數(shù)有chao、ace、shannon 及 simpson，其中chao 指數(shù)和ace指數(shù)常用于評(píng)估物種豐富度，指數(shù)越大豐富度越高；shannon 和simpson指數(shù)常用來(lái)評(píng)估菌群多樣性和均勻度，shannon指數(shù)越高simpson指數(shù)越低，說明菌群多樣性越高[7]。圖3示，3組樣本在菌群豐富度和均勻性方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：圖a、b、c、d分別代表chao、ace、shannon 及 simpson指數(shù)，紅色代表黃膩苔組,藍(lán)色代表白膩苔組,綠色代表薄白苔組圖3 3組樣本α多樣性分析圖

2.3 Beta多樣性分析和分組分析

Beta多樣性分析和分組分析主要分析樣本間微生物群落組成的相似性，樣本距離越近則表示樣本的組成越相似。圖4、5示，基于PCoA和NMDS的Beta 多樣性分析，及基于PLS-DA回歸模型和隨機(jī)森林分析的分組分析中，X、Y軸兩坐標(biāo)系雖不能將3組樣本完全分開，但各樣本組內(nèi)有聚類趨勢(shì)，組間有離散趨勢(shì)，說明3組樣本組內(nèi)群落相似度大于組間群落的相似度，分組具有意義。

注：圖a為基于PCoA分析法的Beta 多樣性分析，圖b為基于NMDS分析法的Beta 多樣性分析,圖c為基于PLS-DA分析法的分組分析，圖d為隨機(jī)森林分析，圖中兩點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表樣本組成的相似性程度，距離越近則樣本的組成越相似,紅色代表黃膩苔組,藍(lán)色代表白膩苔組,綠色代表薄白苔組圖4 3組樣本Beta多樣性分析與分組分析比較

注：a、b、c分別代表門、目、屬水平,1代表物種組成分析，2代表物種差異分析, *P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖5 3組樣本物種組成與差異分析

2.4 物種組成與差異分析

基于70% 的置信水平，與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，3組樣本共有19個(gè)門，37個(gè)綱，97個(gè)目，166個(gè)科，326個(gè)屬，603種細(xì)菌，以下主要從門、科、屬這3個(gè)分類水平進(jìn)行分析。

2.4.1 門分類學(xué)水平 圖5a示，3組樣本的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。其中梭桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)在WF組中豐度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余菌門雖在不同樣本中的豐度占比不同，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2 目分類學(xué)水平 圖5b展示了15種相對(duì)豐度排名較前的菌目，其中擬桿菌目(Bacteroidales)、betaproteobacteriales、新月形單胞菌目(Selenomonadales)、乳桿菌目(lactobacillales)、梭桿菌目(Fusobacteriales)、Pasteurellales、放線菌目(Actinomycetales)、梭菌目(Clostridiales)等8種菌目在3組樣本中相對(duì)含量較高，共占總菌目的80%以上，而梭桿菌目、Pasteurellales、黃桿菌目(flavobacteriales)、芽孢桿菌目(bacillales)、葉綠體(chloroplast)5種菌目在3組樣本中存在顯著差異。其中，黃桿菌目在YF組豐度較高，梭桿菌目、芽孢桿菌目、葉綠體在WF組豐度較高，Pasteurellales在NF組豐度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4.3 屬分類學(xué)水平 圖5c示，奈瑟氏菌屬(neisseria)、普氏菌屬(Prevotella_7、Prevotella、Prevotella_6)、韋榮球菌屬(veillonella)、鏈球菌屬(streptococcus)、嗜血桿菌屬 (haemophilus)、梭菌屬(Fusobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、卟啉單胞菌屬(porphyromonas)、alloprevotella，纖毛菌屬(leptotrichia)、顆粒鏈菌屬(granulicatella)、羅氏菌屬(Rothia)、capnocytophaga、Agathobacter、Megamonas等17種菌屬在3組樣本中均存在明顯聚集。而Prevotella_7、capnocytophaga、嗜血桿菌屬、梭菌屬和卟啉單胞菌屬在3組樣本中存在顯著差異，其中capnocytophaga在YF組豐度較高，梭菌屬和卟啉單胞菌屬在WF組中豐度較高，Prevotella_7和嗜血桿菌屬在NF組豐度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

為進(jìn)一步探究黃膩苔、白膩苔的菌群特征，通過 LEfSe 多級(jí)物種差異判別分析，試圖篩選出差異物種并評(píng)估這些差異物種的影響力(LDA≥3，P<0.05)。圖6a示，YF組主要富集α-變形菌綱、根瘤菌目(rhizobiales)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、黃桿菌(目、科)、capnocytophaga，WF組主要富集梭桿菌(門、綱、目、屬)、藍(lán)細(xì)菌門、生氧光細(xì)菌綱(oxyphotobacteria)、葉綠體、芽孢桿菌(目、科)、孿生菌屬(gemella)、卟啉單胞菌(科、屬)，NF組主要富集Pasteurellales、嗜血桿菌屬、普氏菌(科、屬)，與上述物種差異分析結(jié)果基本一致。而由進(jìn)化分枝圖(圖6b)可知，YF組富集菌種主要來(lái)源于變形菌門下的根瘤菌科，擬桿菌門下的capnocytophaga、WF組富集的菌種，主要來(lái)源于梭桿菌門及其門下的梭菌、藍(lán)細(xì)菌門及其門下的葉綠體、擬桿菌門下的卟啉單胞菌屬及厚壁菌門下的孿生菌屬，ZF組富集的菌種主要來(lái)源于擬桿菌門下的普氏菌屬及變形菌門下的嗜血桿菌屬。

注：圖a為線性判別分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)柱狀圖，LDA分值越大，代表該物種豐度對(duì)差異結(jié)果的影響越大，圖b為L(zhǎng)EfSe多級(jí)物種層級(jí)樹圖，圓圈從內(nèi)到外依次代表門、綱、目、科、屬水平，圓點(diǎn)代表各分類水平的物種，其中差異顯著物種隨組別進(jìn)行著色，紅色代表黃膩苔組,藍(lán)色代表白膩組,綠色代表薄白苔組。圖6 3組樣本 LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

3 討論

本研究對(duì)比了泄瀉患者黃膩苔、白膩苔與平人薄白苔的舌面菌群特征，發(fā)現(xiàn)上述3組樣本的舌面菌群確實(shí)存在差異，該差異可能是導(dǎo)致不同類型舌苔形成的原因。

首先，多樣性及分組分析表明，黃膩苔、白膩苔和薄白苔的舌面菌群在物種豐富度和多樣性上具有相似性，但在菌群構(gòu)成上存在差異，這與后面的樣本組成與差異分析結(jié)果一致，即3組樣本在各分類水平都具有相同的優(yōu)勢(shì)菌種,但各優(yōu)勢(shì)菌種在不同樣本中的占比均不相同。

門水平上，3組樣本的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門和放線菌門，與既往研究結(jié)果一致[8]。而除梭桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門在白膩苔顯著富集外，其他菌門占比雖在3組樣本中存在差異，但差異不顯著。白膩苔多為中焦脾胃陽(yáng)氣虧虛、脾失健運(yùn),以致痰濁、水濕、飲食停聚舌面所致。而梭桿菌門被證實(shí)，在與痰證相關(guān)病變(如冠心病、慢阻肺等)患者中豐度顯著升高[9，10]，藍(lán)細(xì)菌門是水體及水產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)菌種，其含量在水庫(kù)中表現(xiàn)為冬春季節(jié)高于夏秋季節(jié)[11，12]，在濕困脾胃證大鼠模型中顯著升高[13]，說明這2種菌門可能具有嗜水濕和低溫的特性，并參與機(jī)體的水濕代謝，這與白膩苔表征的寒濕、痰濕、水濕證候相符。

目水平上，3組樣本除了共有優(yōu)勢(shì)菌目外，還出現(xiàn)了各自特征菌目，說明隨著分類水平的深入，更多差異菌種可被發(fā)現(xiàn)。而結(jié)合進(jìn)化分枝圖可知，菌目的差異主要由其歸屬的菌屬或菌科差異所致。即黃膩苔組富集了根瘤菌目下的根瘤菌科、黃桿菌目下的capnocytophaga，白膩苔組除了富集梭桿菌門下的梭菌、藍(lán)細(xì)菌門下的葉綠體外，還富集來(lái)源于擬桿菌目下的卟啉單胞菌屬及芽孢桿菌目下的孿生菌屬，薄白苔組富集了擬桿菌目下的普氏菌屬及Pasteurellales下的嗜血桿菌屬。其中，根瘤菌目和Pasteurellaless歸屬于變形菌門，黃桿菌目和擬桿菌目歸屬于擬桿菌門，芽孢桿菌目歸屬于厚壁菌門。

根瘤菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌，能將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為機(jī)體可吸收利用的化合態(tài)氮[14]，進(jìn)而影響機(jī)體蛋白的合成，而某些蛋白參與舌上皮細(xì)胞的增殖、角化、脫落、免疫等進(jìn)程，與膩苔的形成密切相關(guān)[15]。且成穎[16]等發(fā)現(xiàn)，該菌在黃苔中的豐度高于白苔，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時(shí)該菌亦具有致病性，與豬肺炎發(fā)病相關(guān)[17]。Capnocytophaga是定植于口腔的條件致病菌，可引起膿腫、結(jié)膜炎、牙周炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥等炎性病變[18]。而黃膩苔是上述疾病的常見舌象，其表征的痰熱、濕熱或食積熱腐等是上述疾病的常見證候。因此，黃膩苔的出現(xiàn)可能是機(jī)體炎性反應(yīng)的結(jié)果，與Capnocytophaga和根瘤菌的功能活動(dòng)有關(guān)。

卟啉單胞菌屬為專性厭氧的革蘭氏陰性菌,廣泛存在于口腔及根系管道,包括牙齦卟啉單胞菌、牙髓卟啉單胞菌 、利氏卟啉單胞菌等，其中牙齦卟啉單胞菌是導(dǎo)致口臭、牙周病等口腔疾患的常見菌[19]。孿生菌屬為兼性厭氧菌，為人體口腔、腸道和呼吸道的專性寄生菌，包括溶血孿生球菌、副溶血孿生球菌、血孿生球菌、麻疹孿生球菌、伯氏孿生球菌、臺(tái)灣孿生球菌和不解糖卟啉孿生球菌7個(gè)菌種，這些菌均為人體正常定植菌，有時(shí)也可引起全身性感染[20]。兩菌均被證實(shí)，在濕、寒、痰環(huán)境中顯著富集[21-23]，與白膩苔表征的證候相符。白膩苔為水濕痰濁集聚舌面所致，易形成局部厭氧環(huán)境，利于厭氧菌、兼性厭氧菌的生長(zhǎng)[24]，且膩苔患者口臭、牙周病率高，可能與牙齦卟啉單胞菌的過度生長(zhǎng)有關(guān)。因而上述2種菌群可能與白膩苔的形成有關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

普氏菌屬為人體益生菌之一，其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸具有增強(qiáng)機(jī)體上皮細(xì)胞屏障功能、維持黏膜免疫和調(diào)節(jié)能量平衡等作用[25，26]。按照中醫(yī)“正邪”理論，該菌對(duì)機(jī)體的免疫、防御、營(yíng)養(yǎng)作用屬于中醫(yī)的“正氣”范疇。膩苔多主濕濁痰飲停聚病證，濕濁痰飲均為陰邪易傷陽(yáng)氣，導(dǎo)致機(jī)體陽(yáng)氣(正氣)虧損。因而在膩苔患者中，該菌含量可能下降，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。且該菌亦被證實(shí)，在健康機(jī)體常表現(xiàn)出高豐度[27，28]。嗜血桿菌屬是一種需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，僅寄生于人或動(dòng)物的黏膜上，目前監(jiān)測(cè)到該屬細(xì)菌共有17個(gè)種，一些特殊的種可導(dǎo)致疾病，如流感嗜血桿菌、副豬嗜血桿菌等，該菌具有較低的耐酸性[29-31]，而膩苔患者舌苔pH值普遍低于正常舌苔且呈弱酸性[32]，這可能是嗜血桿菌屬在正常舌苔的豐度高于膩苔的原因。

綜上所述，泄瀉患者的黃膩苔和白膩苔與健康薄白苔在舌面菌群上存在明顯差異，其中變形菌門下的根瘤菌科、擬桿菌門下的capnocytophaga豐度顯著升高，可能是泄瀉黃膩苔的特征表現(xiàn)，梭桿菌門及其門下的梭菌、藍(lán)細(xì)菌門及其門下的葉綠體、擬桿菌門下的卟啉單胞菌屬及厚壁菌門下的孿生菌屬豐度顯著升高，可能是泄瀉白膩苔的特征表現(xiàn)。同時(shí)上述2種舌苔普氏菌屬豐度均下降，即益生菌數(shù)量下降，說明該舌象患者可能存在正氣虧損的表現(xiàn)，在治療過程中應(yīng)注意補(bǔ)充益生菌或扶助正氣。