肝癌中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究進(jìn)展

柳 卓，田雪飛，曾普華

(1. 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 412000；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技處，湖南 長(zhǎng)沙 412006)

肝癌是發(fā)于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞或肝細(xì)胞的惡性腫瘤，是中國(guó)導(dǎo)致死亡的第二大癌癥。2020年，全球確診為肝癌的人超過90萬，其中中國(guó)人有41萬[1]。肝癌具有起病隱匿、惡性度高、進(jìn)展快、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)。晚期癥狀主要表現(xiàn)為肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。肝癌容易在肝內(nèi)及肝外發(fā)生轉(zhuǎn)移，易侵犯門靜脈及分支并形成瘤栓，肝外轉(zhuǎn)移分為血行、淋巴道、種植轉(zhuǎn)移等，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量。肝癌早期，采用積極的手術(shù)治療配合介入及靜脈化療，并結(jié)合口服索拉菲尼等藥物積極予以治療，患者一般可以帶瘤生存。肝癌后期的治療有外科手術(shù)、肝移植、放化療等聯(lián)合手段，但其預(yù)后較差，容易反復(fù)發(fā)作，5年生存率僅為12.1%[2-3]。因此，提高肝癌患者的生存率，早治療、早診斷非常必要。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(protein translational modifications，PTMs)是指通過共價(jià)加工1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)或通過蛋白質(zhì)水解剪去基團(tuán)而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)[4]。這個(gè)過程是采用可逆的狀態(tài)模式，調(diào)節(jié)蛋白功能，改變理化性質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)300多種不同的翻譯后修飾，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化等。在蛋白翻譯后修飾方式的鑒定過程中，蛋白會(huì)首先被酶切成肽段，然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜分析，得到的是一系列肽段的分子質(zhì)量信息[4]。對(duì)于某一個(gè)特定肽段而言，在沒有發(fā)生任何翻譯后修飾的情況下，其序列信息和分子量是確定的。因此，可以更直觀的了解到PTMs的作用。很多研究表明，PTMs跟腫瘤代謝密切相關(guān)，并能調(diào)控腫瘤抑制因子與癌蛋白的表達(dá)。本文就PTMs的幾種形式在肝癌中的作用進(jìn)行綜述，并探索其相關(guān)藥物開發(fā)前景，為肝癌干預(yù)診斷提供新的思路。

1 糖基化

蛋白質(zhì)的糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，是在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖類轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。研究表明70%人類蛋白包含一個(gè)或多個(gè)糖鏈，1%的人類基因組參與了糖鏈的合成和修飾[5]。

糖基化主要分為O-糖基化和N-糖基化。蛋白質(zhì)蘇氨酸或絲氨酸的自由OH基與O-糖鏈共價(jià)連接稱為O-糖基化，蛋白質(zhì)天冬氨酸的自由NH2基與N-糖鏈共價(jià)連接稱為N-糖基化[6]。研究顯示，異常糖基化修飾能影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、治療診斷以及轉(zhuǎn)移侵襲等[6]。異常糖基化修飾在肝癌中常常出現(xiàn)，影響相關(guān)蛋白的生物學(xué)活性，在增強(qiáng)化療效果和化療耐藥中發(fā)揮重要作用，并能用于診斷標(biāo)記。除此之外，蛋白質(zhì)糖基化在肝癌中還表現(xiàn)出如下作用。

1.1 肝癌診斷標(biāo)記人羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CES1)是一種絲氨酸酯酶，在CES1的N79端含有一個(gè)獨(dú)特的單糖連接糖基，CES1的單鏈糖基化對(duì)肝癌細(xì)胞具有抗增殖作用，是肝細(xì)胞癌的血清標(biāo)志物之一[7]。此外，血漿中的纖維蛋白原Aα亞型細(xì)胞中O-聚糖糖基化的數(shù)量在肝硬化患者中降低，而血漿中纖維蛋白原Bβ和γ-亞基在肝硬化和肝癌患者中均升高，基于此可3 h內(nèi)判斷患者是否患有肝病[8]。

1.2 促進(jìn)肝癌侵襲O-連接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)在PTMs中發(fā)揮調(diào)控作用，O-GlcNAc糖基化修飾是在糖基轉(zhuǎn)移酶OGT的催化下以O(shè)-糖苷鍵形式共價(jià)連接到蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上的單糖修飾[9]。在小分子RNA研究方面，肝癌組織和細(xì)胞中表現(xiàn)出miR-424-5p通過負(fù)調(diào)節(jié)O-GlcNAc，抑制原癌基因絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶有絲分裂原激活蛋白酶(rapidly accelerated fibrosarcoma 1，RAF1)糖基化，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。

1.3 肝癌代謝相關(guān)Chen等[11]發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin通過抑制O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun來調(diào)節(jié)肝癌的代謝相關(guān)核表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，并能進(jìn)一步抑制人重組AP1(c-Jun)蛋白表達(dá)，同時(shí)谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成受O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun的調(diào)控。臨床中已發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun與GSH之間有正相關(guān)，GSH參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)及糖代謝。所以蛋白糖基化可能與肝癌能量代謝有相關(guān)性。

2 磷酸化

蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的一種蛋白PTMs之一。磷酸化是指在蛋白質(zhì)或中間代謝產(chǎn)物上加磷酸基團(tuán)的過程。蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸上，具有參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及通路調(diào)控的重要作用，跟轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)等過程密切相關(guān)[12]。Di等[13]發(fā)現(xiàn)磷酸化在癌癥生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用：當(dāng)磷酸化時(shí)，癌細(xì)胞中的脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase 2，PHD2)發(fā)揮活性，能促進(jìn)癌細(xì)胞在腫瘤的低氧區(qū)域的死亡。在肝癌中，蛋白的磷酸化主要發(fā)揮以下作用。

2.1 肝癌的診斷標(biāo)記磷酸化的Aα-纖維蛋白原亞型在肝癌患者中降低，而肝硬化單磷酸化增加，可作為肝癌和肝硬化的診斷依據(jù)[8]。在建立肝癌動(dòng)物模型中通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從433種蛋白中篩選發(fā)現(xiàn)抑癌蛋白組磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機(jī)焦磷酸性磷酸酶(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LHPP的水平出現(xiàn)了下調(diào)并能影響肝癌的生長(zhǎng)，增加LHPP表達(dá)則能夠有效抑制癌細(xì)胞增殖并阻止肝功能損傷[14]。

2.2 影響肝癌增殖肝癌細(xì)胞異常分泌的蛋白激酶Cδ(protein kinase C-delta，PKCδ)能與硫酸乙酰肝素類磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結(jié)合并可錨定在肝癌細(xì)胞表面從而調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PKCδ能激活促生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors-1，IGF-1)受體(IGF1R)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)的活性，從而加速肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，可見，抗PKCδ能減少肝癌細(xì)胞的增殖以及腫瘤生長(zhǎng)，可應(yīng)用于肝癌治療[15]。

3 乙?；?/h2>

乙酰化主要被組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase 1，HAT)調(diào)控并發(fā)生在賴氨酸殘基上。乙酰化修飾對(duì)各種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞核功能及相關(guān)通路調(diào)控有調(diào)節(jié)作用，可以改變關(guān)鍵的代謝酶類的功能，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的快速增殖，蛋白被乙酰化后會(huì)參與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞分化、腫瘤免疫等[16]。很多癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，HDAC抑制劑能有選擇性的調(diào)節(jié)相關(guān)的因子和抑癌基因的表達(dá)，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抗癌作用[17]。

3.1 致癌作用首先，乙?；梢杂绊懜伟┘?xì)胞的糖代謝關(guān)鍵酶。磷酸甘油激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)是代謝性糖酵解途徑中的重要酶，PGK1 K323位點(diǎn)的乙酰化能促進(jìn)其酶活性和癌細(xì)胞代謝，肝癌組織中PGK1明顯過表達(dá)，PGK1的缺失顯著降低了癌細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生[18]。其次，可以通過自噬促發(fā)增殖。組蛋白去乙酰化酶HDAC3促進(jìn)組蛋白H4在賴氨酸16位點(diǎn)的乙?；?，作用于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)并增強(qiáng)自噬相關(guān)的微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈 3(MAP1LC3，LC3)和半胱氨酸蛋白酶(autophagy related 4 homolog，ATG4)之間的相互作用，從而觸發(fā)細(xì)胞自噬，影響肝細(xì)胞增殖[19]。

3.2 腫瘤的轉(zhuǎn)移蛋白乙?；瘏⑴c腫瘤血管生成相關(guān)的腫瘤細(xì)胞遷移。5號(hào)染色體的基因(spermatogenic Zip 1，SPZ1)在腫瘤發(fā)生過程中作為原癌基因和人Twist相關(guān)蛋白1(TWIST1)的乙酰化形成SPZ1-TWIST1復(fù)合物，是癌細(xì)胞遷移的必需物。使用人源化單克隆血管生長(zhǎng)因子中和抗體如貝伐珠單抗能有效地消除乙?；疭PZ1-TWIST1復(fù)合物誘導(dǎo)的誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]。

3.3 肝癌標(biāo)志作用組蛋白H3第27位賴氨酸的乙?；?H3K27ac)是活躍的增強(qiáng)子已知的最佳表觀遺傳標(biāo)記物，其轉(zhuǎn)錄活性受到多個(gè)組蛋白賴氨酸位點(diǎn)乙?；膮f(xié)同作用的調(diào)控[21]。研究表明，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的核受體共激活因子3(nuclear receptor coactivator 3，NCOA3)的富集與HGF處理反應(yīng)位點(diǎn)的H3K27ac相關(guān)：NCOA3通過肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human growth factor，HGF)信號(hào)級(jí)聯(lián)在轉(zhuǎn)錄上調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體溶血磷脂酸受體6(LPAR6)，LPAR6與肝癌細(xì)胞HGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間存在表觀遺傳聯(lián)系，因此，LPAR6可作為肝癌治療干預(yù)的生物標(biāo)志物[22]。

3.4 調(diào)節(jié)肝癌代謝能量平衡線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)已被證明在肝癌代謝過程中參與肝癌細(xì)胞代謝重編程發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)分析表明，MRPS5與線粒體復(fù)合體I的功能密切相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)MRPS5促進(jìn)了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的產(chǎn)生，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞線粒體功能，參與能量調(diào)節(jié)。乙?；疢RPS5能直接導(dǎo)致糖酵解蛋白的表達(dá)增加并促進(jìn)Warburg效應(yīng)。而去乙酰化MRPS5定位于線粒體，促進(jìn)線粒體復(fù)合物-I功能和NAD的生成，增強(qiáng)線粒體呼吸，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞能量代謝[23]。

4 泛素化

泛素化(包括類泛素化)作為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，一直是腫瘤生物學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。泛素化修飾是一個(gè)可逆的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由泛素連接酶和去泛素化酶等精確調(diào)控。泛素化過程通常需要3種泛素酶的協(xié)同作用，其中E1泛素激活酶與E2泛素偶聯(lián)酶激活泛素，將其鏈接到蛋白底物上，而泛素連接酶在靶蛋白的特異性識(shí)別及泛素化系統(tǒng)活性的調(diào)控中起最重要的作用。泛素連接酶在靶蛋白的特異性識(shí)別及泛素化系統(tǒng)活性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[24]。迄今有近600種E3泛素連接酶和100種去泛素化酶被報(bào)道。泛素化修飾后能抑制底物泛素-蛋白酶體途徑降解，進(jìn)而參與細(xì)胞周期、自噬、天然免疫等多種生理過程的調(diào)節(jié)。在肝癌中蛋白泛素化還能表現(xiàn)出如下功能。

Fig 1 Post translational modification of proteins in liver cancer

4.1 調(diào)節(jié)肝癌穩(wěn)定信號(hào)Tribbles同源物2(TRIB2)對(duì)實(shí)體惡性腫瘤和非實(shí)體惡性腫瘤都至關(guān)重要。肝癌細(xì)胞中TRIB2表達(dá)上調(diào)，TRIB2與E3泛素連接酶發(fā)揮作用，從而調(diào)節(jié)下游效應(yīng)器的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性：TRIB2為肝癌特異性Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游靶點(diǎn)，可見TRIB2蛋白泛素化在肝癌細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)化中起重要作用[25]。

4.2 肝癌治療藥物敏感相關(guān)阿霉素是常用的治療肝癌的化合物，在最近對(duì)其化療藥的敏感性研究中表明沉默信息調(diào)節(jié)因子6(silent information regulator，SIRT6)能預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。SIRT6使叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型(FOXO3)上調(diào)，同時(shí)增加FOXO3泛素化減低其穩(wěn)定性。從而預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡作用[26]。

4.3 調(diào)節(jié)肝癌預(yù)后TCP1復(fù)合物的伴侶蛋白(chaperonin containing TCP-1 complex，CCT)亞基3是一種非核蛋白，CCT3能阻斷多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2的泛素化，從而延長(zhǎng)癌蛋白Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)和轉(zhuǎn)錄因子CP2(TFCP2)的半衰期。臨床上，CCT3與YAP和TFCP2呈正相關(guān)，CCT3-YAP-TFCP2軸水平升高可能是調(diào)節(jié)肝臟惡性腫瘤預(yù)后的關(guān)鍵[27]。

4.4 調(diào)節(jié)肝癌能量平衡在E3連接酶腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)催化下，賴氨酸63型連接多聚泛素化對(duì)自噬受體蛋白的后續(xù)識(shí)別起著重要作用。TRAF6介導(dǎo)的泛素化系統(tǒng)，通過自噬調(diào)節(jié)糖酵解，為治療自噬受損肝癌的糖解治療干預(yù)開辟了一條途徑[28]。

5 展望

已有大量證據(jù)證實(shí)，PTMs參與調(diào)節(jié)肝癌的生長(zhǎng)增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物材料和放射敏感性等。在肝癌的治療干預(yù)及預(yù)后均體現(xiàn)其初步價(jià)值。現(xiàn)在研究表明，PTMs相關(guān)的藥物聯(lián)合使用，安全性較好、靶向性高，但仍然需要更多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。