硫酸黏菌素及其制劑的檢測方法驗證及優(yōu)化

張美玉 謝彥軍 曹永慧

（山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司，山東 濟寧 272000）

硫酸黏菌素又名硫酸黏桿菌素，克里斯?。–olistin Sulfate）、多黏菌素（PolymyxinE）、抗敵素等，它是1950 年由日本的小山抗浮從福島縣土壤中分離到的1 株多黏芽孢桿菌抗敵素變株的培養(yǎng)液中提取的一種鎖環(huán)狀多肽類抗生素，為白色粉末，易溶于水，耐熱，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，無副作用，不易產生耐藥菌株，是最安全的抗生素之一，幾乎對所有的革蘭氏陰性菌有效，對綠膿桿菌有顯著作用。治療時常與抗革蘭氏陽性菌的桿菌肽鋅合用。其含量測定《中國獸藥典》2020 版規(guī)定為生物效價測定方法，但其方法具有操作步驟復雜、檢驗周期長、影響因素多等缺點，隨著獸藥的發(fā)展和檢驗制度的完善，為了滿足生產的需要，提高檢驗效率及檢驗準確度，該文采用高效液相色譜法檢測原理，建立快速、準確的HPLC 測定獸藥硫酸黏菌素的含量檢測方法。

1 主要儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II，硫酸黏菌素標準品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），乙腈（色譜純），無水硫酸鈉（分析純），其余試劑為分析純，硫酸黏菌素原料。10%硫酸黏菌素可溶性粉，10%硫酸黏菌素預混劑均為山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司生產（均已用生物效價法測定含量）。

2 結果分析

2.1 測定方法

C18 鍵合硅膠色譜柱，檢測波長215nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃，進樣量20uL，流動相0.1mol/L 無水硫酸鈉溶液∶乙腈=4 ∶2，用磷酸調酸堿度至pH 為2.4 左右。

溶液的制備 對照品溶液：精密稱定標準品25mg，置50mL 的容量瓶中，加流動相稀釋至相應刻度，搖勻，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的對照品溶液。供試品溶液：精密稱定硫酸黏菌素可溶性粉250mg，置50ml 的容量瓶中，加流動相稀釋至相應刻度，搖勻，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL的硫酸黏菌素可溶性粉溶液。

精密稱定硫酸黏菌素預混劑250mg，置50mL 的容量瓶中，加流動相適量超聲助溶5min，冷卻，定容至刻度，制成含硫酸黏菌素0.5mg/mL 的硫酸黏菌素預混劑溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取硫酸黏菌素對照品溶液，精密量取對照品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

系統(tǒng)適用性要求：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，相鄰峰間的分離度應大于1.5，各峰的拖尾因子不得大于1.5。

系統(tǒng)適用性結果：相鄰峰間的分離度均大于1.5，各峰的拖尾因子小于1.5，見表1。

表1 系統(tǒng)適用性試驗

2.2 分析方法優(yōu)化

通過對流動相、波長、溶劑、進樣量等條件進行選擇，確定最佳試驗條件。

為了考察乙腈對檢測結果的影響，分別選擇流動相為無水硫酸鈉溶液、無水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20、無水硫酸鈉溶液∶乙腈=45 ∶15，無水硫酸鈉溶液均為0.1 mol/L，結果表明，當無水硫酸鈉溶液∶乙腈=40 ∶20 時，色譜圖中各峰的峰形較好，分離度良好；為了考察無水硫酸鈉溶液濃度的影響，固定乙腈的比例，分別比較當磷酸鹽濃度為0.1mol/L 和0.2 mol/L 的檢測結果，發(fā)現0.1mol/L 的無水硫酸鈉溶液時，峰形對稱性好且流動相中含鹽濃度低，對色譜柱壽命影響相對較小，更符合方法學要求。

采用紫外可見光檢測器，對硫酸黏菌素對照品、原料及其制劑溶液在200nm～400nm 波長內進行掃描，評價硫酸黏菌素的紫外吸收行為。測得在215nm 處均有較明顯吸收，故選擇215 nm 為測定波長是合理的。

硫酸黏菌素原料，易溶于水，分別采用水和流動相作為空白溶劑，比較硫酸黏菌素制劑的色譜行為。試驗表明，以水做空白溶劑時，可溶性粉溶解性良好而硫酸黏菌素預混劑溶解性很差，而且出現倒峰，選流動相作為溶劑，不會出現倒峰，對預混劑來說，由于輔料及工藝原因導致溶解性稍差，必須經過5min 超聲處理才能溶解，綜合分析選用流動相作為溶劑。

2.3 方法學考察

精密稱取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑適量進行方法適用性試驗，各樣品含硫酸黏菌素在一個水平，各精密稱定6 份樣品，每份樣品各進2 針，取其峰面積平均值，圖1～圖4 表明對照品、原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑色譜圖中均含有這5 種主要物質，而且這5 種物質在不同時間出峰，分別命名為1～5。硫酸黏菌素原料及制劑中這5 種物質出峰時間和硫酸黏菌素標準品出峰時間保持一致，色譜圖峰形很好。而且拖尾因子均小于1.5，說明所測物質相同，各峰分離度良好，達到完全分離，根據峰面積計算含量結果與《中國獸藥典》2020 版生物等效法測定值一致，見表2 和表3，說明結果穩(wěn)定可靠，影響因素少。

表2 生物效價法測定結果

表3 高效液相色譜法測定結果

圖1 硫酸黏菌素標準品色譜圖

圖2 硫酸黏菌素原料色譜圖

圖3 10%硫酸黏菌素可溶性粉色譜圖

圖4 10%硫酸黏菌素預混劑色譜圖

精密稱取對照品適量，置合適的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成0.5mol/L 的硫酸黏菌素標準品溶液，將其標準品溶液連續(xù)進樣6 針，記錄峰面積值，并計算相對標準偏差。

結果表明相對標準偏差為0.3%，說明精密度良好，數據可靠，儀器狀態(tài)良好。

配制標準濃度為2.0mg/mL 的標準溶液，精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL 置10mL 容量瓶中，配制成濃度為0.2mg/mL～1.8mg/mL 的標準溶液。各取20uL 進樣，記錄色譜圖，橫坐標為樣品濃度，縱坐標為樣品峰面積做線性回歸，濃度在0.3mg/mL～1.6mg/mL 和峰面積呈線性相關，線性回歸方程為=2568425.6（=0.9999）。表明樣品檢測濃度為0.5mg/mL 在線性范圍內。

分別取原料、10%硫酸黏菌素可溶性粉、10%硫酸黏菌素預混劑適量和可溶性粉混合配制成樣品濃度為0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL 的溶液，每個濃度做兩次重復并計算平均回收率。結果表明，當樣品濃度在0.5mg/mL 時，回收率高于98.0%，說明試驗結果穩(wěn)定可靠，方法正確，準確度高，見表4。

表4 回收率試驗結果

通過改變柱溫、流速、檢測波長、流動相pH 值、流動相比例等參數，來評估色譜條件有微小變動時，測定結果不受影響的影響程度。

根據表5，改變色譜條件后，取空白溶液、對照品溶液、原料、可溶性粉以及預混劑進行測定。試驗要求當色譜條件有微小變化后，各峰的分離度大于1.5，含量結果RSD 不得超過2.0%。

表5 耐用性試驗表

在流速、柱溫、流動相比例、流動相pH 及不同色譜柱等色譜條件有微小變動時，分離度均符合要求見表6，各條件下，測得硫酸黏菌素的含量的RSD 值均小于2.0%見表7。表明該方法耐用性良好。

表6 對照品溶液的各峰分離度結果

表7 含量測定方法驗證-耐用性試驗結果

取硫酸黏菌素對照品溶液，采用逐步稀釋的方法，信噪比（/=10）的樣品濃度即為定量限濃度，測定6 次，信噪比（/=3）的溶液濃度即為檢測限。結果定量限溶液的濃度為0.012mg/mL，檢測限溶液的濃度為 3.63μg/mL，6 份定量限溶液峰面積的RSD 為2.53%。

在不同時間，2 位分析員分別用不同儀器配制6 份原料供試品溶液和2 份硫酸黏菌素對照品溶液。取配制溶液各20μL 分別進樣分析，結果表明，2 位分析員6 次測定重復性的RSD 分別為：1.53%、1.32%，不同分析員12 次測定中間精密度的RSD 為1.47%，結果重復性及中間精密度良好。

3 結論

該試驗通過建立高效液相色譜法檢驗硫酸黏菌素的含量，能夠高效測定獸藥硫酸黏菌素及其制劑的含量，方法可靠、穩(wěn)定性好，和生物效價法相比較，縮短了檢驗周期，實現批量檢驗，能夠為獸藥生產質量提供有力的保障。