不同支持物及培養(yǎng)條件對幽門螺桿菌生物膜形成的影響

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，

)是一種螺旋狀、微嗜氧、革蘭氏陰性桿菌，具有鞭毛，主要寄生于人體胃內(nèi)

。

可導(dǎo)致急、慢性胃炎，消化性潰瘍，胃癌等多種消化道疾病，并且與多種胃外疾病相關(guān)。

感染了世界50%以上的人口

，我國成人中

感染率為40%～60%

。

胃炎京都全球共識

中指出，

陽性患者個體是傳播的主要宿主，

感染者無制衡因素，均應(yīng)該根除

。

對抗生素耐藥是導(dǎo)致根除治療失敗的主要原因，而生物膜結(jié)構(gòu)的形成是

獲得非特異性耐藥重要原因

。2006年，Carron等

在內(nèi)鏡及掃描電子顯微鏡第一次報道在人類的胃黏膜上可以形成

生物膜。

形成生物膜后比浮游細菌具有更強的生存優(yōu)勢，能夠逃脫人體的免疫系統(tǒng)，且由于其物理屏障，導(dǎo)致抗生素?zé)o法穿透生物膜結(jié)構(gòu)，從而保護膜內(nèi)細菌。且生物膜內(nèi)細菌可能由于其營養(yǎng)條件差，增加其突變的可能

。

生物膜內(nèi)的細菌對抗生素的耐受作用與浮游狀態(tài)相比高達1 000倍

。因此，干預(yù)

生物膜的行程成為解決其對抗生素耐藥的出路之一。由于

在胃內(nèi)多為局灶分布，且動物實驗個體較小，定植數(shù)量少難以評價其生物膜形態(tài)，因而體外環(huán)境下生物膜模型的建立更有利于實驗工作的開展。本研究通過觀察不同培養(yǎng)方式、不同載體條件下

生物膜形態(tài)，以探討更適宜的生物膜體外模型建立方法，為解決臨床

耐藥提供實驗方法。

從表13的“假設(shè)方差相等”行讀取數(shù)值，t值是8.9590，Sig.(雙側(cè))是雙尾T檢驗的顯著性概率0.0001，遠小于0.05?？梢缘贸鼋Y(jié)論：高低側(cè)裂縫嚴重程度有顯著差異，表現(xiàn)為較低一側(cè)的裂縫面積大于較高一側(cè)，究其原因，主要是由于向心力，較低一側(cè)的路面所受的荷載作用力更大，路面某點的荷載作用持續(xù)時間相對更長(車輛通過彎道的時間一定，而較低側(cè)的路程更短)，而瀝青混合料是一種黏彈性材料，在持續(xù)荷載作用下易產(chǎn)生塑性變形，久而久之產(chǎn)生裂縫。

1 材料與方法

1.1.1 菌株：

SS1菌株由北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科提供，-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑：哥倫比亞血瓊脂(英國OXOID公司)，腦心脊液(英國OXOID公司)，脫纖維羊血(北京寶特英昊科技有限公司)，布魯氏肉湯(美國BD Difco/BBL公司)，胎牛血清(FBS)(以色列BI公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(以色列BI公司)，4%戊二醛固定液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇(生工生物工程股份有限公司，上海)，氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)，0.2 μm硝酸纖維素膜(NC膜)(美國通用醫(yī)療公司，GE)；甘油(北京索萊寶科技有限公司)，直徑15 mm的圓形玻片(無錫耐思生物科技有限公司，NEST)。

圖1～2中

SS1為液體培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，形態(tài)：

SS1成膜形態(tài)更為立體，可清晰地看到其鞭毛結(jié)構(gòu)，但其密度較差，生長狀態(tài)一般；成膜率：液體培養(yǎng)過程中，由于生物膜多分布于氣液平面，體外培養(yǎng)時，其成膜率較低。

1.1.3 儀器：壓力蒸汽消毒柜(中國上海博訊實業(yè)有限公司)，潔凈工作臺(中國上海博訊實業(yè)有限公司)，厭氧罐2.5 L(英國OXOID公司)，隔水式培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，10 μl接種環(huán)(山東巴羅克生物科技股份有限公司)，1 μl接種環(huán)(北京普利智誠生物技術(shù)有限公司)，細菌濁度儀(麥氏濁度計)(北京中慧天成科技有限公司)，JSM-7900F熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本捷歐路公司)。

1.2.1 菌株復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存：將

SS1凍存管解凍后取100 μl，使用L棒將菌液均勻涂抹于含質(zhì)量濃度為80 g/L脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基上，于37 ℃微需氧環(huán)境下(15% CO

、5% O

、80% NO

)培養(yǎng)72 h，陽性者繼續(xù)傳代培養(yǎng)；將復(fù)蘇陽性的

SS1使用無菌接種環(huán)傳至固體培養(yǎng)基上，于上述環(huán)境中培養(yǎng)48～72 h；將生長狀態(tài)良好的

SS1 2～4代使用無菌接種環(huán)研磨至凍存液，-80 ℃保存。

1.2.2 構(gòu)建

生物膜：(1)液體培養(yǎng)及玻片載體：以圓形玻片為載體，將無菌直徑15 mm的圓形玻片置于24孔板中，每孔中以500 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的布魯氏肉湯作為培養(yǎng)基，加入5 μl預(yù)培養(yǎng)的濃度為3×10

cfu/ml的

SS1，24孔板于37 ℃、5% O

、10% CO

、85% N

微需氧環(huán)境中振蕩培養(yǎng)72 h。(2)固體培養(yǎng)及NC膜載體：以NC膜為載體，將約(1×1) cm

無菌NC膜上置于含質(zhì)量濃度為80 g/L脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基上，將10 μl預(yù)培養(yǎng)的濃度為3×10

cfu/ml

SS1均勻涂抹至NC膜上，將瓊脂平板置于37 ℃、5% O

、10% CO

、85% N

的微氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h。

2016年4月，習(xí)近平總書記提出：人類是勞動創(chuàng)造的，社會是勞動創(chuàng)造的，勞動沒有高低貴賤之分。但同樣的勞動者在退休后，退休待遇卻相差甚遠，有調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：同樣為30年工齡公務(wù)員平均退休工資7000元左右，而同一地區(qū)的同樣工齡的企業(yè)人員退休工資2600元左右，退休工資懸殊巨大。有研究指出，我國公務(wù)員養(yǎng)老金替代率高達80%～100%，而企業(yè)員工的養(yǎng)老金替代率為僅為40%左右。

1.2.3 掃描電鏡：采用掃描電子顯微鏡觀察

SS1生物膜模型。樣本以無菌PBS沖洗3次后置于4 ℃、2.5%戊二醛中固定2 h，再次使用無菌PBS輕輕沖洗3次。玻片載體的生物膜采用乙醇梯度脫水處理(25%、50%、75%、95%、100%)，NC膜載體的生物膜采用空氣干燥的方法，樣本干燥后，噴金，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

講評時，我采用“兵教兵”與“師教兵”相結(jié)合的方式，對于錯誤率低的題目，由平臺隨機挑選答對的學(xué)生進行講評，而對于錯誤率高的題目，由我講評，進行究因和糾錯。講評完后，我再推送“預(yù)習(xí)檢測”答案解析，讓學(xué)生深化理解，對于仍不明白的學(xué)生可在“提問區(qū)”進行提問，課后對提問的學(xué)生再給予指導(dǎo)。

2017年6月26日，蘇州某地鐵線路部分列車在ATO模式下，出現(xiàn)司機界面顯示時間不正確，以及在站臺停站時間過短的現(xiàn)象。

圖3～4中

SS1為固體培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，形態(tài)：

SS1形態(tài)較扁平，但生長狀態(tài)良好，同樣可見其鞭毛結(jié)構(gòu)；成膜率：固體培養(yǎng)過程中，由于

直接接種于NC膜上，生物膜形成于NC膜上，其成膜率較高。

3 討論

生物膜是一種由存活及凋亡的細菌組成的基質(zhì)結(jié)構(gòu)，覆蓋細菌外的聚合物質(zhì)有多糖、脂類、核酸和蛋白質(zhì)等

。細菌生物膜形成包括以下5個環(huán)節(jié)

：(1)細菌在鞭毛運動下附著、到達表面并粘附；(2)形成覆蓋細菌外的聚合物質(zhì)(多糖、脂類、核酸和蛋白質(zhì))；(3)形成早期生物膜結(jié)構(gòu)；(4)形成成熟的生物膜結(jié)構(gòu)；(5)單個細菌從生物膜脫離，處于浮游狀態(tài)，擴散。細菌生物膜結(jié)構(gòu)的形成會導(dǎo)致臨床多種疾病，主要分為以下3種類型

：(1)植入式醫(yī)療器械相關(guān)生物膜疾病，如留置導(dǎo)尿管引發(fā)尿路感染等；(2)體內(nèi)慢性生物膜疾病，如

感染；(3)細菌形成生物膜導(dǎo)致植入醫(yī)療器械發(fā)生故障，如假體關(guān)節(jié)失效等。細菌形成生物膜后，大大增加患者的死亡率、發(fā)病率，并導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失。在臨床診療中，抗生素治療通過殺死體內(nèi)的浮游細菌控制感染，但往往不能根除體內(nèi)的生物膜細菌

。當(dāng)抗菌治療停止時，生物膜內(nèi)細菌常常再次引發(fā)感染導(dǎo)致治療失敗。體外構(gòu)建

生物膜模型利于進一步研究臨床藥物對

生物膜結(jié)構(gòu)的破壞作用，從而指導(dǎo)臨床用藥，降低臨床抗生素的耐藥率，減輕患者負擔(dān)。

本研究通過液體、固體培養(yǎng)的方法，以圓形玻片、NC膜為載體，詳細介紹了

體外造模方法，并從形態(tài)及成膜率兩方面介紹區(qū)別。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定培養(yǎng)時選用NC膜為載體，成膜率遠遠高于液體培養(yǎng)時以圓形玻片為載體，因此，實驗中無特殊要求時更推薦固體培養(yǎng)。但在操作過程中要注意以下幾點：(1)圓形玻片、NC膜要注意滅菌后使用；(2)NC膜置于含質(zhì)量濃度為80 g/L脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基上時，培養(yǎng)基應(yīng)未冷卻凝固，保證NC膜可吸收含質(zhì)量濃度為80 g/L脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂液體；(3)PBS沖洗培育成功的生物膜時要輕輕沖洗，以防沖毀生物膜，導(dǎo)致實驗失??；(4)接種的菌液濃度為3×10

cfu/ml，不可過濃，否則

營養(yǎng)不足導(dǎo)致生長狀態(tài)差；(5)NC膜載體的生物膜采用空氣干燥的方法，不可使用乙醇梯度脫水的方法，NC膜置于乙醇中會發(fā)生皺縮，導(dǎo)致樣本被破壞。本文通過介紹不同支持物及條件下

生物膜造模方法，為體外研究

生物膜提供方法依據(jù)。

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