外泌體及其在肝臟疾病研究中的進(jìn)展

肝臟在人體中具有廣泛的生理功能，外泌體是細(xì)胞間一種重要的交流方式，在正常和疾病條件下，在細(xì)胞間通訊中起著至關(guān)重要的作用。目前已有研究

表明，外來(lái)體介導(dǎo)的RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移與多種肝病有關(guān)。肝細(xì)胞向鄰近肝細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體調(diào)節(jié)肝臟再生和修復(fù)的細(xì)胞?；谀壳暗陌l(fā)現(xiàn)，外泌體在肝臟疾病臨床應(yīng)用潛力巨大，因此，本文將論述外泌體特征、來(lái)源、分離、修飾、肝臟疾病(包括肝癌、肝炎、肝硬化、膽汁性淤積)等相關(guān)方面，以期能更好、更快地應(yīng)用于臨床。

學(xué)生的工程能力培養(yǎng)離不開校內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的構(gòu)建，以專業(yè)建設(shè)需求為指導(dǎo)，以培養(yǎng)學(xué)生掌握軟件技術(shù)技能為目標(biāo)，建設(shè)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)室。在建設(shè)過(guò)程中，除了建設(shè)常規(guī)的校內(nèi)實(shí)驗(yàn)室外，還需要逐步建設(shè)面向企業(yè)場(chǎng)景的軟件工程實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)室、軟件質(zhì)量保證與測(cè)試技術(shù)實(shí)驗(yàn)室、軟件綜合創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室、云計(jì)算應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室等，這些都是軟件人才培養(yǎng)的重要場(chǎng)所。

1 外泌體相關(guān)特征及方式

在生命系統(tǒng)中，細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)進(jìn)行通信，這些細(xì)胞包括主要的凋亡小體、脫落的微囊泡和外泌體

。外泌體目前可利用其大小范圍大多為50～120 nm。它們的生物發(fā)生是由質(zhì)膜的內(nèi)向萌芽，形成囊泡體(multivesicular bodies,MVBs)，MVBs在與溶酶體融合后降解，或與質(zhì)膜融合并形成從細(xì)胞釋放的外泌體

。

外泌體主要由脂質(zhì)雙層及數(shù)百種膜結(jié)合的內(nèi)部蛋白組成，包含內(nèi)體途徑獨(dú)特的表面蛋白包括熱激蛋白(70Hsc70)，熱休克蛋白(HSP90)，跨膜四分子蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82、CD86)，四旋蛋白(TSPAN8、TSPAN6),整合素，免疫球蛋白，表面肽酶(細(xì)胞特異性蛋白質(zhì))和蛋白質(zhì)及RNA，胞質(zhì)蛋白和受體。它們的脂質(zhì)組成不同于其他EV類型，它們富含膽固醇和二?；视?，有著獨(dú)特的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)及廣泛的RNA類。RNA包括DNA、mRNA、miRNA。小分子RNA是外泌體中最廣泛和被深入研究的RNA類型，通常是由于它們與疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)

。

HBV誘導(dǎo)的病毒蛋白和RNA的外泌體可以通過(guò)傳播病毒相關(guān)分子引起進(jìn)一步感染，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，其發(fā)揮的作用上可作為治療性疫苗的嘗試。外泌體可以轉(zhuǎn)運(yùn)抗病毒劑并誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)。這些蛋白與MVBs(包括外泌體)相關(guān)的蛋白AIP1/ALIX和VPS B共定位，可以阻斷包膜HBV病毒顆粒的產(chǎn)生及釋放

。目前由HBV引起相關(guān)性肝病難以完全治愈，由此，闡明HBV復(fù)制的調(diào)節(jié)機(jī)制以制定更有效的HBV治愈策略就顯得非常重要。相關(guān)病毒核酸可以裝載在外泌體中，感染細(xì)胞的外泌體可能具有抗病毒功能，這些外泌體包含病毒相關(guān)RNA和蛋白質(zhì)，這些RNA和蛋白質(zhì)會(huì)觸發(fā)受體細(xì)胞的功能變化，如能靶向這些外泌體，可作為抗病毒治療的潛在工具。

Manca等

報(bào)道了牛奶外泌體的生物利用度和分布，表明牛奶外泌體是可以生物利用的，同時(shí)蓄積在肝臟內(nèi)。其結(jié)果表明牛奶外泌體可能是將藥物遞送至肝臟的極佳載體，識(shí)別牛奶外泌體中的歸巢信號(hào)，以使載有藥物的牛奶外泌體靶向肝臟細(xì)胞以外的細(xì)胞譜系，將外泌體與納米技術(shù)相結(jié)合，提高其靶向的精準(zhǔn)度，在肝臟疾病的治療中有較好的前景，目前乳源性外泌體已成為有效的藥物載體

。

修飾外泌體的開發(fā)在藥物遞送研究中目前來(lái)說(shuō)是有較大的前景，相對(duì)來(lái)說(shuō)，進(jìn)行更多的研究以改善表征過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)化用于藥物遞送系統(tǒng)的衍生外泌體或修飾外泌體的生產(chǎn)也非常重要。近年來(lái)出現(xiàn)了新型雜交外泌體，方法是使用凍融法將其外膜與脂質(zhì)體融合在一起。Sato等

通過(guò)用凍融法將外泌體的膜與脂質(zhì)體融合獲取制備工程雜交外泌體的新方法，這些融合外泌體可用于通過(guò)膜融合方法將外源疏水性脂質(zhì)以及親水性貨物轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞。ADMSCs-Exo是一種小細(xì)胞外膜囊泡，在CCl

誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型和小鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HST)-T6中，包含miR-181-5p的ADMSCs-Exo可通過(guò)抑制STAT3/Bcl-2來(lái)增加自噬并減少TGF-b1誘導(dǎo)的肝纖維化

。由此可見，這種修飾外泌體優(yōu)化了外泌體表面，降低其免疫原性，增加其膠體穩(wěn)定性，并改善外泌體在血液中的半衰期。通過(guò)不斷探索混合型外泌體，作為新型生物納米轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以提高安全及效應(yīng)性。

改進(jìn)階段學(xué)生要進(jìn)行橋模型穩(wěn)定性及承重測(cè)試，小組成員探討改善橋設(shè)計(jì)，建立新的模型并再測(cè)試，通過(guò)循環(huán)反復(fù)的測(cè)試、改進(jìn)，提高學(xué)生的問(wèn)題解決能力及交流合作能力，增強(qiáng)學(xué)習(xí)體驗(yàn)，培養(yǎng)批判能力和創(chuàng)新能力。

巨噬細(xì)胞在人體免疫系統(tǒng)中具有吞噬能力。在預(yù)防許多疾病的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗鼈冏R(shí)別并消除了病原性微生物產(chǎn)物和腫瘤細(xì)胞

，在損傷和修復(fù)中起著重要的調(diào)節(jié)器的作用。Wang等

研究表明，活化的巨噬細(xì)胞分泌富含miR-155的外泌體；調(diào)節(jié)劑含有miR-155模擬物或miR-155的巨噬細(xì)胞外泌體通過(guò)降低Sos1蛋白(編碼鳥苷釋放蛋白)表達(dá)和通過(guò)降低Socs1表達(dá)來(lái)增加成纖維細(xì)胞炎癥來(lái)抑制成纖維細(xì)胞增殖，該發(fā)現(xiàn)可能在肝纖維化、肝硬化領(lǐng)域取得應(yīng)用進(jìn)展。

課外活動(dòng)也是微課教學(xué)最好的資源，通過(guò)深入生活不但能夠激發(fā)學(xué)生寫作欲望，而且能拉近寫作情感。對(duì)于語(yǔ)文作文寫作的難點(diǎn)在于將具體事物展開進(jìn)行分析，這就需要教師通過(guò)微課教學(xué)利用課外資源逐步強(qiáng)化學(xué)生此方面能力。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)來(lái)源的外泌體(尤其是其miRNA)的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞或使其在人體中循環(huán)，因此，MSC外泌體可能會(huì)影響疾病的發(fā)生和發(fā)展

。MSC衍生的外泌體可以通過(guò)高度富集大量具有生物活性的分子，從而很好地維持組織內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡并響應(yīng)外部刺激。另一項(xiàng)研究還表明，MSC衍生的外泌體可以作為調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程的細(xì)胞間通訊載體，類似于衍生自細(xì)胞類型的外來(lái)體，可以與相鄰和偏遠(yuǎn)區(qū)域內(nèi)的多種細(xì)胞類型相互作用以引發(fā)適當(dāng)?shù)募?xì)胞反應(yīng)；它們通過(guò)維持動(dòng)態(tài)和穩(wěn)態(tài)組織微環(huán)境影響MSC的基質(zhì)支持功能。作為基質(zhì)支持細(xì)胞，MSC通過(guò)其分泌的外泌體靶向以恢復(fù)肝臟穩(wěn)態(tài)并使肝細(xì)胞修復(fù)和再生。該結(jié)果提供了MSC和其分泌的外泌體在多種肝病中的治療功效的基本原理，MSC衍生的外泌體可能具有治療肝臟疾病的特性

。

2.1.2 肝纖維化/肝硬化相關(guān)：病毒性肝纖維化和肝硬化是肝癌發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。因此，減慢或停止肝纖維化的進(jìn)展可能會(huì)有利于降低惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。逆轉(zhuǎn)肝纖維化/肝硬化能減少很大比例終末期肝病的發(fā)生。外泌體的生物物理和成分特性，以及它們?cè)谏锪黧w中的存在，使其成為基于血液的液體活檢有吸引力的靶標(biāo)，早期評(píng)估肝纖維化病因至關(guān)重要。HSC轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白，并進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥

，導(dǎo)致與ECM數(shù)量和組成相關(guān)的顯著改變。外泌體介導(dǎo)的HSC激活,是通過(guò)炎癥相關(guān)因子的釋放，激活與ECM重塑相關(guān)的生物標(biāo)志物來(lái)誘導(dǎo)肝纖維化

。肝細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)促進(jìn)修復(fù)和再生來(lái)維持肝臟動(dòng)態(tài)平衡的有益特性，這與源自處于疾病狀態(tài)的應(yīng)激肝細(xì)胞的外泌體作用相反，其作用在于激活受體細(xì)胞中的損傷、炎癥和纖維化反應(yīng)

。MSC、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)、臍帶來(lái)源的MSC(umbilical cord derived MSC，UC-MSC)、人肝干細(xì)胞(human liver stem cells，HLSC)均有研究。Zhu等

通過(guò)CCl

誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，通過(guò)工程改造的ADSC(源自MSC)的有效抗纖維化功能性外泌體中的mmu-circ-0000623選擇性轉(zhuǎn)移到受損的肝細(xì)胞中，通過(guò)激活自噬發(fā)揮抗肝纖維化的作用。對(duì)MSC處理的纖維化動(dòng)物中ECM的基因表達(dá)譜的分析表明，損傷區(qū)域膠原蛋白的沉積較前減少。在通過(guò)注射CCl

和TAA化學(xué)藥物產(chǎn)生的肝纖維化模型中施用MSC時(shí)，前膠原基因表達(dá)顯著降低

。

2 外泌體與肝臟疾病的相關(guān)性

體外臍帶來(lái)源干細(xì)胞修飾體(umbilical cord-derived stem cell exosomes,UC-MSC-EV)給藥通過(guò)抑制SMAD2磷酸化以及減少肝細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，抑制了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)和TGF-β/SMAD信號(hào)通路，UC-MSC的外泌體可改善肝炎和膠原蛋白沉積。特別是，hUC-MSC和衍生外泌體中谷胱甘肽過(guò)氧化酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)的下調(diào)恢復(fù)了hUC-MSC-EV的抗凋亡和抗氧化作用。與成纖維細(xì)胞來(lái)源的外泌體相比，從骨髓MSC獲得的外泌體具有更強(qiáng)的減輕肝臟損傷和改善肝衰竭后器官再生的潛力

。HLSC是一種易于獲得且可擴(kuò)展的源自人成年肝細(xì)胞的干細(xì)胞群體。在小鼠肝纖維化模型中，HLSC-EV通過(guò)減少纖維化和炎癥改善了肝功能和形態(tài)。分子分析顯示，HLSC-EV給藥下調(diào)了大多數(shù)與纖維化相關(guān)的基因，可逆轉(zhuǎn)涉及組織重塑(MMP-1a-8，-13，-14和TIMP-1)和炎癥因子(IFN-γ、IL-1b和TNF-α)的基因表達(dá)。IL-10表達(dá)水平的增加和肝臟中炎性浸潤(rùn)的減少證實(shí)了HLSC-EV的抗炎潛力。其中相關(guān)抗炎蛋白有助于改善肝纖維化

。Wang等

從NK-92MI細(xì)胞中分離出外泌體(NK-Exo)，經(jīng)NK-Exo處理后能有效抑制TGF-1誘導(dǎo)HSC增殖和活化，HSC是ECM的主要來(lái)源，HSC的激活和轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞是肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞事件。來(lái)自HSC的外泌體則參與了肝纖維化的形成，作為靶向治療的天然載體，外泌體可以將治療劑和靶向肽特異性地遞送至HSC，從而實(shí)現(xiàn)肝纖維化的靶向治療

。就目前而言，靶向治療為其中較為熱門的治療相關(guān)探討方式，但其靶標(biāo)的選擇極其重要；例如TGF-β是觸發(fā)HSC活化和存活的最有效的促纖維化細(xì)胞因子，因此靶向這些分子可能是預(yù)防肝纖維化的重要方法。

小學(xué)語(yǔ)文教師在問(wèn)題設(shè)置時(shí)要做好兩方面準(zhǔn)備，既要對(duì)教材內(nèi)容非常熟悉，也要了解學(xué)生的實(shí)際情況。小學(xué)學(xué)生的知識(shí)水平和理解能力是不一樣的，在教學(xué)過(guò)程問(wèn)題的設(shè)置要符合大眾化要求，做好難度調(diào)節(jié)，避免只為尖子生設(shè)置問(wèn)題的教學(xué)方式。

目前已知外泌體大小、來(lái)源等來(lái)自于多方面，頗為廣泛，其分離技術(shù)尚無(wú)更好的突破，而且，大多數(shù)當(dāng)前的分離技術(shù)不能將外泌體與具有相似生物物理特征的脂蛋白和源自非內(nèi)體途徑的EV完全分離，致使外泌體純度降低。因此，如何有效地富集外泌體是當(dāng)前的主要問(wèn)題，為了不同的應(yīng)用目的，選擇了不同的分離方法，其中更常使用超速離心、基于大小的分離技術(shù)、聚合物沉淀、免疫親和捕獲技術(shù)。聲納米過(guò)濾器是一種微流體分離技術(shù)，可以將外泌體與其他EV根據(jù)大小從基質(zhì)中分離出來(lái)

，UC是目前使用最廣泛的分離技術(shù)，也被稱為外泌體提取和分離的金標(biāo)準(zhǔn)

。由于其耗時(shí)、成本高、結(jié)構(gòu)損壞、聚集成塊以及脂蛋白共同分離，因此不利于下游分析。通過(guò)免疫親和層析獲得的外泌體的儲(chǔ)存條件相對(duì)苛刻，并且不適合大規(guī)模分離外泌體。其余幾種分離機(jī)制均分別有其還需要優(yōu)化和改進(jìn)外泌體的負(fù)載能力和增強(qiáng)靶向的方法。諸如排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)類的方法可能部分滿足，它可以去除大部分的“污染”血漿或培養(yǎng)基成分

。Han等

通過(guò)構(gòu)建了一種新的微渦旋芯片，該芯片通過(guò)將脂質(zhì)納米探針修飾的Morpho Menelaus(M.Menelaus)(大閃蝶曼紐拉斯)蝶形翼集成到微流控芯片中進(jìn)行有效地分離和純化EV。EV與M.Menelaus機(jī)翼之間的相互作用力在生物流體通過(guò)時(shí)會(huì)大大增加，基于此特性，EV的高通量富集成為可能，其隔離效率已超過(guò)70%。與此同時(shí)，該芯片系統(tǒng)經(jīng)測(cè)試，能夠?qū)V中的RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行下游生物學(xué)分析，其應(yīng)用價(jià)值巨大。

自動(dòng)裝配螺絲機(jī)如圖1所示，工作臺(tái)是由1臺(tái)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)可沿著X軸運(yùn)動(dòng)，電動(dòng)螺絲刀安裝在由另1臺(tái)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)可沿著Y軸運(yùn)動(dòng)，通過(guò)2臺(tái)步進(jìn)電機(jī)的配合可實(shí)現(xiàn)X軸及Y軸一定行程內(nèi)的自由定位，從而將待安裝螺絲的螺孔移動(dòng)到電動(dòng)螺絲刀的正下方。

取消高速公路省界收費(fèi)站后，車輛通行高速公路是否一定要安裝使用ETC?對(duì)此，司家軍表示，未安裝ETC車輛通過(guò)在高速公路入口領(lǐng)取卡、出口還卡交費(fèi)的方式通行，但安裝使用ETC的車輛全程無(wú)需停車，即可完成交費(fèi)，通行效率更高，也有利于促進(jìn)節(jié)能減排。因此，從方便快捷、節(jié)能環(huán)保等角度來(lái)看，安裝使用ETC快速通行高速公路是一種更方便更快捷的方式。山東省為鼓勵(lì)安裝使用ETC，出臺(tái)了相關(guān)的優(yōu)惠政策，比如使用ETC享受通行費(fèi)95折優(yōu)惠等。

2.1.1 肝炎病毒相關(guān)：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種包膜的DNA病毒，帶有病毒及缺乏核心的亞病毒形式的顆粒，是具有強(qiáng)致癌潛力的嗜肝細(xì)胞病毒

。由于病毒-宿主免疫相互作用而導(dǎo)致的持續(xù)性肝壞死炎癥被認(rèn)為是肝硬化、肝癌發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)力，持續(xù)的免疫反應(yīng)會(huì)在肝臟內(nèi)產(chǎn)生炎性微環(huán)境，有利于肝纖維化、肝硬化和原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)轉(zhuǎn)化的發(fā)展。Sukriti等

通過(guò)差速離心從慢性HBV感染患者的血清中分離的外泌體中發(fā)現(xiàn)了DNA和蛋白質(zhì)，這些含有HBV-DNA的外泌體被人肝癌細(xì)胞(HepG2)吸收，導(dǎo)致可檢測(cè)到的HBV-DNA水平及肝細(xì)胞中HBsAg和HBcAg的表達(dá)不夠敏感，這提示了潛在的機(jī)制病毒傳播，其中還存在著外泌體充當(dāng)傳染性病毒顆粒與免疫系統(tǒng)之間的物理屏障，從而使病毒在慢性患者中得以持久。在感染的急性期，外泌體可能會(huì)充當(dāng)HBV成分的庇護(hù)所，在這種情況下，病毒特異性抗體或免疫細(xì)胞很難具有識(shí)別性。雖然最初的先天免疫反應(yīng)為抵御HBV等入侵病毒提供了第一道防線，但其清除病毒的能力有限

。HBV相關(guān)的外泌體研究表明，外泌體包含HBV成分，包括HBV-DNA、HBV-RNA、HBV蛋白，甚至HBV-miR-3。因此，HBV可能進(jìn)入MVBs，并通過(guò)外泌體依賴的途徑傳遞。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明HBV相關(guān)外泌體可以將包括HBV-DNA在內(nèi)的HBV成分轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞

。慢性HBV感染中T細(xì)胞的消耗和失活可能是HBV相關(guān)外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞增加程序性死亡受體1(programmed death receptor1,PD-1)表達(dá)所致。在慢性感染中持續(xù)的抗原刺激會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，這包括病毒特異性效應(yīng)T細(xì)胞的喪失和抑制分子如PD-1的表達(dá)增加，HCV E2糖蛋白抑制NK細(xì)胞的非特異性細(xì)胞毒性功能，使HCV在受影響的患者中持續(xù)存在，與HBV感染一樣，慢性HCV感染中持續(xù)的肝壞死性炎癥會(huì)形成有利于肝硬化和惡性腫瘤發(fā)展的微環(huán)境

。

2.1.3 肝癌相關(guān)性：PLC目前在惡性腫瘤中發(fā)病率較高，死亡率居高不下，目前治療手段有限，復(fù)發(fā)率較高。外來(lái)體通過(guò)運(yùn)送包括RNA和蛋白質(zhì)在內(nèi)而參與腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及耐藥。有研究顯示，外泌體在液體診斷中顯示出高靈敏度、特異度和穩(wěn)定性的優(yōu)越性，其包含的RNA和蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生和腫瘤中起著關(guān)鍵作用

。外泌體RNA通過(guò)刺激免疫激活以及逃避免疫，促進(jìn)病毒擴(kuò)散和炎癥，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之間交換致癌因子，通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的關(guān)系，維持相鄰基質(zhì)細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，并在遷移和侵襲中起至關(guān)重要的作用

。研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-10038在高度轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)細(xì)胞及其分泌的外泌體中均高表達(dá)，通過(guò)在體外體內(nèi)試驗(yàn)，外泌體circRNA-10038通過(guò)影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的增殖、血管生成等調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，表明circRNA-10038可能通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成而影響促血管生成活性

。Lou等

通過(guò)研究經(jīng)脂肪組織衍生的MSC(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AMSC)，miR-199a修飾構(gòu)建外來(lái)體AMSC-Exo-199a通過(guò)靶向mTOR途徑介導(dǎo)miR-199a顯著增加HCC細(xì)胞的化學(xué)敏感性，提高阿霉素(Dox)傳遞效率至HCC細(xì)胞，在體內(nèi)發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞的治療作用。TME具有獨(dú)特的功能

，考慮到TME在化學(xué)耐藥性方面已受到臨床癌癥研究人員的廣泛關(guān)注。腫瘤源性外泌體(tumor-derived exosomes,TEX)在腫瘤血管生成中起重要作用，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。TEX攜帶與血管生成相關(guān)的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移RNA、miRNA和蛋白質(zhì)，可能有助于血管的形成或生長(zhǎng)，而這種現(xiàn)象是腫瘤擴(kuò)散的前兆。TEX成為癌癥中血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物，并且是抗血管生成療法的潛在靶標(biāo)

。TEX可吸收相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸等增強(qiáng)代謝，打破其脂質(zhì)平衡性，以滿足其增加的代謝需求。外泌體分泌環(huán)境可以改變?cè)l(fā)性腫瘤的微環(huán)境，同時(shí)助力腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

。目前PLC診療指南

中姑息療法中一線靶向藥物因其不良反應(yīng)及各方面帶來(lái)的壓力仍然較大，系統(tǒng)治療效果不盡如人意。外來(lái)體能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。克服肝癌對(duì)化療的耐藥是一個(gè)較大的挑戰(zhàn)，但有研究

發(fā)現(xiàn)，源自HCC細(xì)胞的外泌體可以增強(qiáng)體外肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥性。AMSC衍生的外來(lái)體是miR-122的有效載體，可增加HCC的化學(xué)敏感性，這些結(jié)果可以用來(lái)探討治療的有效性及針對(duì)性。

NAFLD是全世界最常見的肝病病因。最近建議使用術(shù)語(yǔ)代謝功能障礙相關(guān)性脂肪肝疾病(metabolic dysfunction-related fatty liver disease，MAFLD)代替NAFLD。目前，其進(jìn)展至肝硬化和相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率已經(jīng)較前有所提高。外泌體在NAFLD的發(fā)病機(jī)理和發(fā)展中均發(fā)揮作用，引發(fā)炎癥和纖維化的發(fā)展是從孤立的脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)的關(guān)鍵。來(lái)自不同飲食誘發(fā)的NASH動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)表明，外泌體濃度隨疾病進(jìn)展呈時(shí)間依賴性增加。這似乎是對(duì)肝臟中有毒脂質(zhì)及其下游介質(zhì)的積累的一種反應(yīng)，它們?cè)黾恿烁渭?xì)胞形成和釋放不同類型外泌體的能力

。脂質(zhì)毒性和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在NASH的發(fā)病機(jī)理中起關(guān)鍵作用，Gu等

通過(guò)建立高脂肪飲食(high fat diet，HFD)以及蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine and choline deficiency，MCD)飲食引起的NASH動(dòng)物模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明了脂肪細(xì)胞分泌外泌體(adipocytes secretexosome，ATEx)會(huì)引起肝脂肪變性，醛糖酮還原酶1B7(aldose ketone reductase1B7,Akr1B7)是肝脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵介質(zhì)，參與了ATEx介導(dǎo)的NASH誘導(dǎo)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分泌的ATEx通過(guò)向肝細(xì)胞中傳遞外泌體AKR1B7并提高其甘油水平來(lái)觸發(fā)NASH。證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的ATEx可以調(diào)節(jié)肝臟中的脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)。代謝靶標(biāo)可用于治療NASH，目的是減少代謝底物向肝臟的輸送或促進(jìn)其安全處置。飲食和生活方式改變引起的體質(zhì)量減輕會(huì)降低代謝底物向肝臟的傳遞，并可改善NASH的所有特征，包括肝纖維化，提供減輕NASH代謝驅(qū)動(dòng)因素的概念證據(jù)應(yīng)該是一種有效的治療方法。研究

表明，HLSC衍生的外泌體已被用于治療飲食引起的脂肪性肝炎的小鼠，HLSC-EV治療可顯著下調(diào) NASH小鼠的肝纖維化和促炎基因表達(dá)，并改善組織學(xué)異常。HLSC-EV的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，其中包含各種抗炎蛋白，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了可以外泌體用于NAFLD/NASH治療的概念，其臨床應(yīng)用潛力較大。

肝臟作為代謝工廠，目前大多數(shù)藥物經(jīng)肝臟代謝，DILI仍然是最常見的急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)原因之一。目前提出

用于診斷DILI的主要生物標(biāo)志物是蛋白質(zhì)衍生的乙酰-半胱氨酸。谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GLDH)是大多數(shù)真核細(xì)胞線粒體基質(zhì)中存在的一種酶，它在肝組織中的表達(dá)最高，并且集中在肝臟的小葉區(qū)域，目前也可以用于診斷DILI的一個(gè)小指標(biāo)。當(dāng)然，隨診醫(yī)學(xué)進(jìn)步，許多循環(huán)和遺傳生物標(biāo)志物均有望在DILI中使用，miRNA是最有前途的DILI生物標(biāo)志物之一，特別是miR-122的早期識(shí)別更有用。

在肝臟受損的情況下，肝細(xì)胞的外泌體包含更多的精氨酸酶，可以通過(guò)血流系統(tǒng)地傳播這些精氨酸酶，從而促進(jìn)旁分泌和長(zhǎng)距離作用，其中外泌體蛋白身份和組織特異性起源的獨(dú)特蛋白可作為其生物標(biāo)志物?？寡趸瘎㎞-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)或谷胱甘肽(glutathione，GSH)進(jìn)行的治療不僅可以阻斷對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)介導(dǎo)的肝損傷，而且還可以防止外泌體肝特異性蛋白升高，這表明氧化應(yīng)激的增加可能在促進(jìn)肝損傷和分泌中發(fā)揮作用

。miR-223可能通過(guò)減輕中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在預(yù)防APAP誘導(dǎo)的肝損傷中起關(guān)鍵作用。miR-223的缺失顯著加劇了APAP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氧化/硝化應(yīng)激和肝毒性，而miR-223的過(guò)度表達(dá)則減輕了肝損傷

。從機(jī)制上講，通過(guò)增強(qiáng)miR-223啟動(dòng)子上的NF-κB通路結(jié)合，激活Toll樣受體9(Toll like receptor 9，TLR9)會(huì)上調(diào)miR-223，而miR-223通過(guò)靶向IκB激酶α表達(dá)來(lái)減輕TLR9/NF-κB介導(dǎo)的炎癥。由此可見，外泌體源性miR-223的上調(diào)在終止急性中性粒細(xì)胞反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，并且可能是治療DILI誘發(fā)的肝衰竭的相關(guān)靶點(diǎn)。

原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)和原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)作為目前膽汁淤積性相關(guān)方面肝病。盡管進(jìn)行了廣泛的研究，PSC和PBC的發(fā)病機(jī)制仍然不夠明確，解決方案也較為單一。膽汁流量受損和膽汁酸代謝紊亂是主要的膽管病的相關(guān)因素，膽管細(xì)胞是膽汁淤積性肝病發(fā)病機(jī)理中的主要靶標(biāo)，膽道阻塞和異常膽汁形成導(dǎo)致膽汁酸積聚，從而引起進(jìn)行性膽管破壞和肝炎癥，并進(jìn)一步導(dǎo)致纖維化，最終可導(dǎo)致肝衰竭

。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long chain noncoding RNA，lncRNA)H19是膽管細(xì)胞衍生的外泌體，可促進(jìn)膽汁淤積性肝損傷

。H19主要在膽管細(xì)胞中表達(dá)，在膽管細(xì)胞中，?；悄懰?taurocholic acid,TCA)鞘氨醇-1-磷酸受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,SIPR2)和E2誘導(dǎo)的ERK1/2激活上調(diào)H19表達(dá)水平并促進(jìn)攜帶H19的外泌體釋放，傳遞給肝細(xì)胞直接或通過(guò)循環(huán)

。牛磺膽酸鹽(taurocholate，TCA)和雌激素均顯著激活ERK1/2信號(hào)通路并誘導(dǎo)膽管細(xì)胞中H19表達(dá)降低，不僅顯著降低了TCA/雌激素誘導(dǎo)的膽管細(xì)胞纖維化基因和S1PR2的表達(dá)，而且顯著降低了雌性Mdr2小鼠的膽汁淤積性損傷

。此外，在小鼠膽汁淤積性肝損傷模型和肝硬化患者中，血清外泌體的H19水平與膽汁淤積性肝損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)。重要的是，攜帶含有H19纖維化Mdr2小鼠血清外泌體的移植顯著減輕了Mdr2小鼠的肝纖維化。H19是膽管細(xì)胞源性外泌體中促進(jìn)膽汁淤積性肝損傷的關(guān)鍵分子。綜上，攜帶H19的外泌體不僅可以用作新型的非侵入性生物標(biāo)記，而且還代表了膽汁淤積性肝病的潛在治療靶標(biāo)。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體作為肝臟內(nèi)細(xì)胞間通訊的重要物質(zhì)，具有肝病的新型診斷和預(yù)后分子生物標(biāo)志物及新型治療方式的巨大潛力。外泌體的生物物理和成分特性，以及它們?cè)谏锪黧w中的存在，在病理?xiàng)l件下，外泌體中包裹的核酸和蛋白質(zhì)的水平會(huì)發(fā)生變化，使其成為基于血液的液體活檢有吸引力的靶標(biāo)，甚至可以減少或替代更具侵入性和風(fēng)險(xiǎn)的程序。尤其是作為肝病領(lǐng)域中肝癌相關(guān)性疾病，早期診斷尤其重要，如能真正發(fā)掘其外泌體液體診斷方面的優(yōu)勢(shì)，勢(shì)必能夠提高肝癌的診斷率和治療率。外泌體在病毒性方面可以轉(zhuǎn)運(yùn)抗病毒劑并誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，外來(lái)體在HBV感染過(guò)程中可能起限制作用，因此其適用于開放靶向肝臟內(nèi)病毒的治療性疫苗。盡管已取得了重大進(jìn)展，但仍然存在許多問(wèn)題。關(guān)于外泌體生物釋放、分離、靶向及與肝內(nèi)各靶細(xì)胞相互作用的精確分子機(jī)制知之甚少。植物源性及動(dòng)物源性衍生的外泌體與肝細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體之間的聯(lián)系是否相排斥，是否在肝臟細(xì)胞中存在有其他特定功能，均有待進(jìn)一步闡明。關(guān)于理想的藥物靶向系統(tǒng)及目前興起的納米治療系統(tǒng)均必須確保其無(wú)毒和無(wú)免疫原性，并且在體外和體內(nèi)也無(wú)不良反應(yīng)，不能增加其人體負(fù)擔(dān)，目前在該方面仍需進(jìn)一步研究開發(fā)，同時(shí)關(guān)于外泌體源選擇的問(wèn)題，目前研究除了人體干細(xì)胞源性外泌體較多以外，應(yīng)加大植物源性外泌體對(duì)肝臟類疾病的效益研究，植物源性不涉及倫理，且相對(duì)安全、產(chǎn)量可觀。目前外泌體調(diào)控肝臟疾病的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，還存在較多未開發(fā)及需闡明的問(wèn)題。基于目前研究，臨床應(yīng)用尚未鋪開，外泌體在肝臟疾病發(fā)展空間巨大，該領(lǐng)域的不斷研究和探索均能夠在慢性肝臟疾病的預(yù)防、診斷、治療提供新的方法和策略。

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